Name: super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons
Uploaded: 2020-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons at JoVE.com

De auteurs willen Edoardo Micotti bedanken voor de opbouwende kritiek op het manuscript. Deze studie werd ondersteund door BrightFocus A2019296F, door Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), door Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) en door het Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (JK).

1. Primaire culturen
<ol><li>Cultuur muis hippocampal primaire neuronen in chambered coverslips (zoals Ibidi μ-Slide 8 Well of Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) die overeenkomen met de objectieve eis voor #1,5 (0,17 mm) coverslip dikte.</li>
	<li>Coat chambered coverslips met 100 μL poly-L-lysine (100 μg/mL).</li>
	<li>De volgende dag was je de chambered coverslips twee maal met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Om muis primaire neuronen te verkrijgen, isoleren hippocampi van P1-P4 pups<sup ...

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).</li><li>Choquet, D., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+Synapse.">The Dynamic Synapse.</a> Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Aspects+of+CNS+Synapse+Formation.">Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).</li><li>Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Classes+of+Secreted+Synaptic+Organizers+in+the+Central+Nervous+System.">Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System.</a> Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist.">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).</li><li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses.">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).</li><li>Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+the+Inhibitory+Synapse+Organization+Using+Superresolution+Microscopy.">Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).</li><li>Yang, X., Specht, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+Domains+in+Super-Resolution+Microscopy:+The+Treachery+of+Images.">Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).</li><li>Monro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+diffraction+limit.">Beyond the diffraction limit.</a> Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).</li><li>Won, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+super-resolution.">Eyes on super-resolution.</a> Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination.">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathy:+dysfunction+of+synaptic+function.">Synaptopathy: dysfunction of synaptic function.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).</li><li>Tyebji, S., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathic+mechanisms+of+neurodegeneration+and+dementia:+Insights+from+Huntington's+disease.">Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease.</a> Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).</li><li>Won, H., Mah, W., Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorder+causes,+mechanisms,+and+treatments:+focus+on+neuronal+synapses.">Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+State+of+Synapses+in+Fragile+X+Syndrome.">The State of Synapses in Fragile X Syndrome.</a> The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).</li><li>Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+major+synaptic+signaling+pathways+involved+in+intellectual+disability.">Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability.</a> Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).</li><li>Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+dysfunction+in+prion+diseases:+a+trafficking+problem.">Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem.</a> International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).</li><li>Colnaghi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super+Resolution+Microscopy+of+SUMO+Proteins+in+Neurons.">Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., M&#246;nkem&#246;ller, V., Hennig, S., H&#252;bner, W., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-source+image+reconstruction+of+super-resolution+structured+illumination+microscopy+data+in+ImageJ.">Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ.</a> Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy.">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).</li><li>Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+microscopy:+artefact+analysis+and+reduction+utilizing+a+parameter+optimization+approach.">Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach.</a> Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).</li><li>Culley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoJ-SQUIRREL:+quantitative+mapping+and+minimisation+of+super-resolution+optical+imaging+artefacts.">NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts.</a> Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+co-localization+of+objects+in+dual-colour+confocal+images.">Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images.</a> Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander&#8217;s+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander&#8217;s overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li><li>Bolte, S., Cordeli&#232;res, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>Bae, J. R., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+neurodegenerative+diseases.">Synapses in neurodegenerative diseases.</a> BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).</li><li>Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+Approaches+for+Live+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging.</a> Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Karras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+optimization+of+reconstruction+parameters+in+structured+illumination+microscopy+-+A+practical+guide.">Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide.</a> Optics Communications. 436, 69-75 (2019).</li><li>Bereczki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+markers+of+cognitive+decline+in+neurodegenerative+diseases:+a+proteomic+approach.">Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach.</a> Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).</li><li>Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Changes+in+Synaptic+Markers+as+a+Function+of+Sleep+and+Wakefulness+in+Drosophila.">Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila.</a> Science. 324 (5923), 109-112 (2009).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander's+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li></ol>

Het ophelderen van de structuur en samenstelling van de synaps is cruciaal voor het begrijpen van de fysiologische en pathologische processen die geheugen en cognitie reguleren. Terwijl in de normale staat, synapsen zijn de bouwstenen van het geheugen, ze ook ten grondslag liggen aan complexe neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer32. Het hier beschreven protocol dient om de colokalisatie van neuronale eiwitten te bestuderen met een microscopietechniek met superresolutie genaamd S...

Het begrip en de mening van de synaps is enorm veranderd sinds de eerste beschrijving door Foster en Sherrington in 18971. Sindsdien is onze kennis van neuronale communicatie en de moleculaire processen erachter exponentieel gegroeid2. Het is duidelijk geworden dat synapsen kunnen worden gezien als een systeem met twee compartimenten: een pre-synaptisch compartiment met vesikels voor het vrijkomen van neurotransmitters en een post-synaptisch compartiment met receptoren3. Deze simplistische visie, in de afgelopen twintig jaar, is uitgegroeid tot een complex netwerk van de eiwitten die nodig zijn om zenderbinding om te zetten in signalering4.
De winst in het begrip zijn deels te wijten aan super-resolutie technieken die de diffractie limiet van conventionele licht microscopie om de dimensie van synapsen beter aan te passen5,6,7,8,9,10. Vanwege de diffractielimiet kan een optische microscoop geen resolutie bereiken van meer dan 200 nm lateraal11,12. Om deze limiet te omzeilen, werden superresolutietechnieken gemaakt, met behulp van verschillende benaderingen en het bereiken van verschillende subdiffractielimietresoluties: SIM, STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) en STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM verdubbelt de ruimtelijke resolutie van lasergebaseerde microscopiesystemen op basis van laservelden door een diffractierooster in het excitatiestraalpad15in te voegen. De beweegbare rooster diffracts de laserstralen om een bekende verlichting patroon, meestal strepen te creëren. Dit doelbewust gestructureerde lichtpatroon wordt bovenop de onbekende ruimtelijke verdeling van de fluorescerende kleurstof (van het monster) geplaatst. De interferentie franjes gevormd door de twee patronen coderen voor anders niet te onderscheiden fijne details met normale breedveld microscopie. De uiteindelijke super-resolved beeld wordt verkregen door het combineren en decoderen met wiskundige methoden verschillende ruwe beelden van hetzelfde monster verkregen door de vertalingen en rotaties van de diffractie rooster. De resolutie van de super-opgeloste beelden bereikt 100 nm in de laterale en 500 nm in de axiale richtingen voor 2D-SIM15 of 100 nm in de laterale en 250 nm in de axiale richtingen voor 3D-SIM16.
Het nieuwe begrip van de synaps is nog belangrijker in het licht van de vele neurologische aandoeningen waarbij synaptische disfunctie een belangrijke rol speelt bij het begin en progressie17,18. De ziekte van Alzheimer, Het syndroom van Down, de ziekte van Parkinson, prionziekten, epilepsie, autismespectrumstoornissen en fragiel x-syndroom zijn onder andere gekoppeld aan afwijkingen in synaptische samenstelling, morfologie en functie19,20,21,22.
Onlangs, met behulp van een set van SUMO-specifieke antilichamen, gebruikten we SIM om co-lokalisatie te tonen in primaire hippocampal neuronen van de SUMO eiwitten met de pre- en post-synaptische markers synaptophysine en PSD95 op super-resolutie niveau23. Dit stelde ons in staat om biochemische en confocale microscopie bewijs van SUMO lokalisatie in neuronen te bevestigen.
Hier beschrijven we een protocol om de lokalisatie van eiwitten in muis hippocampal primaire neuronen te bestuderen. Tegelijkertijd kan dit protocol worden aangepast aan verschillende soorten primaire neuronale culturen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue solution&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15250061</td>
			<td >Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibody SENP1</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-271360</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >17504044</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CaCl2</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >21115</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chambered coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DyLight</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (Hyclone)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SH3007002 (CHA1111L)</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow&#8211;green fluorescent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8803</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >G8769</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td>H3537</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Cystein&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MAP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AB15452</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM&#160;</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21575022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >M8266</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaOH</td>
			<td >VWR International</td>
			<td>1,091,371,000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal A</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10888022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-SIM Super Resolution Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Papain</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td >P-3125</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/Strep 10x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >15140122</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-L lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProLong Diamond Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PSD95&#160;</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>K28/43</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round coverglass</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12052712</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SUMO1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32058</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptophysin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5768&#160;</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin inhibitor&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>T9003-500MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons

Synapsen zijn de functionele elementen van neuronen en hun gebreken of verliezen zijn aan de basis van verschillende neurodegeneratieve en neurologische aandoeningen. Beeldvormingsstudies worden veel gebruikt om hun functie en plasticiteit in fysiologische en pathologische omstandigheden te onderzoeken. Vanwege hun grootte en structuur vereisen lokalisatiestudies van eiwitten beeldvormingstechnieken met hoge resolutie. In dit protocol beschrijven we een procedure om in primaire neuronen de colokalisatie van doelproteïnen met synaptische markers op een superresolutieniveau te bestuderen met behulp van gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM). SIM is een patroon-licht verlichting techniek die de ruimtelijke resolutie van breed-veld microscopie verdubbelt, het bereiken van een detail van ongeveer 100 nm. Het protocol geeft de vereiste besturingselementen en instellingen aan voor robuuste colokalisatiestudies en een overzicht van de statistische methoden om de beeldgegevens goed te analyseren.

We presenteren hier de standaard workflow om neuronale eiwitten co-lokalisatie te bestuderen. We kalibreerden eerst de microscoop en vervolgens voerden we SIM-analyse van de monsters uit. Om het systeem te kalibreren, gebruikten we fluorescerende microsferen met een diameter van 0,1 μm. Bij het verkrijgen van super-opgeloste 3D-SIM beelden van de kralen, de onderliggende beeldgegevens zijn Fourier-getransformeerd om ze opnieuw om te zetten in een ruimtelijke frequentie representatie. In figuur 2A</s...

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons at JoVE.com

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Dit protocol laat zien hoe je microscopie met superresolutie gebruiken om eiwitcolokalisatie te bestuderen in primaire neuronale culturen.

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Synapsen zijn de functionele elementen van neuronen en hun gebreken of verliezen zijn aan de basis van verschillende neurodegeneratieve en neurologische aandoeningen. Beeldvormingsstudies worden veel gebruikt om hun functie en plasticiteit in fysiologische en pathologische omstandigheden te onderzoeken. Vanwege hun grootte en structuur vereisen lokalisatiestudies van eiwitten beeldvormingstechnieken met hoge resolutie.In dit protocol beschrijven we een procedure om in primaire neuronen de colokalisatie van doeleiwitten met synaptische markers op een superresolutieniveau te bestuderen met behulp van gestructureerde verlichtingsmicroscopie. SIM is een patroon lichtverlichting techniek die de ruimtelijke resolutie van widefield microscopie verdubbelt, het bereiken van een detail van ongeveer 100 nanometer. Het protocol geeft de vereiste besturingselementen en instellingen aan voor robuuste colokalisatiestudies en een overzicht van de statistische methoden om de beeldgegevens goed te analyseren.De sleutel tot het toestaan van de analyse op een superresolutieniveau is echter de reagentia die bij de verwerving worden gebruikt, zoals chambered covers en montageoplossingen die compatibel zijn met de diffractie-index van de doelstelling. Om een muis hippocampal primaire neuron te verkrijgen, isoleer hippocampi van P1 naar P4 pups. Plaatcellen op 70.000 cellen per put in een volume van 200 microliter per put.Wacht tot hippocampal primaire neuronen zijn volledig gerijpt 12 tot 14 dagen na beplating om co-lokalisatie studies uit te voeren. Voeg 4% paraformaldehyde, PFA, in PBS 200 microliter per goed aan neuronen om ze snel vast te stellen. Verwijder de oplossing en ontcubeer de monsters met 1%runderserum albumine, BSA, in PBS bij 200 microliter per put gedurende een uur bij kamertemperatuur om passief alle vrij bindende oppervlakken van de plaat te bedekken met een irrelevant eiwit voor de analyse.Een op BSA gebaseerde blokkeringsbuffer zonder Triton X-100 vermindert de achtergrond van antilichamen efficiënter dan dezelfde buffer met 0,2%Triton X-100. Voeg het primaire antilichaam toe. Voeg als negatieve controle geen primair antilichaam toe aan een van de putten.Zet cellen op met een sim-compatibele mountant, bijvoorbeeld ProLong Glass Antifade Mountant. Dek af en bescherm de cellen met een coverglass, bijvoorbeeld een ronde afdekking met een diameter van acht millimeter.Vierkante kunnen ook worden gebruikt. Bewaar de chambered coverslips op kamertemperatuur en wacht ten minste 48 uur voordat u afbeeldingen verwerft. Diamond glas vereist ten minste twee dagen van het genezen voor super-resolutie acquisities.Gebruik twee strategieën om de specificiteit van antilichamen te verzekeren. De eerste is het gebruik van ten minste twee verschillende antilichamen gericht op hetzelfde substraat. De tweede strategie is antilichaam neutralisatie door incubatie met het gezuiverde eiwit doel, of de gebruikt om het antilichaam te verhogen.We gebruiken routinematig een N-SIM super-resolutie microscoop vervaardigd door Nikon voor onze analyse. De instructies die volgen moeten worden bedoeld voor de verwerving van SIM-beelden onafhankelijk van de gebruiksmicroscoop. Het is ook belangrijk om de prestaties van de microscoop te maximaliseren om een nauwkeurige kalibratie van de instrumenten uit te voeren, inclusief correctiering, laseruitlijning en roosterblokfocus.Voor de aankoop van SIM-beelden vereist het systeem een goede kalibratie met specifieke subresolutiegrootte fluorescerende kralen. Een voorbeeld zijn TetraSpeck microsferen. Deze kralen zijn gekleurd met verschillende fluorescerende kleurstoffen om de kalibratie van verschillende lasers met een monster mogelijk te maken.In een waterbad, sonicate ongeveer 1,8 keer 10 tot de 8e fluorescerende microsferen gedurende 10 minuten. Verdun de fluorescerende microsferen één op de 500 in dubbel gedestilleerd water. Sonicate een tweede keer voor een extra 10 minuten.Pipette 15 microliters van de verdunde kralen in een put van een chambered coverslip. Laat de oplossing vijf minuten drogen bij kamertemperatuur. Voeg 10 microliter van de montageoplossing toe, bijv.ProLong Glass, en plaats een acht millimeter coverslip op de top. Wacht minstens 48 uur om een goede uitharding mogelijk te maken. Zet de microscoop en lasers aan.Laat het systeem opwarmen om het thermische evenwicht van alle microscoopcomponenten te bereiken en het SIM-microscoopsysteem met superresolutie vereist minstens drie uur. Selecteer de doelstelling 100X. Start de kalibratie door de lasers uit te lijnen naar het midden van het diffractie rooster blok.In het N-SIM-systeem maken een micrometerknop en een speciale camera het mogelijk om de lichtstralen naar het doel te centreren. Plaats de chambered coverslip van de microscoop voor het bekijken. Stel het systeem in op de chambered coverslip dikte door de objectieve correctiecover aan te passen.NIS Software, de propriëtaire software die wordt geleverd met N-SIM super-resolutie microscoopsystemen, heeft een automatische functie om correctie van kleuren te reguleren. Pas de roosterblokfocus voor elk kanaal aan om te zorgen voor gerichte gestructureerde patroonverlichting op het monster. De software biedt een automatische functie voor deze taak.Verkrijg ruwe 3D SIM-beelden van de veelkleurige microsferen. Bereken voor elke afzonderlijke golflengte de Fourier-transformatie van het super-opgeloste beeld. Als de getransformeerde afbeelding geen correct bloemachtig patroon krijgt, start u de kalibratie opnieuw op omdat de superresolutie niet is bereikt.Selecteer in de superopte afbeelding één microsfeer en bereken het intensiteitsprofiel voor elk kanaal om de bereikte resolutie te meten. Het moet nu dicht bij 100 nanometer lateraal. Voer kanaalregistratie uit door een multi-channel acquisitie van de microsferen te overlayen.Het doel is om alle kanaalsignalen lateraal en axiaal te verzamelen. Dit elimineert chromatische aberraties als gevolg van de verkeerde uitlijning van de verschillende kanalen en helpen de co-lokalisatie analyse. Bevestig de kwaliteit van de kalibratie met behulp van de functies verlichting fase stap en verlichting patroon focus van SIMcheck, een suite van plugins voor de open source applicatie ImageJ.Begin met het analyseren van het monster met behulp van een 40X-doelstelling in confocale of breedveldmodus. Dit maakt navigatie van het monster mogelijk, met behoud van goede details en een groot gezichtsveld. Gebruik MAP2-signaal om een gebied te detecteren dat neuronale processen weergeeft.Verwerf afbeeldingen van het monster in confocale modus om de kwaliteit van de kleuring te bepalen. Schakel over naar de doelstelling 100X. Breng olie aan op de 100X doelstelling.Verwerf een widefield- of confocale afbeelding die later zal worden gebruikt om de kwaliteit van de super-opgeloste afbeelding te beoordelen. Schakel over naar de 3D SIM-modus. Als u dialoogvensters gebruikt om de parameters voor acquisitie in te stellen, selecteert u de hoogste bitdiepteinstelling die beschikbaar is om kleurinformatie te maximaliseren.Typisch, 16 bit is de standaard keuze. Bovendien, om de signaal-ruisverhouding te verbeteren, selecteert u een laagfrequente waarde voor acquisitie, zoals een megahertz. Met behulp van histogram vensters, laserkracht instellen om een lineaire reactie van het signaal te verkrijgen om verlies van informatie te voorkomen, beperken verzadigde pixels in de beelden.Het N-SIM systeem maakt gebruik van een Andor iXon3 camera. Wanneer u op 16-bits werkt, kiest u een doelintensiteit van 16.000 om de lineaire respons van de camera te garanderen. U ook kiezen voor een bereik tussen 30.000 en 45.000 om het dynamisch bereik van de acquisities te maximaliseren.Stel het laservermogen in tussen 0,1% en 50% bij het beeldvorming van de monsters en de belichtingstijden tussen 50 milliseconden en twee seconden. Laserkrachten boven de 50% kunnen leiden tot snelle fotobleaching van de fluoroforen in gebruik. Begin met het verwerven van de afbeeldingen in de 3D SIM-modus.Gebruik SIMcheck, een suite van gratis plug-ins voor ImageJ, om de kwaliteit van de acquisities van de ruwe afbeeldingen te beoordelen. Als SIMcheck geen artefacten of kwaliteitsproblemen detecteert, verwerft u minimaal 10 afbeeldingen van volledige technische replica's om statistische analyse mogelijk te maken. Verworven afbeeldingen zijn ruwe gegevens die moeten worden verwerkt om gereconstrueerde SIM-afbeeldingen te verkrijgen die zullen worden gebruikt voor verdere analyse.In het protocol raden we aan om synaptophysine en PSD-95 te gebruiken als pre- en post synaptische markers. Extra markeringen kunnen echter worden gebruikt. Een enorme hoeveelheid literatuur ondersteunt het gebruik van andere eiwitten, zoals drebrin en fagot als synaptische markers.3D SIM verworven beelden zijn ruwe beelden die moeten worden verwerkt om gereconstrueerde super-resolved beelden te verkrijgen. Onjuiste reconstructie van ruwe afbeeldingen kan leiden tot artefacten die de analyse van de monsters zouden beïnvloeden. Daarom moet er veel aandacht worden besteed aan het goed kiezen van reconstructieparameters.Verwerk de ruwe beelden met behulp van de microscoop reconstructie analyse software om een super-opgelost beeld te verkrijgen. U ook gebruik maken van een vrij beschikbare ImageJ plugin fairSIM om de ruwe beelden te reconstrueren. Bereken de Fourier-transformatie van de super-opgeloste beelden met behulp van de microscoop reconstructie software of ImageJ plugin SIMcheck.Een goed gereconstrueerd beeld moet voor elk kanaal een bloemachtig beeld terugbrengen. Als de gereconstrueerde afbeeldingen een bloemachtige vorm niet opnieuw maken, start u de ruwe afbeeldingen opnieuw op en reconstrueert u deze door reconstructieparameters te wijzigen, zoals lineair filteren, apodisatie en nulvolgordeonderdrukking. In de NIS-software die de preview gebruikt om te controleren hoe het wijzigen van de parameters van invloed is op de uiteindelijke opgeloste afbeelding, wijzigt u het contrast van de verlichtingsmodulatie van de parameter, ruisonderdrukking met hoge resolutie en onscherpe onderdrukking.Analyseer de gereconstrueerde afbeelding om artefacten onbevooroordeeld te detecteren met Behulp van NanoJ-SQUIRREL, een op ImageJ gebaseerde plug-in, om de kwaliteit van superbe loste afbeeldingen te beoordelen. In onze analyse van co-lokalisatie gebruikten we twee benaderingen. De eerste is een visuele benadering op basis van de profielanalyse die afzonderlijke gebeurtenissen van colokalisatie toont en die de bijdrage van elk kanaal identificeert.Als eerste stap om co-lokalisatie tussen synaptische markers en een eiwit van belang te bestuderen, neem een super-opgelost beeld en analyseer een enkele locus om signaal overlap te bepalen. Identificeer een enkele locus op de super-opgeloste afbeelding. Verkrijg de intensiteitsprofielen van de fluorescerende signalen naar de locus van belang.Als profielanalyse heeft gesuggereerd enkele locus co-lokalisatie, een meer algemene analyse van het hele beeld kan worden uitgevoerd door het berekenen van Pearson's en Mander's coëfficiënten. Gebruik JACoP, een ImageJ-plug-in, om twee parameters van colokalisatie, Pearson's en Mander's te bepalen. Nadat we het systeem hadden gekalibreerd en de kwaliteit van de gereconstrueerde beelden hadden beoordeeld, zijn we vervolgens begonnen met het analyseren van de primaire neuronale culturen bevlekt met een antilichaam tegen MAP2, een neuronale marker, PSD-95, een postsynaptische marker en ons doeleiwit SUMO1.We analyseerden eerst het monster dat vierkanaals confocale microscopie uitvoerde met een 40X-doelstelling. Bij het selecteren van een gebied dat neuronale processen vertegenwoordigt, zijn we overgestapt op een 100X-doelstelling. We verwierven zowel confocale als SIM-beelden van hetzelfde gebied om de kwaliteit van de wederopbouw te beoordelen met NanoJ-SQUIRREL en colokalisatie-analyse uit te voeren.Het ophelderen van de structuur en samenstelling van de synaps is cruciaal voor het begrip van zowel fysiologische als pathologische processen die geheugen en cognitie reguleren. Terwijl in normale staat synapsen zijn de bouwstenen van het geheugen, ze zijn ook aan de basis van complexe neurologische aandoeningen, zoals een van de meest voorkomende vormen van dementie de ziekte van Alzheimer. Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om de eiwitsamenstelling van synapsen te bestuderen met een microscopietechniek met superresolutie, gestructureerde verlichtingsmicroscopie genoemd.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser capture microdissectie van Drosophila Perifere neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation van de neuronen van knaagdieren Brain Slices synaptische transmissie en Image presynaptische Terminals Study

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Imaging pHluorin-tagged Receptor invoegen in op het plasmamembraan in primaire gekweekte muis neuronen

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-resolution Imaging van Neuronal Dense-core Blaasjes

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Real-time beeldvorming van Axonale Vervoer van Quantum Dot-label BDNF in primaire neuronen

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

Een optische Assay voor Synaptic vesikel Recycling in gekweekte neuronen Overexpressing presynaptische eiwitten

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...