Name: super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons
Uploaded: 2020-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Edoardo Micotti for konstruktiv kritik af manuskriptet. Denne undersøgelse blev støttet af BrightFocus A2019296F, af Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), af Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) og af Marie Skłwska-Curie Innovative Training Network (JK).

1. Primære kulturer
<ol><li>Kultur mus hippocampal primære neuroner i chambered coverslips (såsom Ibidi μ-Slide 8 Nå eller Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass), der matcher det objektive krav til #1,5 (0,17 mm) coverslip tykkelse.</li>
	<li>Belagte dæksler med 100 μL poly-L-lysin (100 μg/ml).</li>
	<li>Den næste dag vaskes de dekoreree dækslip to gange med sterilt fosfat-bufferet saltvand (PBS).</li>
	<li>For at opnå mus primære neuroner, isolere hippocampi fra P1-P4 hvalpe23.</li>
	<l...

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).</li><li>Choquet, D., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+Synapse.">The Dynamic Synapse.</a> Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Aspects+of+CNS+Synapse+Formation.">Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).</li><li>Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Classes+of+Secreted+Synaptic+Organizers+in+the+Central+Nervous+System.">Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System.</a> Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist.">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).</li><li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses.">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).</li><li>Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+the+Inhibitory+Synapse+Organization+Using+Superresolution+Microscopy.">Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).</li><li>Yang, X., Specht, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+Domains+in+Super-Resolution+Microscopy:+The+Treachery+of+Images.">Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).</li><li>Monro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+diffraction+limit.">Beyond the diffraction limit.</a> Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).</li><li>Won, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+super-resolution.">Eyes on super-resolution.</a> Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination.">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathy:+dysfunction+of+synaptic+function.">Synaptopathy: dysfunction of synaptic function.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).</li><li>Tyebji, S., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathic+mechanisms+of+neurodegeneration+and+dementia:+Insights+from+Huntington's+disease.">Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease.</a> Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).</li><li>Won, H., Mah, W., Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorder+causes,+mechanisms,+and+treatments:+focus+on+neuronal+synapses.">Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+State+of+Synapses+in+Fragile+X+Syndrome.">The State of Synapses in Fragile X Syndrome.</a> The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).</li><li>Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+major+synaptic+signaling+pathways+involved+in+intellectual+disability.">Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability.</a> Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).</li><li>Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+dysfunction+in+prion+diseases:+a+trafficking+problem.">Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem.</a> International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).</li><li>Colnaghi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super+Resolution+Microscopy+of+SUMO+Proteins+in+Neurons.">Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., M&#246;nkem&#246;ller, V., Hennig, S., H&#252;bner, W., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-source+image+reconstruction+of+super-resolution+structured+illumination+microscopy+data+in+ImageJ.">Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ.</a> Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy.">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).</li><li>Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+microscopy:+artefact+analysis+and+reduction+utilizing+a+parameter+optimization+approach.">Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach.</a> Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).</li><li>Culley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoJ-SQUIRREL:+quantitative+mapping+and+minimisation+of+super-resolution+optical+imaging+artefacts.">NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts.</a> Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+co-localization+of+objects+in+dual-colour+confocal+images.">Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images.</a> Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander&#8217;s+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander&#8217;s overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li><li>Bolte, S., Cordeli&#232;res, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>Bae, J. R., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+neurodegenerative+diseases.">Synapses in neurodegenerative diseases.</a> BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).</li><li>Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+Approaches+for+Live+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging.</a> Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Karras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+optimization+of+reconstruction+parameters+in+structured+illumination+microscopy+-+A+practical+guide.">Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide.</a> Optics Communications. 436, 69-75 (2019).</li><li>Bereczki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+markers+of+cognitive+decline+in+neurodegenerative+diseases:+a+proteomic+approach.">Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach.</a> Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).</li><li>Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Changes+in+Synaptic+Markers+as+a+Function+of+Sleep+and+Wakefulness+in+Drosophila.">Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila.</a> Science. 324 (5923), 109-112 (2009).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander's+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li></ol>

Belysning af synapsens struktur og sammensætning er afgørende for at forstå de fysiologiske og patologiske processer, der regulerer hukommelse og kognition. Mens der i den normale tilstand, synapser er byggestenene i hukommelsen, de også ligger til grund for komplekse neurologiske lidelser såsom Alzheimers sygdom32. Den protokol, der er beskrevet her tjener til at studere co-lokalisering af neuronal proteiner med en super-opløsning mikroskopi teknik kaldet SIM. Ved hjælp af et bestemt belys...

Synapsens forståelse og synsbillede har ændret sig enormt siden den første beskrivelse af Foster og Sherrington i 18971. Siden da er vores viden om neuronal kommunikation og de molekylære processer bag den vokset eksponentielt2. Det er blevet klart, at synapser kan opfattes som et system med to rum: et præsynaptisk rum, der indeholder vesikler til frigivelse af neurotransmittere og et postsynaptisk rum med receptorer3. Denne forsimplede opfattelse, i de sidste tyve år, har udviklet sig til et komplekst netværk af de proteiner, der kræves for at transduce sender binding til signalering4.
Gevinsterne i forståelsen skyldes delvis super-opløsningteknikker,der overvandt diffraktion grænse konventionelle lys mikroskopi, der passer til dimensionen af synapserbedre 5,6,7,8,9,10. På grund af diffraktionsgrænsen kan et optisk mikroskop ikke nå en opløsning over 200 nm sideomside 11,12. For at omgå denne grænse blev der udviklet superopløsningsteknikker ved hjælp af forskellige tilgange og opnåelse af forskellige subdiffraktionsgrænseopløsninger: SIM, STED (Stimuleret emissionsudtømning Mikroskopi), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) og STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM fordobler den rumlige opløsning af laserbaserede mikroskopisystemer med brede felter ved at indsætte en diffraktionsrist i excitationsstrålens sti15. Den bevægelige rist diffracts laserstråler til at skabe en kendt belysning mønster, normalt striber. Dette bevidst strukturerede lysmønster er overlejret til den ukendte rumlige fordeling af fluorescerende farvestof (af prøven). Interferens frynser dannet af de to mønstre indkode for ellers skelnes fine detaljer med normal wide-field mikroskopi. Det endelige super-løst billede opnås ved at kombinere og afkodning med matematiske metoder flere rå billeder af den samme prøve opnået ved oversættelser og rotationer af diffraktion rist. Opløsningen af de super-løste billeder når 100 nm i side- og 500 nm i aksiale retninger for 2D-SIM15 eller 100 nm i side- og 250 nm i aksiale retninger for 3D-SIM16.
Den nye forståelse af synapsen er endnu vigtigere i lyset af de mange neurologiske lidelser, hvor synaptisk dysfunktion spiller en stor rolle i debut og progression17,18. Alzheimers sygdom, Downs syndrom, Parkinsons sygdom, prionsygdomme, epilepsi, autisme spektrum lidelser og skrøbelige X syndrom blandt andre har været forbundet med abnormiteter i synaptisk sammensætning, morfologi ogfunktion 19,,20,21,22.
For nylig, ved hjælp af et sæt af SUMO-specifikke antistoffer, vi brugte SIM til at vise co-lokalisering i primære hippocampal neuroner af SUMO proteiner med præ- og post-synaptic markører synaptophysin og PSD95 på super-opløsning niveau23. Dette gjorde det muligt for os at bekræfte biokemiske og konfokale mikroskopi beviser for SUMO lokalisering i neuroner.
Her beskriver vi en protokol til at studere lokalisering af proteiner i mus hippocampal primære neuroner. Samtidig kan denne protokol tilpasses til forskellige typer af primære neuronale kulturer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue solution&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15250061</td>
			<td >Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibody SENP1</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-271360</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >17504044</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CaCl2</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >21115</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chambered coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DyLight</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (Hyclone)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SH3007002 (CHA1111L)</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow&#8211;green fluorescent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8803</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >G8769</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td>H3537</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Cystein&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MAP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AB15452</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM&#160;</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21575022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >M8266</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaOH</td>
			<td >VWR International</td>
			<td>1,091,371,000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal A</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10888022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-SIM Super Resolution Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Papain</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td >P-3125</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/Strep 10x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >15140122</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-L lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProLong Diamond Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PSD95&#160;</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>K28/43</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round coverglass</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12052712</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SUMO1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32058</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptophysin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5768&#160;</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin inhibitor&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>T9003-500MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons

Synapser er de funktionelle elementer af neuroner og deres defekter eller tab er på grundlag af flere neurodegenerative og neurologiske lidelser. Imaging undersøgelser er almindeligt anvendt til at undersøge deres funktion og plasticitet i fysiologiske og patologiske forhold. På grund af deres størrelse og struktur kræver lokaliseringsundersøgelser af proteiner billedbehandlingsteknikker med høj opløsning. I denne protokol beskriver vi en procedure til undersøgelse i primære neuroner co-lokalisering af målproteiner med synaptiske markører på et superopløsningsniveau ved hjælp af struktureret belysningmikroskopi (SIM). SIM er en mønstret lys belysning teknik, der fordobler den rumlige opløsning af wide-field mikroskopi, nå en detalje på omkring 100 nm. Protokollen angiver de nødvendige kontrolelementer og indstillinger for robuste undersøgelser af sam lokalisering og en oversigt over de statistiske metoder til at analysere billeddataene korrekt.

Vi præsenterer her standard workflow at studere neuronal proteiner co-lokalisering. Vi kalibrerede først mikroskopet, og derefter udførte vi SIM-analyse af prøverne. For at kalibrere systemet brugte vi fluorescerende mikrosfærer med en diameter på 0,1 μm. Ved at opnå super-løst 3D-SIM-billeder af perlerne, er de underliggende billeddata Fourier-transformeret til at konvertere dem til en rumlig frekvens repræsentation. I figur 2Apræsenteres det særskilte blomstermønster som en in...

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons at JoVE.com

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Denne protokol viser, hvordan man anvender super-opløsning mikroskopi til at studere protein co-lokalisering i primære neuronale kulturer.

Super-resolution Imaging at studere co-lokalisering af proteiner og synaptiske markører i primære neuroner

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Synapser er de funktionelle elementer af neuroner og deres defekter eller tab er på grundlag af flere neurodegenerative og neurologiske lidelser. Imaging undersøgelser er almindeligt anvendt til at undersøge deres funktion og plasticitet i fysiologiske og patologiske forhold. På grund af deres størrelse og struktur kræver lokaliseringsundersøgelser af proteiner billedbehandlingsteknikker med høj opløsning.I denne protokol beskriver vi en procedure til undersøgelse i primære neuroner co-lokalisering af målproteiner med synaptiske markører på et superopløsningsniveau ved hjælp af struktureret belysningmikroskopi. SIM er en mønstret lys belysning teknik, der fordobler den rumlige opløsning af widefield mikroskopi, nå en detalje på omkring 100 nanometer. Protokollen angiver de nødvendige kontrolelementer og indstillinger for robuste undersøgelser af sam lokalisering og en oversigt over de statistiske metoder til at analysere billeddataene korrekt.Nøglen til at tillade analysen på superopløsningsniveau er imidlertid de reagenser, der anvendes under erhvervelsen, såsom kammerdækslip og monteringsløsninger, der er forenelige med målets diffraktionsindeks. For at opnå en mus hippocampal primær neuron, isolere hippocampi fra P1 til P4 hvalpe. Pladeceller ved 70.000 celler pr. brønd i et volumen på 200 mikroliter pr. brønd.Vent, indtil hippocampal primære neuroner er fuldt modnet 12 til 14 dage efter plating at udføre co-lokalisering undersøgelser. Tilføj 4% paraformaldehyd, PFA, i PBS 200 mikroliter pr. brønd til neuroner for at løse dem hurtigt. Opløsningen fjernes og inkuberes prøverne med 1 % kvægserumalbumin, BSA, i PBS ved 200 mikroliter pr. brønd i en time ved stuetemperatur for passivt at dække alle pladens fritbindingsoverflader med et irrelevant protein til analysen.En BSA-baseret blokeringsbuffer uden Triton X-100 reducerer antistofbaggrunden mere effektivt end den samme buffer med 0,2 % Triton X-100. Tilsæt det primære antistof. Som en negativ kontrol, ikke tilføje nogen primær antistof til en af brøndene.Monter celler ved hjælp af et SIM-kompatibelt monteringsmiddel, f.eks. Cover og beskytte cellerne med et dækglas, for eksempel et rundt dækglas med en diameter på otte millimeter.Square dem kan også bruges. Opbevar de chamberede dækslip ved stuetemperatur, og vent mindst 48 timer, før du køber billeder. Diamantglas kræver mindst to dages hærdning før super-opløsning opkøb.Brug to strategier til at sikre antistof specificitet. Den første er brugen af mindst to forskellige antistoffer rettet mod samme substrat. Den anden strategi er antistofneutralisering ved inkubation med det rensede proteinmål eller den, der anvendes til at hæve antistoffet.Vi bruger rutinemæssigt et N-SIM super-opløsning mikroskop fremstillet af Nikon til vores analyse. De følgende instruktioner skal være beregnet til erhvervelse af SIM-billeder uafhængigt af mikroskopet af brug. Det er også vigtigt at maksimere mikroskopets ydeevne for at udføre en nøjagtig kalibrering af instrumenterne, herunder korrektionsring, laserjustering og ristblok fokusering.Før erhvervelsen af SIM-billeder, kræver systemet en ordentlig kalibrering med specifikke sub-opløsning størrelse fluorescerende perler. Et eksempel er TetraSpeck mikrosfærer. Disse perler er plettet med forskellige fluorescerende farvestoffer til at tillade kalibrering af forskellige lasere med en prøve.I et vandbad, sonikere omkring 1,8 gange 10 til den 8. Fortyndes fluorescerende mikrosfærer en ud af 500 i dobbelt destilleret vand. Sonikere en anden gang i yderligere 10 minutter.Pipette 15 mikroliter af de fortyndede perler i en brønd af en chambered coverslip. Lad opløsningen tørre i fem minutter ved stuetemperatur. Der tilsættes 10 mikroliter af monteringsopløsningen, f.eks.ProLong Glas, og placere en otte millimeter coverslip på toppen. Vent mindst 48 timer for at tillade en korrekt hærdning. Tænd for mikroskopet og laserne.Lad systemet varme op for at opnå termisk ligevægt mellem alle mikroskopkomponenter, og SIM-superopløsningsmikroskopsystemet kræver mindst tre timer. Vælg 100X-målsætningen. Start kalibreringen ved at justere laserne til midten af diffraktionsristblokken.I N-SIM-systemet giver en mikrometerknap og et dedikeret kamera centrering af lysstrålerne til målet. Indsæt mikroskopets kammerdækslæb til visning. Indstil systemet til den kammerdækkede dækseltykkelse ved at justere målkorrektionsdækslet.NIS Software, den proprietære software leveres med N-SIM super-opløsning mikroskop systemer, har en automatisk funktion til at regulere korrektion af farver. Juster ristblokfokus for hver kanal for at sikre fokuseret struktureret mønsterbelysning på prøven. Softwaren giver en automatisk funktion til denne opgave.Ansk af rå 3D SIM-billeder af flerfarvet mikrosfærer. Beregn for hver separat bølgelængde Fourier transformeringen af det super-løste billede. Hvis det transformerede billede ikke opnår et korrekt blomsterlignende mønster, skal du genstarte kalibreringen, da superopløsning ikke er opnået.I det superopsøgte billede skal du vælge en enkelt mikrosfære og beregne dens intensitetsprofil for hver kanal for at måle den opnåede opløsning. Det skulle nu være tæt på 100 nanometer side om side. Udfør kanalregistrering ved at overlejre en multikanalserhvervelse af mikrosfærerne.Målet er at samle alle kanalsignaler side om side og aksialt. Dette vil fjerne kromatiske afvigelser på grund af forskydningen af de forskellige kanaler og hjælpe co-lokalisering analyse. Bekræft kvaliteten af kalibreringen ved hjælp af funktionerne belysning fase trin og belysning mønstrede fokus simcheck, en suite af plugins til open source-applikationen ImageJ.Begynd at analysere prøveemnet ved hjælp af en 40X-målsætning i konfokal eller widefield-tilstand. Dette gør det muligt at navigere i prøven, bevare gode detaljer og et stort synsfelt. Brug MAP2-antistofsignalet til at detektere et område, der repræsenterer neuronale processer.Ansk af prøven i konfokal tilstand for at bestemme farvningskvaliteten. Skift til mål 100X. Anvend olie på 100X målet.Anskjå et widefield- eller konfokalt billede, der senere bruges til at vurdere kvaliteten af det superkonfekterede billede. Skift til 3D SIM-tilstand. Ved hjælp af dialogvinduer til at angive parametrene for anskaffelse skal du vælge den højeste tilgængelige bitdybdeindstilling for at maksimere farveoplysningerne.Typisk er 16 bit standardvalget. For at forbedre signal-støj-forholdet skal du desuden vælge en lavfrekvensværdi for erhvervelse, f.eks. Ved hjælp af histogram vinduer, indstille laser magt for at opnå en lineær reaktion af signal for at undgå tab af oplysninger, begrænse mættede pixels i billederne.N-SIM-systemet bruger et Andor iXon3-kamera. Når du arbejder på 16 bit, skal du vælge en målintensitet på 16.000 for at sikre kameraets lineære reaktion. Alternativt kan du vælge et interval mellem 30.000 og 45.000 for at maksimere det dynamiske område for anskaffelserne.Indstil lasereffekten mellem 0,1 % og 50 %, når prøverne og eksponeringstiden aflyses mellem 50 millisekunder og to sekunder. Laserkræfter over 50% kan forårsage hurtig fotobleaching af fluorophores i brug. Begynd at hente billederne i 3D SIM-tilstand.Brug SIMcheck, en suite af gratis plugins til ImageJ, at vurdere kvaliteten af opkøb af de rå billeder. Hvis SIMcheck ikke registrerer artefakter eller kvalitetsproblemer, skal du anskaffe mindst 10 billeder fra fulde tekniske replikater for at muliggøre statistisk analyse. Erhvervede billeder er rå data, der skal behandles for at opnå rekonstruerede SIM-billeder, der vil blive brugt til yderligere analyse.I protokollen foreslår vi at bruge synaptophysin og PSD-95 som før og efter synaptiske markører. Der kan dog anvendes yderligere markører. En enorm mængde af litteratur understøtter brugen af andre proteiner, såsom drebrin og fagot som synaptiske markører.3D SIM erhvervede billeder er rå billeder, der skal behandles for at opnå rekonstruerede super-løst billeder. Forkert rekonstruktion af rå billeder kan føre til artefakter, der ville påvirke analysen af prøverne. Der bør derfor lægges stor vægt på at vælge genopbygningsparametre ordentligt.Beting de rå billeder ved hjælp af mikroskoprekonstruktionsanalysesoftwaren for at opnå et superoparbejdet billede. Alternativt kan du bruge en frit tilgængelig ImageJ plugin fairSIM at rekonstruere de rå billeder. Beregn Fourier omdanne af super-løst billeder ved hjælp af mikroskop genopbygning software eller ImageJ plugin SIMcheck.Et godt rekonstrueret billede bør vende tilbage, for hver kanal, en blomst-lignende billede. Hvis de rekonstruerede billeder ikke genskaber en blomsterlignende form, skal du genstarte fra de rå billeder og rekonstruere dem ved at ændre rekonstruktionsparametre, f.eks. I NIS-softwaren, der bruger eksemplet til at overvåge, hvordan ændring af parametre påvirker det endelige løsningsbillede, skal du ændre parameterens belysningsmoduleringskontrast, støjdæmpning i høj opløsning og undertrykkelse af fokus uden for fokus.Analysér det rekonstruerede billede til objektivt opdage artefakter ved hjælp af NanoJ-EGERN, en ImageJ-baseret plugin, til at vurdere kvaliteten af super-løst billeder. I vores analyse af co-lokalisering, brugte vi to tilgange. Den første er en visuel tilgang baseret på profilanalysen, der viser enkelte hændelser med sam lokalisering, og som identificerer bidraget fra hver kanal.Som et første skridt til at studere co-lokalisering mellem synaptiske markører og et protein af interesse, tage en super-løst billede og analysere en enkelt locus at bestemme signal overlapning. Identificer en enkelt locus på det super-løste billede. Få intensitetsprofilerne af fluorescerende signaler til interesseens locus.Hvis profilanalyse har foreslået en enkelt locus ko-lokalisering, en mere generel analyse af hele billedet kan udføres ved at beregne Pearson's og Mander's koefficienter. Brug JACoP, et ImageJ plugin, til at bestemme to parametre for co-lokalisering, Pearson's og Mander's. Efter at have kalibreret systemet og vurderet kvaliteten af de rekonstruerede billeder, begyndte vi derefter at analysere de primære neuronale kulturer farves med et antistof mod MAP2, en neuronal markør, PSD-95, en postsynaptisk markør, og vores mål protein SUMO1.Vi analyserede først prøven udfører fire-kanals konfokal mikroskopi med en 40X mål. Ved at vælge et område, der repræsenterer neuronale processer, skiftede vi til en 100X mål. Vi har erhvervet både konfokale og SIM-billeder af samme område for at vurdere kvaliteten af rekonstruktionen med NanoJ-SQUIRREL og udføre co-lokaliseringsanalyse.Belysning af synapsens struktur og sammensætning er afgørende for forståelsen af både fysiologiske og patologiske processer, der regulerer hukommelse og kognition. Mens der i normal tilstand synapser er byggestenene i hukommelsen, de er også på grundlag af komplekse neurologiske lidelser, såsom en af de mest almindelige former for demens Alzheimers sygdom. Den protokol, der er beskrevet her, gør det muligt at studere proteinsammensætning af synapser med en superopløsningsmikroskopiteknik kaldet struktureret belysningmikroskopi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Lateral Diffusion og exocytose af membranproteiner i dyrkede neuroner vurderes ved hjælp af Fluorescens Recovery og Fluorescens-tab fotoblegning

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo to-foton billedbehandling af oplevelsesbaseret afhængige molekylære ændringer i kortikal neuroner

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-opløsning Imaging af neuronale Dense-core blærer

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Real-time Imaging af axonal Transport af Quantum Dot-mærket BDNF i Primary neuroner

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Måling af Synaptic vesikel endocytose i kulturperler hippocampus neuroner

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modeling Neuronal død og Degeneration i musen primære cerebellare granulet neuroner

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

En optisk Assay for Synaptic vesikel genanvendelse i kulturperler neuroner overekspression præsynaptiske proteiner

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...