Name: super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons
Uploaded: 2020-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons at JoVE.com

Die Autoren danken Edoardo Micotti für die konstruktive Kritik an dem Manuskript. Diese Studie wurde unterstützt von BrightFocus A2019296F, von Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), von Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) und vom Marie Skéodowska-Curie Innovative Training Network (JK).

1. Primärkulturen
<ol><li>Kultur Maus Hippocampus primäre Neuronen in kammerförmigen Abdeckungen (wie Ibidi μ-Slide 8 Well oder Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass), die die objektive Anforderung für #1,5 (0,17 mm) Abdeckung dicke entsprechen.</li>
	<li>Mantelkammer-Abdeckungen mit 100 l Poly-L-Lysin (100 g/ml).</li>
	<li>Am nächsten Tag die kammerförmigen Deckel zweimal mit steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS) waschen.</li>
	<li>Um Maus primär neuronen zu erhalten, isolieren Hippocampi von P1-P4 Welpen<sup...

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).</li><li>Choquet, D., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+Synapse.">The Dynamic Synapse.</a> Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Aspects+of+CNS+Synapse+Formation.">Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).</li><li>Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Classes+of+Secreted+Synaptic+Organizers+in+the+Central+Nervous+System.">Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System.</a> Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist.">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).</li><li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses.">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).</li><li>Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+the+Inhibitory+Synapse+Organization+Using+Superresolution+Microscopy.">Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).</li><li>Yang, X., Specht, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+Domains+in+Super-Resolution+Microscopy:+The+Treachery+of+Images.">Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).</li><li>Monro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+diffraction+limit.">Beyond the diffraction limit.</a> Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).</li><li>Won, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+super-resolution.">Eyes on super-resolution.</a> Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination.">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathy:+dysfunction+of+synaptic+function.">Synaptopathy: dysfunction of synaptic function.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).</li><li>Tyebji, S., Hannan, A. 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H., Schuster, D., Schaffer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+microscopy:+artefact+analysis+and+reduction+utilizing+a+parameter+optimization+approach.">Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach.</a> Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).</li><li>Culley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoJ-SQUIRREL:+quantitative+mapping+and+minimisation+of+super-resolution+optical+imaging+artefacts.">NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts.</a> Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+co-localization+of+objects+in+dual-colour+confocal+images.">Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images.</a> Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander&#8217;s+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander&#8217;s overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li><li>Bolte, S., Cordeli&#232;res, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>Bae, J. R., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+neurodegenerative+diseases.">Synapses in neurodegenerative diseases.</a> BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).</li><li>Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+Approaches+for+Live+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging.</a> Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Karras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+optimization+of+reconstruction+parameters+in+structured+illumination+microscopy+-+A+practical+guide.">Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide.</a> Optics Communications. 436, 69-75 (2019).</li><li>Bereczki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+markers+of+cognitive+decline+in+neurodegenerative+diseases:+a+proteomic+approach.">Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach.</a> Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).</li><li>Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Changes+in+Synaptic+Markers+as+a+Function+of+Sleep+and+Wakefulness+in+Drosophila.">Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila.</a> Science. 324 (5923), 109-112 (2009).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander's+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li></ol>

Die Aufklärung der Struktur und Zusammensetzung der Synapse ist entscheidend für das Verständnis der physiologischen und pathologischen Prozesse, die Gedächtnis und Kognition regulieren. Während im normalen Zustand, Synapsen sind die Bausteine des Gedächtnisses, Sie auch zugrunde liegen komplexe neurologische Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit32. Das hier beschriebene Protokoll dient dazu, die Kolokalisierung neuronaler Proteine mit einer superhochauflösenden Mikroskopietechnik namens SIM...

Das Verständnis und die Sicht der Synapse hat sich seit ihrer ersten Beschreibung durch Foster und Sherrington im Jahre 1897 enorm verändert1. Seitdem ist unser Wissen über neuronale Kommunikation und die dahinter stehenden molekularen Prozesse exponentiell gewachsen2. Es ist klar geworden, dass Synapsen als ein Zwei-Kompartime-System gedacht werden können: ein präsynaptisches Fach mit Vesikeln für die Freisetzung von Neurotransmittern und ein postsynaptisches Fach mit Rezeptoren3. Diese vereinfachende Sichtweise hat sich in den letzten zwanzig Jahren zu einem komplexen Netzwerk von Proteinen entwickelt, die erforderlich sind, um die Senderbindung in die Signalisierung4zu transduzieren.
Die Gewinne im Verständnis sind teilweise auf Super-Resolution-Techniken zurückzuführen, die die Beugungsgrenze der konventionellen Lichtmikroskopie überschritten haben, um der Dimension der Synapsen besser5,6,7,8,9,10anzupassen. Aufgrund der Beugungsgrenze kann ein optisches Mikroskop seitlich keine Auflösung über 200 nmerreichen 11,12. Um diese Grenze zu umgehen, wurden Super-Resolution-Techniken entwickelt, die verschiedene Ansätze und verschiedene Sub-Diffraktions-Limit-Auflösungen erreichten: SIM, STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) und STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM verdoppelt die räumliche Auflösung laserbasierter Weitfeldmikroskopiesysteme, indem ein Beugungsgitter in den Anregungsstrahlpfad15eingebracht wird. Das bewegliche Gitter diffriert die Laserstrahlen, um ein bekanntes Beleuchtungsmuster zu erzeugen, in der Regel Streifen. Dieses zweckdienlich strukturierte Lichtmuster wird der unbekannten räumlichen Verteilung des Fluoreszenzfarbstoffs (der Probe) überlagert. Die Interferenzfranen, die durch die beiden Muster gebildet werden, kodieren für sonst ununterscheidbare Feine Details mit normaler Weitfeldmikroskopie. Das endgültige superaufgelöste Bild wird durch Die Kombination und Dekodierung mit mathematischen Methoden mehrere Rohbilder derselben Probe erhalten durch die Übersetzungen und Drehungen des Beugungsgitters erhalten. Die Auflösung der superaufgelösten Bilder erreicht 100 nm in der Seitlichen und 500 nm in axialen Richtungen für 2D-SIM15 oder 100 nm in der Seitlichen und 250 nm in axialen Richtungen für 3D-SIM16.
Das neue Verständnis der Synapse ist noch wichtiger angesichts der vielen neurologischen Störungen, bei denen synaptische Dysfunktion spielt eine wichtige Rolle bei Beginn und Progression17,18. Alzheimer-Krankheit, Down-Syndrom, Parkinson-Krankheit, Prion-Erkrankungen, Epilepsie, Autismus-Spektrum-Störungen und fragile x-Syndrom unter anderem wurden mit Anomalien in der synaptischen Zusammensetzung, Morphologie und Funktion19,,20,21,22verbunden.
Kürzlich haben wir mit einer Reihe von SUMO-spezifischen Antikörpern SIM verwendet, um die Kolokalisierung in primären Hippocampus-Neuronen der SUMO-Proteine mit den prä- und postsynaptischen Markern Synaptophysin und PSD95 auf Superauflösungsebene23zu zeigen. Dies ermöglichte es uns, biochemische und konfokale Mikroskopie-Beweise für die SUMO-Lokalisierung in Neuronen zu bestätigen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung der Lokalisierung von Proteinen in Maus-Hippocampus-Primärneuronen. Gleichzeitig kann dieses Protokoll an verschiedene Arten von primären neuronalen Kulturen angepasst werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue solution&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15250061</td>
			<td >Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibody SENP1</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-271360</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >17504044</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CaCl2</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >21115</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chambered coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DyLight</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (Hyclone)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SH3007002 (CHA1111L)</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow&#8211;green fluorescent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8803</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >G8769</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td>H3537</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Cystein&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MAP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AB15452</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM&#160;</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21575022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >M8266</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaOH</td>
			<td >VWR International</td>
			<td>1,091,371,000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal A</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10888022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-SIM Super Resolution Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Papain</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td >P-3125</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/Strep 10x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >15140122</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-L lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProLong Diamond Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PSD95&#160;</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>K28/43</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round coverglass</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12052712</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SUMO1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32058</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptophysin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5768&#160;</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin inhibitor&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>T9003-500MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
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super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons

Synapsen sind die funktionellen Elemente von Neuronen und ihre Defekte oder Verluste sind die Grundlage für mehrere neurodegenerative und neurologische Erkrankungen. Bildgebende Studien werden häufig verwendet, um ihre Funktion und Plastizität unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Aufgrund ihrer Größe und Struktur erfordern Lokalisierungsstudien von Proteinen hochauflösende bildgebende Verfahren. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Untersuchung der Kolokalisierung von Zielproteinen mit synaptischen Markern in Primärneuronen auf einer Superauflösungsebene mittels strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM). SIM ist eine gemusterte Lichtbeleuchtungstechnik, die die räumliche Auflösung der Weitfeldmikroskopie verdoppelt und ein Detail von etwa 100 nm erreicht. Das Protokoll gibt die erforderlichen Kontrollen und Einstellungen für robuste Co-Lokalisierungsstudien und einen Überblick über die statistischen Methoden zur korrekten Analyse der Bilddaten an.

Wir präsentieren hier den Standard-Workflow zur Kolokalisierung neuronaler Proteine. Wir haben zuerst das Mikroskop kalibriert und als nächstes die SIM-Analyse der Proben durchgeführt. Zur Kalibrierung des Systems verwendeten wir fluoreszierende Mikrosphären mit einem Durchmesser von 0,1 m. Nach dem Erhalt von super aufgelösten 3D-SIM-Bildern der Perlen werden die zugrunde liegenden Bilddaten Fourier-transformiert, um sie in eine räumliche Frequenzdarstellung umzuwandeln. In Abbildung 2A</stron...

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Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Dieses Protokoll zeigt, wie man eine hochauflösende Mikroskopie einsetzt, um die Proteinkolokalisierung in primären neuronalen Kulturen zu untersuchen.

Super-Resolution Imaging zur Untersuchung der Kolokalisierung von Proteinen und synaptischen Markern in primärer Neuronen

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Synapsen sind die funktionellen Elemente von Neuronen und ihre Defekte oder Verluste sind die Grundlage für mehrere neurodegenerative und neurologische Erkrankungen. Bildgebende Studien werden häufig verwendet, um ihre Funktion und Plastizität unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Aufgrund ihrer Größe und Struktur erfordern Lokalisierungsstudien von Proteinen hochauflösende bildgebende Verfahren.In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Untersuchung der Kolokalisierung von Zielproteinen mit synaptischen Markern in Primärneuronen auf einer Superauflösungsebene mittels strukturierter Beleuchtungsmikroskopie. SIM ist eine gemusterte Lichtbeleuchtungstechnik, die die räumliche Auflösung der Weitfeldmikroskopie verdoppelt und ein Detail von rund 100 Nanometern erreicht. Das Protokoll gibt die erforderlichen Kontrollen und Einstellungen für robuste Co-Lokalisierungsstudien und einen Überblick über die statistischen Methoden zur korrekten Analyse der Bilddaten an.Der Schlüssel zur Ermöglichung der Analyse auf einer Super-Resolution-Ebene sind jedoch die bei der Erfassung verwendeten Reagenzien, wie z. B. kammerförmige Abdeckungen und Montagelösungen, die mit dem Beugungsindex des Ziels kompatibel sind. Um eine Maus Hippocampus primäre Neuron zu erhalten, isolieren Hippocampi von P1 zu P4 Welpen. Plattenzellen bei 70.000 Zellen pro Brunnen bei einem Volumen von 200 Mikrolitern pro Brunnen.Warten Sie, bis die primären Neuronen des Hippocampus 12 bis 14 Tage nach der Beschichtung vollständig ausgereift sind, um Co-Lokalisierungsstudien durchzuführen. Fügen Sie 4%Paraformaldehyd, PFA, in PBS 200 Mikroliter pro Brunnen zu Neuronen, um sie schnell zu beheben. Entfernen Sie die Lösung und inkubieren Sie die Proben mit 1%rinderserumalbumin, BSA, in PBS bei 200 Mikroliter pro Brunnen für eine Stunde bei Raumtemperatur, um alle frei bindenden Oberflächen der Platte passiv mit einem irrelevanten Protein für die Analyse abzudecken.Ein BSA-basierter Blockierpuffer ohne Triton X-100 reduziert den Antikörperhintergrund effizienter als derselbe Puffer mit 0,2% Triton X-100. Fügen Sie den primären Antikörper hinzu. Als Negativkontrolle, fügen Sie keinen primären Antikörper zu einem der Brunnen.Mount zellen mit einem SIM-kompatiblen Mountant, z.B. ProLong Glass Antifade Mountant. Bedecken und schützen Sie die Zellen mit einem Deckglas, z.B. einem runden Deckglas mit einem Durchmesser von acht Millimetern.Quadratische können auch verwendet werden. Bewahren Sie die kammerförmigen Abdeckungen bei Raumtemperatur auf und warten Sie mindestens 48 Stunden, bevor Sie Bilder erfassen. Diamantglas erfordert mindestens zwei Tage aushärten, bevor Super-Resolution Akquisitionen.Verwenden Sie zwei Strategien, um die Spezifischenität des Antikörpers zu gewährleisten. Der erste ist die Verwendung von mindestens zwei verschiedenen Antikörpern, die auf dasselbe Substrat abzielen. Die zweite Strategie ist die Antikörperneutralisation durch Inkubation mit dem gereinigten Proteinziel oder die zur Erhöhung des Antikörpers.Wir verwenden routinemäßig ein N-SIM-Superauflösungsmikroskop von Nikon für unsere Analyse. Die folgenden Anweisungen sind für die Erfassung von SIM-Bildern unabhängig vom Einsatzmikroskop zu verwenden. Es ist auch wichtig, die Leistung des Mikroskops zu maximieren, um eine genaue Kalibrierung der Instrumente durchzuführen, einschließlich Korrekturring, Laserausrichtung und Gitterblockfokussierung.Vor der Erfassung von SIM-Bildern erfordert das System eine ordnungsgemäße Kalibrierung mit bestimmten Fluoreszenzperlen in Subauflösungsgröße. Ein Beispiel sind TetraSpeck-Mikrosphären. Diese Perlen sind mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt, um die Kalibrierung verschiedener Laser mit einer Probe zu ermöglichen.In einem Wasserbad etwa 1,8 mal 10 mal 10 Bis zu den 8. fluoreszierenden Mikrosphären für 10 Minuten beschallen. Verdünnen Sie die fluoreszierenden Mikrosphären eins zu 500 in doppelt destilliertem Wasser. Ein zweites Mal für weitere 10 Minuten beschallen.Pipette 15 Mikroliter der verdünnten Perlen in einen Brunnen eines kammerierten Deckelrutsches. Lassen Sie die Lösung fünf Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Fügen Sie 10 Mikroliter der Montagelösung hinzu, z.B.ProLong Glass, und legen Sie einen acht Millimeter Abdeckungslip auf der Oberseite. Warten Sie mindestens 48 Stunden, um eine ordnungsgemäße Aushärtung zu ermöglichen. Schalten Sie das Mikroskop und die Laser ein.Lassen Sie das System aufwärmen, um das thermische Gleichgewicht aller Mikroskopkomponenten zu erreichen, und das SIM-Superauflösungsmikroskopsystem benötigt mindestens drei Stunden. Wählen Sie das 100X-Ziel aus. Starten Sie die Kalibrierung, indem Sie die Laser auf die Mitte des Beugungsgitterblocks ausrichten.Im N-SIM-System ermöglichen ein Mikrometerknopf und eine spezielle Kamera die Zentrierung der Lichtstrahlen zum Ziel. Legen Sie den kammerierten Deckelschlupf des Mikroskops zur Betrachtung ein. Stellen Sie das System auf die kammerierte Deckschdicke ein, indem Sie die objektive Korrekturabdeckung anpassen.NIS Software, die proprietäre Software, die mit N-SIM-Super-Auflösungsmikroskop-Systemen geliefert wird, verfügt über eine automatische Funktion, um die Korrektur von Farben zu regulieren. Passen Sie den Gitterblockfokus für jeden Kanal an, um eine fokussierte strukturierte Musterbeleuchtung auf der Probe zu gewährleisten. Die Software bietet eine automatische Funktion für diese Aufgabe.Erwerben Sie rohe 3D-SIM-Bilder der mehrfarbigen Mikrosphären. Berechnen Sie für jede einzelne Wellenlänge die Fourier-Transformation des superaufgelösten Bildes. Wenn das transformierte Bild kein korrektes blütenähnliches Muster erhält, starten Sie die Kalibrierung neu, da keine Superauflösung erreicht wurde.Wählen Sie im super aufgelösten Bild eine einzelne Mikrosphäre aus, und berechnen Sie ihr Intensitätsprofil für jeden Kanal, um die erreichte Auflösung zu messen. Es sollte nun in der Nähe von 100 Nanometern seitlich sein. Führen Sie die Kanalregistrierung durch Überlagern einer Mehrkanalerfassung der Mikrosphären durch.Ziel ist es, alle Kanalsignale seitlich und axial zu kollidieren. Dadurch werden chromatische Aberrationen aufgrund der Fehlausrichtung der verschiedenen Kanäle beseitigt und die Analyse der Kolokalisierung hilfreich. Bestätigen Sie die Qualität der Kalibrierung, indem Sie den Funktionen Beleuchtungsphasenschritt und Beleuchtungsmusterfokus von SIMcheck verwenden, einer Suite von Plugins für die Open-Source-Anwendung ImageJ.Beginnen Sie mit der Analyse der Probe mit einem 40-fachen Objektiv im konfokalen oder Weitfeldmodus. Dies ermöglicht die Navigation der Probe, die Aufrechterhaltung guter Details und ein großes Sichtfeld. Verwenden Sie das MAP2-Antikörpersignal, um einen Bereich zu erkennen, der neuronale Prozesse darstellt.Erfassen Sie Bilder der Probe im konfokalen Modus, um die Qualität der Färbung zu bestimmen. Wechseln Sie zum Ziel 100X. Öl auf das 100X-Objektiv auftragen.Erwerben Sie ein Weitfeld- oder Konfokalbild, das später verwendet wird, um die Qualität des superaufgelösten Bildes zu bewerten. Wechseln Sie in den 3D-SIM-Modus. Wählen Sie mithilfe von Dialogfenstern, um die Parameter für die Erfassung festzulegen, die höchste verfügbare Bittiefe aus, um Farbinformationen zu maximieren.In der Regel ist 16 Bit die Standardwahl. Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, wählen Sie außerdem einen Niederfrequenzwert für die Erfassung, z. B. einen Megahertz. Mit Histogrammfenstern, setzen Sie die Laserleistung, um eine lineare Signalantwort zu erhalten, um Informationsverlust zu vermeiden, gesättigte Pixel in den Bildern zu begrenzen.Das N-SIM-System verwendet eine Andor iXon3 Kamera. Wählen Sie bei 16 Bit eine Zielintensität von 16.000 aus, um das lineare Ansprechen der Kamera sicherzustellen. Alternativ können Sie einen Bereich zwischen 30.000 und 45 000 auswählen, um den Dynamikbereich der Akquisitionen zu maximieren.Stellen Sie die Laserleistung zwischen 0,1 % und 50 % bei der Bildgebung der Proben und der Belichtungszeiten zwischen 50 Millisekunden und zwei Sekunden ein. Laserleistungen über 50% können zu einer schnellen Photobleichung der im Einsatz sindden Fluorophore führen. Beginnen Sie mit dem Erfassen der Bilder im 3D-SIM-Modus.Verwenden Sie SIMcheck, eine Suite von kostenlosen Plugins für ImageJ, um die Qualität der Erfassungen der Rohbilder zu bewerten. Wenn SIMcheck keine Artefakte oder Qualitätsprobleme erkennt, erfassen Sie mindestens 10 Bilder aus vollständigen technischen Replikationen, um statistische Analysen zu ermöglichen. Erworbene Bilder sind Rohdaten, die verarbeitet werden müssen, um rekonstruierte SIM-Bilder zu erhalten, die für weitere Analysen verwendet werden.Im Protokoll empfehlen wir, Synaptophysin und PSD-95 als Prä- und Post-Synaptische Marker zu verwenden. Es können jedoch zusätzliche Marker verwendet werden. Ein riesiger Teil der Literatur unterstützt die Verwendung anderer Proteine, wie Drebrin und Fagott als synaptische Marker.3D-SIM-Bilder sind Rohbilder, die verarbeitet werden müssen, um rekonstruierte, super aufgelöste Bilder zu erhalten. Eine falsche Rekonstruktion von Rohbildern kann zu Artefakten führen, die sich auf die Analyse der Proben auswirken würden. Daher sollte der richtigen Auswahl der Rekonstruktionsparameter große Aufmerksamkeit geschenkt werden.Verarbeiten Sie die Rohbilder mit der Mikroskop-Rekonstruktionsanalyse-Software, um ein super aufgelöstes Bild zu erhalten. Alternativ können Sie ein frei verfügbares ImageJ-Plugin fairSIM verwenden, um die Rohbilder zu rekonstruieren. Berechnen Sie die Fourier-Transformation der superaufgelösten Bilder mit der Mikroskop-Rekonstruktionssoftware oder dem ImageJ-Plugin SIMcheck.Ein gutes rekonstruiertes Bild sollte für jeden Kanal ein blumenartiges Bild zurückgeben. Wenn die rekonstruierten Bilder keine blumenähnliche Form wieder herstellen können, starten Sie die Rohbilder neu, und rekonstruieren Sie sie, indem Sie Rekonstruktionsparameter wie lineare Filterung, Apodisierung und Unterdrückung der Nullreihenfolge ändern. In der NIS-Software können Sie mithilfe der Vorschau überwachen, wie sich das Ändern der Parameter auf das endgültige aufgelöste Bild auswirkt, ändern Sie den Kontrast zur Beleuchtungsmodulation des Parameters, die hochauflösende Rauschunterdrückung und die Unterdrückung von Fokus.Analysieren Sie das rekonstruierte Bild, um Artefakte unvoreingenommen zu erkennen, indem Sie NanoJ-SQUIRREL, ein ImageJ-basiertes Plugin, verwenden, um die Qualität von super aufgelösten Bildern zu bewerten. In unserer Analyse der Co-Lokalisierung haben wir zwei Ansätze verwendet. Der erste ist ein visueller Ansatz, der auf der Profilanalyse basiert, die einzelne Ereignisse der Kolokalisierung anzeigt und den Beitrag jedes Kanals identifiziert.In einem ersten Schritt, um die Kolokalisierung zwischen synaptischen Markern und einem Protein von Interesse zu untersuchen, nehmen Sie ein super aufgelöstes Bild und analysieren Sie einen einzelnen Ort, um Signalüberlappungen zu bestimmen. Identifizieren Sie einen einzelnen Standort auf dem super aufgelösten Bild. Erhalten Sie die Intensitätsprofile der fluoreszierenden Signale zum Ort des Interesses.Wenn die Profilanalyse eine Single-Locus-Kolokalisierung vorgeschlagen hat, kann eine allgemeinere Analyse des gesamten Bildes durch Berechnung der Koeffizienten von Pearson und Mander durchgeführt werden. Verwenden Sie JACoP, ein ImageJ-Plugin, um zwei Parameter der Co-Lokalisierung zu bestimmen, Pearson es und Mander's. Nachdem wir das System kalibriert und die Qualität der rekonstruierten Bilder bewertet hatten, begannen wir als nächstes, die primären neuronalen Kulturen zu analysieren, die mit einem Antikörper gegen MAP2, einen neuronalen Marker, PSD-95, einen postsynaptischen Marker und unser Zielprotein SUMO1 gefärbt waren.Wir analysierten zuerst die Probe, die eine vierkanalige konfokale Mikroskopie mit einem 40-Fach-Objektiv durchführte. Bei der Auswahl eines Bereichs, der neuronale Prozesse darstellt, haben wir auf ein 100-Fach-Ziel umgestellt. Wir haben sowohl Konfokal- als auch SIM-Bilder aus dem gleichen Bereich erworben, um die Qualität der Rekonstruktion mit NanoJ-SQUIRREL zu bewerten und eine Co-Lokalisierungsanalyse durchzuführen.Die Aufklärung der Struktur und Zusammensetzung der Synapse ist entscheidend für das Verständnis sowohl physiologischer als auch pathologischer Prozesse, die Gedächtnis und Kognition regulieren. Während im normalen Zustand Synapsen sind die Bausteine des Gedächtnisses, Sie sind auch die Grundlage für komplexe neurologische Erkrankungen, wie eine der häufigsten Formen der Demenz Alzheimer-Krankheit. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Proteinzusammensetzung von Synapsen mit einer superauflösenden Mikroskopietechnik, der so genannten strukturierten Beleuchtungsmikroskopie.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

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The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-Resolution Imaging neuronaler Dense-Core-Vesikel

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

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Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

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Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

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An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...