Name: super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons
Uploaded: 2020-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons at JoVE.com

Gli autori ringraziano Edoardo Micotti per la critica costruttiva del manoscritto. Lo studio è stato sostenuto da BrightFocus A2019296F, di Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), di Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) e della Rete di Formazione Innovativa Marie skadorwska-Curie (JK).

1. Culture primarie
<ol><li>Coltura mouse ippocampo primario neuroni in coperture camerate (come Ibidi μ-Slide 8 Well o Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) che corrispondono al requisito obiettivo per #1.5 (0.17 mm) coprelo spessore.</li>
	<li>Coperture con rivestimento camerato con 100 lL di poli-L-lysine (100 g/mL).</li>
	<li>Il giorno successivo, lavare due volte i coperture con camera con salina sterile tamponata al fosfato (PBS).</li>
	<li>Per ottenere i neuroni primari del topo, isolare gli ippocampi da P1-P4<sup...

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).</li><li>Choquet, D., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+Synapse.">The Dynamic Synapse.</a> Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Aspects+of+CNS+Synapse+Formation.">Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).</li><li>Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Classes+of+Secreted+Synaptic+Organizers+in+the+Central+Nervous+System.">Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System.</a> Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist.">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).</li><li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses.">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).</li><li>Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+the+Inhibitory+Synapse+Organization+Using+Superresolution+Microscopy.">Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).</li><li>Yang, X., Specht, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+Domains+in+Super-Resolution+Microscopy:+The+Treachery+of+Images.">Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).</li><li>Monro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+diffraction+limit.">Beyond the diffraction limit.</a> Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).</li><li>Won, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+super-resolution.">Eyes on super-resolution.</a> Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination.">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathy:+dysfunction+of+synaptic+function.">Synaptopathy: dysfunction of synaptic function.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).</li><li>Tyebji, S., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathic+mechanisms+of+neurodegeneration+and+dementia:+Insights+from+Huntington's+disease.">Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease.</a> Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).</li><li>Won, H., Mah, W., Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorder+causes,+mechanisms,+and+treatments:+focus+on+neuronal+synapses.">Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+State+of+Synapses+in+Fragile+X+Syndrome.">The State of Synapses in Fragile X Syndrome.</a> The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).</li><li>Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+major+synaptic+signaling+pathways+involved+in+intellectual+disability.">Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability.</a> Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).</li><li>Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+dysfunction+in+prion+diseases:+a+trafficking+problem.">Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem.</a> International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).</li><li>Colnaghi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super+Resolution+Microscopy+of+SUMO+Proteins+in+Neurons.">Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., M&#246;nkem&#246;ller, V., Hennig, S., H&#252;bner, W., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-source+image+reconstruction+of+super-resolution+structured+illumination+microscopy+data+in+ImageJ.">Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ.</a> Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy.">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).</li><li>Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+microscopy:+artefact+analysis+and+reduction+utilizing+a+parameter+optimization+approach.">Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach.</a> Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).</li><li>Culley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoJ-SQUIRREL:+quantitative+mapping+and+minimisation+of+super-resolution+optical+imaging+artefacts.">NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts.</a> Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+co-localization+of+objects+in+dual-colour+confocal+images.">Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images.</a> Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander&#8217;s+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander&#8217;s overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li><li>Bolte, S., Cordeli&#232;res, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>Bae, J. R., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+neurodegenerative+diseases.">Synapses in neurodegenerative diseases.</a> BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).</li><li>Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+Approaches+for+Live+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging.</a> Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Karras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+optimization+of+reconstruction+parameters+in+structured+illumination+microscopy+-+A+practical+guide.">Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide.</a> Optics Communications. 436, 69-75 (2019).</li><li>Bereczki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+markers+of+cognitive+decline+in+neurodegenerative+diseases:+a+proteomic+approach.">Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach.</a> Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).</li><li>Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Changes+in+Synaptic+Markers+as+a+Function+of+Sleep+and+Wakefulness+in+Drosophila.">Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila.</a> Science. 324 (5923), 109-112 (2009).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander's+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li></ol>

Chiarire la struttura e la composizione della sinapsi è fondamentale per comprendere i processi fisiologici e patologici che regolano la memoria e la cognizione. Mentre nello stato normale, le sinapsi sono gli elementi costitutivi della memoria, sono anche alla base di disturbi neurologici complessi come il morbo di Alzheimer32. Il protocollo qui descritto serve a studiare la co-localizzazione delle proteine neuronali con una tecnica di microscopia super-risoluzione chiamata SIM. Utilizzando un p...

La comprensione e la visione della sinapsi è cambiata enormemente dalla sua prima descrizione da Foster e Sherrington nel 18971. Da allora, la nostra conoscenza della comunicazione neuronale e dei processi molecolari alla base è cresciuta esponenzialmente2. È diventato chiaro che le sinapsi possono essere pensate come un sistema a due compartimenti: un compartimento pre-sinaptico contenente vesciche per il rilascio di neurotrasmettitori e un compartimento post-sinaptico con recettori3. Questa visione semplicistica, negli ultimi vent'anni, si è evoluta in una complessa rete di proteine necessarie per trasdurre il legame trasmettitore nella segnalazione4.
I vantaggi nella comprensione sono in parte dovuti a tecniche di super-risoluzione che hanno superato il limite di diffrazione della microscopia leggera convenzionale per soddisfare la dimensione delle sinapsimeglio 5,6,7,8,9,10. A causa del limite di diffrazione, un microscopio ottico non può raggiungere una risoluzione superiore a 200 nmlateralmente11,12. Per aggirare questo limite, sono state create tecniche di super-risoluzione, utilizzando approcci diversi e raggiungendo diverse risoluzioni limite di sub-diffrazione: SIM, STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) e STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM raddoppia la risoluzione spaziale dei sistemi di microscopia a campo largo basati su laser inserendo una griglia di diffrazione nel percorso del fascio di eccitazione15. La grata mobile diffracts i raggi laser per creare un modello di illuminazione noto, di solito strisce. Questo modello di luce appositamente strutturato è sovrapposto alla distribuzione spaziale sconosciuta del colorante fluorescente (del campione). Le frange di interferenza formate dai due modelli codificano per dettagli fini altrimenti indistinguibili con la normale microscopia a campo largo. L'immagine finale super-risolta si ottiene combinando e decodificando con metodi matematici diverse immagini grezze dello stesso campione ottenute dalle traduzioni e rotazioni della grata di diffrazione. La risoluzione delle immagini super-risolte raggiunge i 100 nm nei 500 nm nelle direzioni assiali per 2D-SIM15 o 100 nm nei lateral e 250 nm nelle direzioni assiali per 3D-SIM16.
La nuova comprensione della sinapsi è ancora più importante alla luce dei molti disturbi neurologici in cui la disfunzione sinaptica svolge un ruolo importante nell'insorgenza e nella progressione17,18. Morbo di Alzheimer, Sindrome di Down, Morbo di Parkinson, malattie prioni, epilessia, disturbi dello spettro autistico e sindrome X fragile tra gli altri sono stati collegati ad anomalie nella composizione sinaptica, morfologia e funzione19,20,21,22.
Recentemente, utilizzando una serie di anticorpi specifici suMO, abbiamo usato la SIM per mostrare la co-localizzazione nei neuroni ippocampali primari delle proteine SUMO con i marcatori pre e post-sinaptici synaptophysin e PSD95 al livello disuper-risoluzione 23. Questo ci ha permesso di confermare la prova di microscopia biochimica e confocale della localizzazione SUMO nei neuroni.
Qui, descriviamo un protocollo per studiare la localizzazione delle proteine nei neuroni primari dell'ippocampo dei topi. Allo stesso tempo, questo protocollo può essere adattato a diversi tipi di colture neuronali primarie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue solution&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15250061</td>
			<td >Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibody SENP1</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-271360</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >17504044</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CaCl2</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >21115</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chambered coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DyLight</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (Hyclone)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SH3007002 (CHA1111L)</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow&#8211;green fluorescent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8803</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >G8769</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td>H3537</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Cystein&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MAP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AB15452</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM&#160;</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21575022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >M8266</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaOH</td>
			<td >VWR International</td>
			<td>1,091,371,000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal A</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10888022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-SIM Super Resolution Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Papain</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td >P-3125</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/Strep 10x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >15140122</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-L lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProLong Diamond Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PSD95&#160;</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>K28/43</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round coverglass</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12052712</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SUMO1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32058</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptophysin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5768&#160;</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin inhibitor&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>T9003-500MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
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super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons

Le sinapsi sono gli elementi funzionali dei neuroni e i loro difetti o perdite sono alla base di diversi disturbi neurodegenerativi e neurologici. Gli studi di imaging sono ampiamente utilizzati per studiare la loro funzione e plasticità in condizioni fisiologiche e patologiche. A causa delle loro dimensioni e struttura, gli studi di localizzazione delle proteine richiedono tecniche di imaging ad alta risoluzione. In questo protocollo, descriviamo una procedura per studiare nei neuroni primari la co-localizzazione delle proteine bersaglio con marcatori sinaptici a un livello di super-risoluzione utilizzando la microscopia ad illuminazione strutturata (SIM). La SIM è una tecnica di illuminazione a luce modellata che raddoppia la risoluzione spaziale della microscopia a campo largo, raggiungendo un dettaglio di circa 100 nm. Il protocollo indica i controlli e le impostazioni necessari per robusti studi di co-localizzazione e una panoramica dei metodi statistici per analizzare correttamente i dati di imaging.

Vi presentiamo qui il flusso di lavoro standard per studiare la co-localizzazione delle proteine neuronali. Abbiamo prima calibrato il microscopio e successivamente abbiamo eseguito l'analisi SIM dei campioni. Per calibrare il sistema, abbiamo usato microsfere fluorescenti di diametro di 0,1 m. Dopo aver ottenuto immagini 3D-SIM super-risolte delle perline, i dati dell'immagine sottostanti vengono trasformati da Fourier per convertirli nuovamente in una rappresentazione di frequenza spaziale. Nella F...

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Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Questo protocollo mostra come impiegare la microscopia super-risoluzione per studiare la co-localizzazione delle proteine nelle colture neuronali primarie.

Imaging super-risoluzione per studiare la co-localizzazione di proteine e marcatori sinaptici nei neuroni primari

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Le sinapsi sono gli elementi funzionali dei neuroni e i loro difetti o perdite sono alla base di diversi disturbi neurodegenerativi e neurologici. Gli studi di imaging sono ampiamente utilizzati per indagare la loro funzione e plasticità in condizioni fisiologiche e patologiche. A causa delle loro dimensioni e struttura, gli studi di localizzazione delle proteine richiedono tecniche di imaging ad alta risoluzione.In questo protocollo, descriviamo una procedura per studiare nei neuroni primari la co-localizzazione delle proteine bersaglio con marcatori sinaptici a livello di super-risoluzione usando la microscopia ad illuminazione strutturata. La SIM è una tecnica di illuminazione della luce a motivi geometrici che raddoppia la risoluzione spaziale della microscopia a campo largo, raggiungendo un dettaglio di circa 100 nanometri. Il protocollo indica i controlli e le impostazioni necessari per robusti studi di co-localizzazione e una panoramica dei metodi statistici per analizzare correttamente i dati di imaging.La chiave per consentire l'analisi a livello di super-risoluzione sono, tuttavia, i reagenti utilizzati durante l'acquisizione, come le coverlip a camera e le soluzioni di montaggio compatibili con l'indice di diffrazione dell'obiettivo. Per ottenere un neurone primario ippocampale del topo, isolare gli ippocampi dai cuccioli P1 a P4. Celle a piastre a 70.000 cellule per pozzo in un volume di 200 microlitri per pozzo.Attendere fino a quando i neuroni primari ippocampali sono completamente maturi da 12 a 14 giorni dopo la placcatura per eseguire studi di co-localizzazione. Aggiungere il 4% di paraformaldeide, PFA, nei microlitri PBS 200 per pozzo ai neuroni per risolverli rapidamente. Rimuovere la soluzione e incubare i campioni con albumina siere bovina all'1%, BSA, in PBS a 200 microlitri per pozzo per un'ora a temperatura ambiente per coprire passivamente tutte le superfici free-binding della piastra con una proteina irrilevante per l'analisi.Un buffer di blocco basato su BSA senza Triton X-100 riduce lo sfondo dell'anticorpo in modo più efficiente rispetto allo stesso buffer con lo 0,2%Triton X-100. Aggiungere l'anticorpo primario. Come controllo negativo, non aggiungere anticorpi primari a uno dei pozzi.Montare celle utilizzando un montante compatibile con SIM, ad esempio ProLong Glass Antifade Mountant. Coprire e proteggere le celle con un coverglass, ad esempio un coverglass rotondo con un diametro di otto millimetri.Possono essere utilizzati anche quelli quadrati. Conservare le copertine a camera a temperatura ambiente e attendere almeno 48 ore prima di acquisire le immagini. Il vetro diamanto richiede almeno due giorni di polimerizzazione prima delle acquisizioni di super-risoluzione.Utilizzare due strategie per garantire la specificità degli anticorpi. Il primo è l'uso di almeno due anticorpi diversi che prendono di mira lo stesso substrato. La seconda strategia è la neutralizzazione degli anticorpi mediante incubazione con il bersaglio proteico purificato, o l'usato per sollevare l'anticorpo.Utilizziamo regolarmente un microscopio a super risoluzione N-SIM prodotto da Nikon per la nostra analisi. Le istruzioni che seguono devono essere destinate all'acquisizione di immagini SIM indipendentemente dal microscopio d'uso. È anche importante massimizzare le prestazioni del microscopio per eseguire una calibrazione accurata degli strumenti, tra cui anello di correzione, allineamento laser e messa a fuoco del blocco di griglia.Prima dell'acquisizione delle immagini SIM, il sistema richiede una calibrazione adeguata con specifiche perline fluorescenti di dimensioni sotto-risoluzione. Un esempio sono le microsfere di TetraSpeck. Queste perline sono macchiate con diversi coloranti fluorescenti per consentire la calibrazione di diversi laser con un campione.In un bagno d'acqua, sonicare circa 1,8 volte 10 fino all'8 ° microsfere fluorescenti per 10 minuti. Diluire le microsfere fluorescenti una su 500 in acqua distillata doppia. Sonicare una seconda volta per altri 10 minuti.Pipetta 15 microlitri delle perline diluite in un pozzo di un coperchio a camera. Lasciare asciugare la soluzione per cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 10 microlitri della soluzione di montaggio, ad esempioProLong Glass e posizionare un coverslip di otto millimetri sopra. Attendere almeno 48 ore per consentire una corretta polimerizzazione. Accendi il microscopio e i laser.Lasciare riscaldare il sistema per raggiungere l'equilibrio termico di tutti i componenti del microscopio e il sistema di microscopio sim a super risoluzione richiede almeno tre ore. Selezionare l'obiettivo 100X. Avviare la calibrazione allineando i laser al centro del blocco di retiatura di diffrazione.Nel sistema N-SIM, una manopola del micrometro e una telecamera dedicata consentono di centrare i fasci di luce al bersaglio. Inserire la coverslip a camera del microscopio per la visualizzazione. Impostate il sistema allo spessore del coperchio camerato regolando il coperchio di correzione obiettivo.NIS Software, il software proprietario dotato di sistemi al microscopio a super risoluzione N-SIM, ha una funzione automatica per regolare la correzione dei colori. Regola la messa a fuoco del blocco di griglia per ogni canale per garantire un'illuminazione strutturata focalizzata del modello sul campione. Il software fornisce una funzione automatica per questa attività.Acquisisci immagini SIM 3D grezze delle microsfere multicolore. Calcola per ogni lunghezza d'onda separata la trasformata di Fourier dell'immagine super risolta. Se l'immagine trasformata non riesce a ottenere un modello corretto simile a un fiore, riavviare la calibrazione poiché la super-risoluzione non è stata raggiunta.Nell'immagine super-risolta, selezionare una singola microsfera e calcolarne il profilo di intensità per ogni canale per misurare la risoluzione raggiunta. Ora dovrebbe essere vicino a 100 nanometri lateralmente. Eseguire la registrazione del canale sovrapponendo un'acquisizione multicanale delle microsfere.L'obiettivo è quello di collimare tutti i segnali del canale lateralmente e assialmente. Ciò eliminerà le aberrazioni cromatiche dovute al disallineamento dei diversi canali e aiuterà l'analisi di co-localizzazione. Conferma la qualità della calibrazione utilizzando il passo della fase di illuminazione delle funzioni e la messa a fuoco modellata dell'illuminazione di SIMcheck, una suite di plugin per l'applicazione open source ImageJ.Inizia ad analizzare il campione usando un obiettivo 40X in modalità confocale o widefield. Ciò consente la navigazione del campione, mantenendo buoni dettagli e un ampio campo visivo. Utilizzare il segnale anticorpale MAP2 per rilevare un'area che rappresenta i processi neuronali.Acquisire immagini del campione in modalità confocale per determinare la qualità della colorazione. Passare all'obiettivo 100X. Applicare l'olio all'obiettivo 100X.Acquisire un'immagine widefield o confocal che verrà utilizzata in seguito per valutare la qualità dell'immagine super risolta. Passare alla modalità SIM 3D. Utilizzando le finestre di dialogo per impostare i parametri per l'acquisizione, selezionare l'impostazione di profondità di bit più alta disponibile per massimizzare le informazioni sul colore.In genere, 16 bit è la scelta standard. Inoltre, per migliorare il rapporto segnale-rumore, selezionare un valore a bassa frequenza per l'acquisizione, ad esempio un megahertz. Utilizzando le finestre dell'istogramma, impostare la potenza laser per ottenere una risposta lineare del segnale per evitare la perdita di informazioni, limitare i pixel saturi nelle immagini.Il sistema N-SIM utilizza una telecamera Andor iXon3. Quando si lavora a 16 bit, scegliere un'intensità target di 16.000 per garantire la risposta lineare della fotocamera. In alternativa, scegli un intervallo compreso tra 30.000 e 45.000 per massimizzare la gamma dinamica delle acquisizioni.Impostare la potenza del laser tra lo 0,1% e il 50% durante l'imaging dei campioni e i tempi di esposizione tra 50 millisecondi e due secondi. Potenze laser superiori al 50% possono causare un rapido fotobleaching dei fluorofori in uso. Inizia ad acquisire le immagini in modalità SIM 3D.Utilizza SIMcheck, una suite di plugin gratuiti per ImageJ, per valutare la qualità delle acquisizioni delle immagini grezze. Se SIMcheck non rileva artefatti o problemi di qualità, acquisire almeno 10 immagini da repliche tecniche complete per consentire l'analisi statistica. Le immagini acquisite sono dati grezzi che devono essere elaborati per ottenere immagini SIM ricostruite che verranno utilizzate per ulteriori analisi.Nel protocollo, suggeriamo di utilizzare synaptophysin e PSD-95 come marcatori pre e post sinaptici. È tuttavia possibile utilizzare marcatori aggiuntivi. Un enorme corpus di letteratura supporta l'uso di altre proteine, come la drebrina e il fagotto come marcatori sinaptici.Le immagini acquisite dalla SIM 3D sono immagini grezze che devono essere elaborate per ottenere immagini super risolte ricostruite. Una ricostruzione errata delle immagini non elaborati può portare a artefatti che influenzerebbero l'analisi dei campioni. Occorre pertanto prestare grande attenzione alla corretta scelta dei parametri di ricostruzione.Elaborare le immagini non elaborati utilizzando il software di analisi della ricostruzione al microscopio per ottenere un'immagine super risolta. In alternativa, utilizza un fairSIM del plugin ImageJ liberamente disponibile per ricostruire le immagini grezze. Calcola la trasformata di Fourier delle immagini super risolte utilizzando il software di ricostruzione del microscopio o il plug-in ImageJ SIMcheck.Una buona immagine ricostruita dovrebbe restituire, per ogni canale, un'immagine simile a un fiore. Se le immagini ricostruite non riescono a ricreare una forma simile a un fiore, riavviare dalle immagini non elaborati e ricostruirle modificando i parametri di ricostruzione, ad esempio il filtraggio lineare, l'apodizzazione e la soppressione dell'ordine zero. Nel software NIS che utilizza l'anteprima per monitorare in che modo la modifica dei parametri influisce sull'immagine risolta finale, modificare il contrasto di modulazione dell'illuminazione del parametro, la soppressione del rumore ad alta risoluzione e la soppressione della messa a fuoco.Analizza l'immagine ricostruita per rilevare in modo imparziale gli artefatti utilizzando NanoJ-SQUIRREL, un plugin basato su ImageJ, per valutare la qualità delle immagini super risolte. Nella nostra analisi della co-localizzazione, abbiamo usato due approcci. Il primo è un approccio visivo basato sull'analisi del profilo che mostra singoli eventi di co-localizzazione e che identifica il contributo di ogni canale.Come primo passo per studiare la co-localizzazione tra marcatori sinaptici e una proteina di interesse, prendi un'immagine super risolta e analizza un singolo locus per determinare la sovrapposizione del segnale. Identifica un singolo locus sull'immagine super risolta. Ottenere i profili di intensità dei segnali fluorescenti al luogo di interesse.Se l'analisi del profilo ha suggerito la co-localizzazione del singolo locus, un'analisi più generale dell'intera immagine può essere effettuata calcolando i coefficienti di Pearson e Mander. Usa JACoP, un plugin ImageJ, per determinare due parametri di co-localizzazione, Pearson's e Mander's. Dopo aver calibrato il sistema e valutato la qualità delle immagini ricostruite, abbiamo iniziato ad analizzare le colture neuronali primarie macchiate con un anticorpo contro MAP2, un marcatore neuronale, PSD-95, un marcatore postinaptico e la nostra proteina bersaglio SUMO1.Per prima cosa abbiamo analizzato il campione eseguendo la microscopia confocale a quattro canali con un obiettivo 40X. Dopo aver selezionato un'area che rappresenta i processi neuronali, siamo passati a un obiettivo 100X. Abbiamo acquisito immagini sia confocali che SIM della stessa area per valutare la qualità della ricostruzione con NanoJ-SQUIRREL ed eseguire analisi di co-localizzazione.Chiarire la struttura e la composizione della sinapsi è fondamentale per la comprensione dei processi fisiologici e patologici che regolano la memoria e la cognizione. Mentre in stato normale le sinapsi sono gli elementi costitutivi della memoria, sono anche alla base di complessi disturbi neurologici, come una delle forme più comuni di demenza morbo di Alzheimer. Il protocollo qui descritto consente lo studio della composizione proteica delle sinapsi con una tecnica di microscopia a super risoluzione chiamata microscopia ad illuminazione strutturata.

Research

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Neuroscience

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