Name: super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons
Uploaded: 2020-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לאדוארדו מיצוטי על הביקורת הבונה על כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי BrightFocus A2019296F, על ידי פונדו די Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), על ידי Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) ועל ידי מארי Skłodowska-Curie חדשני הדרכה רשת (JK).

1. תרבויות עיקריות
<ol><li>נוירונים ראשוניים היפוקמפוס עכבר תרבות בכיסויים קאמריים (כגון Ibidi μ-Slide 8 באר או Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) התואמים את הדרישה האובייקטיבית עבור #1.5 (0.17 מ"מ) מכסה עובי.</li>
	<li>כיסויים עם 100 μL של פולי-L-לינזין (100 μg/ מ"ל).</li>
	<li>למחרת, לשטוף את כיסויי התא פעמיים עם תמיסת מלח סטרילית פוס...

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).</li><li>Choquet, D., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+Synapse.">The Dynamic Synapse.</a> Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Aspects+of+CNS+Synapse+Formation.">Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).</li><li>Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Classes+of+Secreted+Synaptic+Organizers+in+the+Central+Nervous+System.">Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System.</a> Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist.">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).</li><li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses.">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).</li><li>Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+the+Inhibitory+Synapse+Organization+Using+Superresolution+Microscopy.">Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).</li><li>Yang, X., Specht, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+Domains+in+Super-Resolution+Microscopy:+The+Treachery+of+Images.">Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).</li><li>Monro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+diffraction+limit.">Beyond the diffraction limit.</a> Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).</li><li>Won, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+super-resolution.">Eyes on super-resolution.</a> Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination.">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathy:+dysfunction+of+synaptic+function.">Synaptopathy: dysfunction of synaptic function.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).</li><li>Tyebji, S., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathic+mechanisms+of+neurodegeneration+and+dementia:+Insights+from+Huntington's+disease.">Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease.</a> Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).</li><li>Won, H., Mah, W., Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorder+causes,+mechanisms,+and+treatments:+focus+on+neuronal+synapses.">Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+State+of+Synapses+in+Fragile+X+Syndrome.">The State of Synapses in Fragile X Syndrome.</a> The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).</li><li>Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+major+synaptic+signaling+pathways+involved+in+intellectual+disability.">Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability.</a> Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).</li><li>Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+dysfunction+in+prion+diseases:+a+trafficking+problem.">Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem.</a> International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).</li><li>Colnaghi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super+Resolution+Microscopy+of+SUMO+Proteins+in+Neurons.">Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., M&#246;nkem&#246;ller, V., Hennig, S., H&#252;bner, W., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-source+image+reconstruction+of+super-resolution+structured+illumination+microscopy+data+in+ImageJ.">Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ.</a> Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy.">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).</li><li>Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+microscopy:+artefact+analysis+and+reduction+utilizing+a+parameter+optimization+approach.">Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach.</a> Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).</li><li>Culley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoJ-SQUIRREL:+quantitative+mapping+and+minimisation+of+super-resolution+optical+imaging+artefacts.">NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts.</a> Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+co-localization+of+objects+in+dual-colour+confocal+images.">Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images.</a> Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander&#8217;s+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander&#8217;s overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li><li>Bolte, S., Cordeli&#232;res, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>Bae, J. R., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+neurodegenerative+diseases.">Synapses in neurodegenerative diseases.</a> BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).</li><li>Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+Approaches+for+Live+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging.</a> Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Karras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+optimization+of+reconstruction+parameters+in+structured+illumination+microscopy+-+A+practical+guide.">Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide.</a> Optics Communications. 436, 69-75 (2019).</li><li>Bereczki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+markers+of+cognitive+decline+in+neurodegenerative+diseases:+a+proteomic+approach.">Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach.</a> Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).</li><li>Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Changes+in+Synaptic+Markers+as+a+Function+of+Sleep+and+Wakefulness+in+Drosophila.">Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila.</a> Science. 324 (5923), 109-112 (2009).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander's+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li></ol>

ההכלה של המבנה וההרכב של הסינסה חיונית להבנת התהליכים הפיזיולוגיים והפתולוגיים המווסתים את הזיכרון וההכרה. בעוד במצב נורמלי, סינופסות הן אבני הבניין של זיכרון, הם גם בבסיס הפרעות נוירולוגיות מורכבות כגון מחלת אלצהיימר32. הפרוטוקול המתואר כאן משמש לחקר ההתיקות הליקוטית של חל?...

ההבנה והתצוגה של הסינסה השתנו מאוד מאז התיאור הראשון של פוסטר ושרינגטון ב-18971. מאז, הידע שלנו בתקשורת עצבית והתהליכים המולקולריים שמאחוריה גדל באופן אקספוננציאלי2. זה הפך להיות ברור כי סינפסות ניתן לחשוב כמערכת דו-תאים: תא טרום סינפטי המכיל שלוקות לשחרור של נוירוטרנסמיטורים ותאי פוסט-סינפטי עם קולטנים3. השקפה פשטנית זו, בעשרים השנים האחרונות, התפתחה לרשת מורכבת של החלבונים הנדרשים כדי להעביר את המשדר המחייב לאותת4.
הרווחים בהבנה נובעים בחלקם מטכניקות סופר-רזולוציה שהתגברו על מגבלת הפליטה של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי כדי להתאים לממד של סינאפסותטוב יותר 5,6,7,8,,9,,10. בשל מגבלת הפליטה, מיקרוסקופ אופטי אינו יכול להגיע לרזולוציה מעל 200 00 0000 00:00:00,000---------------------------------------------------------,12 כדי לעקוף מגבלה זו, טכניקות סופר רזולוציה נוצרו, באמצעות גישות שונות ולהגיע לרזולוציות שונות של מגבלת תת-עקיפה: SIM, STED (מיקרוסקופית דלדול פליטה מגורה), PALM (מיקרוסקופית התאמה מקומית PhotoActivated) ו- STORM(מיקרוסקופשחזור אופטי סטוכסטי) 13,14. SIM מכפיל את הרזולוציה המרחבית של מערכות מיקרוסקופיות רחבות שדה מבוססות לייזר על-ידי הכנסת חיתוך צורב לנתיב קרן העירור15. הסורג הניתן להזזה מדרג את קרני הלייזר כדי ליצור תבנית תאורה ידועה, בדרך כלל פסים. תבנית אור מובנית בכוונה זו על-תפוצה מרחבית לא ידועה של צבע הפלורסנט (של הדגימה). שולי ההפרעה שנוצרו על ידי שני דפוסים מקודדים לפרטים עדינים שלא ניתן להבחין בהם עם מיקרוסקופיה רגילה בשטח רחב. התמונה הסופית סופר נפתרה מתקבלת על ידי שילוב ופענוח עם שיטות מתמטיות מספר תמונות גלם של אותה מדגם שהושג על ידי התרגומים והסבבים של סורג iffraction. הרזולוציה של תמונות סופר נפתרו מגיע 100 נמימה ל-500 נארם בהוראות axial עבור 2D-SIM15 או 100 נה"מ לדרבי ו 250 נה"מ בהוראות axial עבור 3D-SIM16.
ההבנה החדשה של הסינאפסה חשובה עוד יותר לאור ההפרעות הנוירולוגיות הרבות שבהן תפקוד לקוי של הסינאפטי ממלא תפקיד מרכזי בהתחלהובהתקדמות 17,18. מחלת אלצהיימר, תסמונת דאון, מחלת פרקינסון, מחלות פריון, אפילפסיה, הפרעות בספקטרום האוטיזם ותסמונת X שברירי בין היתר קושרו לחריגות בהרכב סינפטי, מורפולוגיה ותפקוד19,20,21,22.
לאחרונה, באמצעות קבוצה של נוגדנים ספציפיים SUMO, השתמשנו SIM כדי להראות התאמה לשפות אחרות בנוירונים היפוקמפוס ראשוניים של חלבוני SUMO עם סינפטופיזין סמנים לפני ופוסט סינפטי ו PSD95 ברמת סופר רזולוציה23. זה איפשר לנו לאשר ראיות ביוכימיות ומיקרוסקופיות קונפוקליות של התאמה סומו לנוירונים.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי ללמוד את ההתקמה של חלבונים בנוירונים ראשוניים היפוקמפוס העכבר. במקביל, פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם לסוגים שונים של תרבויות עצביות עיקריות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue solution&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15250061</td>
			<td >Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibody SENP1</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-271360</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >17504044</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CaCl2</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >21115</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chambered coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DyLight</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (Hyclone)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SH3007002 (CHA1111L)</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow&#8211;green fluorescent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8803</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >G8769</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td>H3537</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Cystein&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MAP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AB15452</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM&#160;</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21575022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >M8266</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaOH</td>
			<td >VWR International</td>
			<td>1,091,371,000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal A</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10888022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-SIM Super Resolution Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Papain</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td >P-3125</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/Strep 10x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >15140122</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-L lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProLong Diamond Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PSD95&#160;</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>K28/43</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round coverglass</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12052712</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SUMO1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32058</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptophysin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5768&#160;</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin inhibitor&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>T9003-500MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons

סינמפסות הן האלמנטים הפונקציונליים של נוירונים והפגמים או ההפסדים שלהם הם על בסיס מספר הפרעות ניווניות ונוירולוגיות. מחקרי הדמיה נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור את תפקודם ואת הפלסטיות שלהם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. בשל גודלם ומבנהם, מחקרי ים-ים של חלבונים דורשים טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים הליך ללמוד נוירונים ראשוניים התאמה יתיקות של חלבוני היעד עם סמנים סינפטיים ברמת סופר רזולוציה באמצעות מיקרוסקופית תאורה מובנית (SIM). SIM היא טכניקת תאורה בדוגמת אור המכפילה את הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופ שדה רחב, ומגיעה לפרטים של כ-100 00 00 00 00 00 00 00:00. הפרוטוקול מציין את הפקדים וההגדרות הנדרשים עבור מחקרי התאמה יתקליזציה איתנים ודה-טה-תס על השיטות הסטטיסטיות לניתוח נתוני ההדמיה כראוי.

אנו מציגים כאן את זרימת העבודה הסטנדרטית כדי ללמוד חלבונים עצביים שיתוף מקומי. כיילנו תחילה את המיקרוסקופ ולאחר מכן ביצענו ניתוח SIM של הדגימות. כדי לכייל את המערכת, השתמשנו במיקרוספירות פלורסנט בקוטר 0.1 μm. לאחר קבלת תמונות תלת-SIM סופר-פתורות של החרוזים, נתוני התמונה הבסיסית הופכים את פוריי?...

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons at JoVE.com

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

פרוטוקול זה מראה כיצד להשתמש במיקרוסקופ סופר-רזולוציה כדי ללמוד חלבון שיתוף מקומי בתרבויות עצביות עיקריות.

הדמיה סופר-רזולוציה ללמוד התאמה ית-מקומית של חלבונים וסמנים סינפטיים בנוירונים ראשוניים

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

סינפסות הן האלמנטים התפקודיים של נוירונים והפגמים או ההפסדים שלהם נמצאים בבסיס מספר הפרעות נוירודגנרטיביות ונוירולוגיות. מחקרי הדמיה נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור את תפקודם ואת פלסטיותם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. בשל גודלם ומבנהם, מחקרי לוקליזציה של חלבונים דורשים טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה.בפרוטוקול זה, אנו מתארים הליך ללמוד בנוירונים ראשוניים את ההתאמה של חלבוני יעד עם סמנים סינפטיים ברמת רזולוציית-על באמצעות מיקרוסקופיה מובנית של תאורה. SIM היא טכניקת תאורת אור בדוגמת המכפילה את הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופיה שדה רחב, ומגיעה לפרטים של כ -100 ננומטר. הפרוטוקול מציין את הפקדים וההגדרות הדרושים למחקרי לוקליזציה חיים וסקירה של השיטות הסטטיסטיות לניתוח נכון של נתוני ההדמיה.המפתח לאפשר את הניתוח ברמה של רזולוציית-על הוא, עם זאת, הריג'ינים המשמשים במהלך הרכישה, כגון כיסויים קאמריים ופתרונות הרכבה התואמים למדד העקמים של המטרה. כדי להשיג נוירון ראשי בהיפוקמפוס העכבר, לבודד היפוקמפוס מ P1 כדי P4 גורים. תאי לוח ב 70, 000 תאים לגם בנפח של 200 microliters לגם.המתן עד נוירונים ראשוניים ההיפוקמפוס התבגרו באופן מלא 12 עד 14 ימים לאחר ציפוי לבצע מחקרים לוקליזציה שיתוף. הוסף 4% paraformaldehyde, PFA, ב PBS 200 microliters לכל באר לנוירונים כדי לתקן אותם במהירות. הסר את הפתרון והדגירה את הדגימות עם אלבומין סרום 1%bovine, BSA, ב PBS ב 200 microliters ל הבאר במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי לכסות באופן פסיבי את כל משטחי כריכה חופשית של הצלחת עם חלבון לא רלוונטי לניתוח.מאגר חסימה מבוסס BSA ללא Triton X-100 מפחית את רקע הנוגדנים בצורה יעילה יותר מאותו מאגר עם 0.2%Triton X-100. מוסיפים את הנוגדן העיקרי. כשליטה שלילית, אין להוסיף נוגדן ראשוני לאחת הבארות.הרכב תאים באמצעות Mountant תואם SIM, למשל. ארוך זכוכית Antifade Mountant. לכסות ולהגן על התאים עם coverglass, למשל, coverglass עגול עם קוטר של שמונה מילימטרים.ניתן להשתמש גם בריבועים. אחסן את הכיסויים התאיים בטמפרטורת החדר והמתן לפחות 48 שעות לפני רכישת התמונות. זכוכית יהלום דורשת לפחות יומיים של ריפוי לפני רכישות ברזולוציית-על.השתמש בשתי אסטרטגיות כדי להבטיח ספציפיות נוגדנים. הראשון הוא שימוש בלפחות שני נוגדנים שונים המכוונים לאותו מצע. האסטרטגיה השנייה היא נטרול נוגדנים על ידי דגירה עם יעד החלבון המטוהר, או משמש להעלאת הנוגדן.אנו משתמשים באופן שגרתי במיקרוסקופ רזולוציית-על N-SIM המיוצר על-ידי ניקון לצורך הניתוח שלנו. ההוראות הבאות מיועדות לרכישת תמונות SIM ללא תלות במיקרוסקופ השימוש. חשוב גם למקסם את הביצועים של המיקרוסקופ כדי לבצע כיול מדויק של המכשירים, כולל טבעת תיקון, יישור לייזר, והתמקדות בלוק סורג.לפני רכישת תמונות SIM, המערכת דורשת כיול נכון עם חרוזים פלואורסצנטיים ספציפיים בגודל תת-רזולוציה. דוגמה לכך היא מיקרוספרות טטרה-ספק. חרוזים אלה מוכתמים בצבעים פלואורסצנטיים שונים כדי לאפשר כיול של לייזרים שונים עם דגימה אחת.באמבט מים, sonicate סביב 1.8 פעמים 10 כדי מיקרוספרות פלואורסצנטי 8 במשך 10 דקות. מדללים את המיקרוספרות הפלואורסצנטיות אחד ל-500 במים מזוקקים כפולים. Sonicate בפעם השנייה במשך 10 דקות נוספות.פיפטה 15 מיקרוליטרים של חרוזים מדוללים לתוך באר של כיסוי קאמרי. תן לפתרון להתייבש במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 10 מיקרוליטרים של פתרון ההרכבה, למשל.להאריך זכוכית, ולה מניחים כיסוי שמונה מילימטר על גבי. המתן לפחות 48 שעות כדי לאפשר ריפוי נאות. תפעיל את המיקרוסקופ והלייזרים.תן למערכת להתחמם כדי להגיע לשיווי משקל תרמי של כל רכיבי המיקרוסקופ ומערכת המיקרוסקופ ברזולוציית-העל SIM דורשת לפחות שלוש שעות. בחר את המטרה 100X. התחל את הכיול על-ידי יישור הלייזרים למרכז בלוק החיתוך של ההיחסנות.במערכת N-SIM, ידית מיקרומטר ומצלמה ייעודית מאפשרות מרוכך של קרני האור למטרה. הכנס את המכסה התאי של המיקרוסקופ לצפייה. הגדר את המערכת לעובי הכיסוי התאי על-ידי התאמת כיסוי התיקון האובייקטיבי.ל-NIS Software, התוכנה הקניינית המסופקת עם מערכות מיקרוסקופ סופר-רזולוציה של N-SIM, יש פונקציה אוטומטית להסדרת תיקון צבעים. התאימו את מוקד החסימה עבור כל ערוץ כדי להבטיח תאורת דוגמאות מילוי מובנית ממוקדת בדגימה. התוכנה מספקת פונקציה אוטומטית עבור משימה זו.רכשו תמונות SIM תלת-מימדיות גולמיות של המיקרוספרות הרב-צבעיות. חישבו עבור כל אורך גל נפרד את המרת פורייה של התמונה הסופר-פתורה. אם התמונה שהשתנתה אינה מצליחה להשיג תבנית דמוית פרח נכונה, הפעל מחדש את הכיול מאחר שלא הושגה רזולוציית-על.בתמונה הסופר-פתורה, בחרו מיקרוספרה אחת וחשבו את פרופיל העוצמה שלה לכל ערוץ כדי למדוד את הרזולוציה שהושגה. עכשיו זה צריך להיות קרוב ל -100 ננומטרים באופן מאוחר יותר. בצע רישום ערוצים על-ידי כיסוי רכישה רב-ערוצית של המיקרוספרות.המטרה היא לאסוף את כל אותות הערוץ באופן אוברישי ואקסיאלי. פעולה זו תבטל סטייות כרומטיות עקב חוסר התאמה של הערוצים השונים ותסייע בניתוח לוקליזציה שותף. אשר את איכות הכיול באמצעות שלב התאורה פונקציות ואת המוקד בדוגמת תאורה של SIMcheck, חבילה של תוספים עבור יישום קוד פתוח ImageJ.התחל לנתח את הדגימה באמצעות מטרה 40X במצב קונפוק או שדה רחב. זה מאפשר ניווט של המדגם, שמירה על פרטים טובים שדה גדול של תצוגה. השתמש אות נוגדן MAP2 כדי לזהות אזור המייצג תהליכים עצביים.רכוש תמונות של הדגימה במצב קונפוקל כדי לקבוע את איכות הכתם. עבור למטרה 100X. החל שמן על המטרה 100X.רכוש תמונה רחבה או תמונת קונפוקל שתשמש מאוחר יותר להערכת איכות התמונה הסופר-פתורה. עברו למצב SIM תלת-מימדי. באמצעות חלונות דו-שיח כדי להגדיר את הפרמטרים לרכישה, בחר את הגדרת עומק הסיביות הגבוהה ביותר הזמינה כדי להגדיל את מידע הצבע.בדרך כלל, 16 סיביות היא הבחירה הסטנדרטית. יתר על כן, כדי לשפר את יחס האות לרעש, בחר ערך בתדר נמוך לרכישה, כגון מגה-הרץ אחד. באמצעות חלונות היסטוגרמה, הגדר כוח לייזר כדי לקבל תגובה ליניארית של אות כדי למנוע אובדן מידע, להגביל פיקסלים רוויים בתמונות.מערכת N-SIM משתמשת במצלמת iXon3 של אנדור. בעת עבודה ב- 16 סיביות, בחר עוצמת יעד של 16,000 כדי להבטיח את התגובה ליניארית של המצלמה. לחלופין, בחר טווח שבין 30,000 ל- 45,000 כדי למקסם את הטווח הדינמי של הרכישות.הגדר את כוח הלייזר בין 0.1% ל- 50% בעת הדמיית הדגימות ושזמניות החשיפה בין 50 אלפיות השניה לשתי שניות. כוחות לייזר מעל 50% עלולים לגרום לצילום מהיר של הפלואורופורים בשימוש. התחל לרכוש את התמונות במצב SIM תלת-מימדי.השתמש SIMcheck, חבילה של תוספים חינם עבור ImageJ, כדי להעריך את איכות הרכישות של התמונות הגולמיות. אם SIMcheck אינו מזהה חפצים או בעיות איכות, רכוש מינימום של 10 תמונות משכפולים טכניים מלאים כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי. תמונות שנרכשו הן נתונים גולמיים שיש לעבד כדי להשיג תמונות SIM משוחזרות שישמשו לניתוח נוסף.בפרוטוקול, אנו ממליצים להשתמש סינפטופיצין ו PSD-95 כמו סמנים סינפטיים לפני ופוסט. עם זאת, ניתן להשתמש סמנים נוספים. גוף עצום של ספרות תומך בשימוש בחלבונים אחרים, כגון דרברין ובסון כמו סמנים סינפטיים.תמונות שנרכשו על-ידי SIM תלת-מימד הן תמונות גולמיות שיש לעבד כדי להשיג תמונות ששוחזרו באופן סופר-פתור. שחזור שגוי של תמונות גולמיות יכול להוביל לחפצים שישפיעו על ניתוח הדגימות. לכן יש להקדיש תשומת לב רבה לבחירת פרמטרי שחזור כראוי.עבד את התמונות הגולמיות באמצעות תוכנת ניתוח שחזור מיקרוסקופ כדי להשיג תמונה סופר פתורה. לחלופין, השתמשו ב-ImageJ Plugin FairSIM זמין בחופשיות כדי לשחזר את התמונות הגולמיות. לחשב את המרה פורייה של תמונות סופר פתורות באמצעות תוכנת שחזור מיקרוסקופ או ImageJ תוסף SIMcheck.תמונה משוחזרת טובה אמורה להחזיר, עבור כל ערוץ, תמונה דמוית פרח. אם התמונות ששוחזרו אינן מצליחות ליצור צורה דמוית פרח, הפעל מחדש מהתמונות הגולמיות ושחזר אותן מחדש על-ידי שינוי פרמטרי שחזור, כגון סינון ליניארי, apodization והסתרת סדר אפס. בתוכנת NIS באמצעות התצוגה המקדימה כדי לנטר כיצד שינוי הפרמטרים משפיע על התמונה הסופית שנפתרה, לשנות את ניגודיות אפנון התאורה של הפרמטר, דיכוי רעש ברזולוציה גבוהה, ומחוץ לדיכוי המיקוד.נתח את התמונה המשוחזרת כדי לזהות חפצים באופן בלתי משוחד באמצעות NanoJ-SQUIRREL, תוסף מבוסס ImageJ, כדי להעריך את האיכות של תמונות סופר פתורות. בניתוח שלנו של לוקליזציה שותף, השתמשנו בשתי גישות. הראשון הוא גישה חזותית המבוססת על ניתוח הפרופיל המציג אירועים בודדים של לוקליזציה במשותף ומזהה את תרומתו של כל ערוץ.כצעד ראשון לחקר לוקליזציה בין סמנים סינפטיים לחלבון מעניין, יש לייקט תמונה סופר-פתורה ולנתח לוקוס יחיד כדי לקבוע חפיפה לאות. זהה לוקוס יחיד בתמונה הסופר-פתורה. השג את פרופילי האינטנסיביות של אותות הפלואורסצנט לפוקוס העניין.אם ניתוח פרופיל הציע לוקוס יחיד לוקליזציה, ניתוח כללי יותר של התמונה כולה יכול להתבצע על ידי חישוב מקדמי פירסון ומנדר. השתמש JACoP, תוסף ImageJ, כדי לקבוע שני פרמטרים של לוקליזציה משותף, פירסון של מנדר. לאחר כיילנו את המערכת והערכנו את איכות התמונות המשוחזרות, התחלנו לאחר מכן לנתח את התרבויות העצביות העיקריות המוכתמות בנוגדן נגד MAP2, סמן עצבי, PSD-95, סמן פוסט-סינפטי וחלבון היעד שלנו SUMO1.ניתחנו לראשונה את הדגימה המבצעת מיקרוסקופיה קונפוקל בת ארבעה ערוצים עם מטרה של פי 40. עם בחירת אזור המייצג תהליכים עצביים, עברנו למטרה של פי 100. רכשנו גם תמונות קונפוקל וגם תמונות SIM של אותו אזור כדי להעריך את איכות השחזור עם NanoJ-SQUIRREL ולבצע ניתוח לוקליזציה משותף.ביהור המבנה וההרכב של הסינפסה חיוני להבנת תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים המווסתים את הזיכרון ואת ההכרה. בעוד סינפסות מצב נורמלי הם אבני הבניין של זיכרון, הם גם על בסיס של הפרעות נוירולוגיות מורכבות, כגון אחת הצורות הנפוצות ביותר של מחלת אלצהיימר דמנציה. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לחקור את הרכב החלבון של הסינפסות בטכניקת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר הנקראת מיקרוסקופ תאורה מובנית.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

הדמית pHluorin-תויגה הכנסת קולט לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית ​​צפופות ליבות עצבית

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

הדמיה של axonal תחבורה של Quantum בזמן אמת Dot-כותרת BDNF בנוירונים העיקרי

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

וזמינותו אופטי למיחזור שלפוחית סינפטית בנוירונים בתרבית Overexpressing חלבונים Presynaptic

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...