Name: super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons
Uploaded: 2020-10-31T15:00:00
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著者らは、原稿の建設的な批判のためにエドアルド・ミオッティに感謝したいと思います。この研究は、ブライトフォーカスA2019296F、フォンド・ディ・ベネフィチェンツァ - グルッポ・インテッサ・サンパオロ(LC)、フォンダツィオーネ・リージョネージュ・パー・ラ・リセルカ・バイオメディカ(Care4NeuroRare CP_20/2018)(CN)、マリー・スウォドフスカ・キュリー・イノベーティブ・トレーニング・ネットワーク(JK)によって支援されました。

1. 主要文化
<ol><li>#1.5(0.17 mm)のカバースリップ厚さの客観的要件に一致するチャンバーカバーリップ(イビディμスライド8ウェルまたはNunc Lab-Tekチャンバードカバーグラスなど)における培養マウス海馬主要ニューロン。</li>
	<li>ポリL-リジン(100 μg/mL)の100 μLのカバースリップをコーティング。</li>
	<li>翌日、チャンバー付きのカバーリップを滅菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で2回洗います。</li>
	...

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).</li><li>Choquet, D., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+Synapse.">The Dynamic Synapse.</a> Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Aspects+of+CNS+Synapse+Formation.">Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).</li><li>Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Classes+of+Secreted+Synaptic+Organizers+in+the+Central+Nervous+System.">Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System.</a> Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist.">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).</li><li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses.">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).</li><li>Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+the+Inhibitory+Synapse+Organization+Using+Superresolution+Microscopy.">Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).</li><li>Yang, X., Specht, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+Domains+in+Super-Resolution+Microscopy:+The+Treachery+of+Images.">Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).</li><li>Monro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+diffraction+limit.">Beyond the diffraction limit.</a> Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).</li><li>Won, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+super-resolution.">Eyes on super-resolution.</a> Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination.">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathy:+dysfunction+of+synaptic+function.">Synaptopathy: dysfunction of synaptic function.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).</li><li>Tyebji, S., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathic+mechanisms+of+neurodegeneration+and+dementia:+Insights+from+Huntington's+disease.">Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease.</a> Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).</li><li>Won, H., Mah, W., Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorder+causes,+mechanisms,+and+treatments:+focus+on+neuronal+synapses.">Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+State+of+Synapses+in+Fragile+X+Syndrome.">The State of Synapses in Fragile X Syndrome.</a> The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).</li><li>Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+major+synaptic+signaling+pathways+involved+in+intellectual+disability.">Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability.</a> Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).</li><li>Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+dysfunction+in+prion+diseases:+a+trafficking+problem.">Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem.</a> International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).</li><li>Colnaghi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super+Resolution+Microscopy+of+SUMO+Proteins+in+Neurons.">Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., M&#246;nkem&#246;ller, V., Hennig, S., H&#252;bner, W., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-source+image+reconstruction+of+super-resolution+structured+illumination+microscopy+data+in+ImageJ.">Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ.</a> Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy.">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).</li><li>Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+microscopy:+artefact+analysis+and+reduction+utilizing+a+parameter+optimization+approach.">Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach.</a> Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).</li><li>Culley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoJ-SQUIRREL:+quantitative+mapping+and+minimisation+of+super-resolution+optical+imaging+artefacts.">NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts.</a> Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+co-localization+of+objects+in+dual-colour+confocal+images.">Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images.</a> Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander&#8217;s+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander&#8217;s overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li><li>Bolte, S., Cordeli&#232;res, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>Bae, J. R., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+neurodegenerative+diseases.">Synapses in neurodegenerative diseases.</a> BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).</li><li>Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+Approaches+for+Live+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging.</a> Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Karras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+optimization+of+reconstruction+parameters+in+structured+illumination+microscopy+-+A+practical+guide.">Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide.</a> Optics Communications. 436, 69-75 (2019).</li><li>Bereczki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+markers+of+cognitive+decline+in+neurodegenerative+diseases:+a+proteomic+approach.">Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach.</a> Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).</li><li>Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Changes+in+Synaptic+Markers+as+a+Function+of+Sleep+and+Wakefulness+in+Drosophila.">Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila.</a> Science. 324 (5923), 109-112 (2009).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander's+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li></ol>

シナプスの構造と組成を解明することは、記憶と認知を調節する生理学的および病理学的プロセスを理解するために重要である。正常な状態にある間、シナプスは記憶の構成要素であり、アルツハイマー病32のような複雑な神経疾患の根源でもある。ここで説明するプロトコルは、SIMと呼ばれる超解像顕微鏡技術を用いて神経タンパク質の共局在化を研究するのに役立つ。?...

シナプスの理解と見解は、フォスターとシェリントンによる1897年の最初の記述以来、大きく変わりました。それ以来、神経伝達の知識とその背後にある分子プロセスは指数関数的に成長しました 2.シナプスは、2コンパートメントシステムとして考えることができることが明らかになりました:神経伝達物質の放出のための小胞を含むシナプス前コンパートメントと受容体3を有するシナプス後コンパートメント。この単純な見解は、過去20年間で、トランスミッタ結合をシグナル4に変換するために必要なタンパク質の複雑なネットワークに進化した。
理解の利益は、シナプスの次元に合わせて従来の光顕微鏡の回折限界を克服した超解像技術による部分565、6、7、8、9、10。,7,8,9,10,回折限界のため、光学顕微鏡は横11,12,12を超える解像度に達することができない。この限界を回避するために、異なるアプローチを使用して、異なる回折限界解像度に達する超解像技術が作成されました:SIM、STED(刺激放出枯渇顕微鏡)、PALM(光活性化局在化顕微鏡)およびSTORM(確率的光学再構成顕微鏡)13、14。13,SIMは、励起ビーム経路15に回折格子を挿入することにより、レーザーベースの広視野顕微鏡システムの空間分解能を倍増する。可動格子は、レーザービームを回折して、既知の照明パターン(通常はストライプ)を作成します。この意図的に構成された光パターンは、蛍光色素(試料の)の未知の空間分布に重ね合わされる。2つのパターンによって形成された干渉縞は、通常の広視野顕微鏡法で区別できない細かい細部を符号化する。最終的な超解決画像は、回折格子の移動と回転によって得られた同じサンプルのいくつかの生画像を数学的方法で組み合わせてデコードすることによって得られます。超解決画像の解像度は、側面で100nm、横方向の軸方向で500nm、横方向では150nm、3D-SIM16の軸方向では250nmに達する。16
シナプスの新しい理解は、シナプス機能障害が発症と進行に大きな役割を果たす多くの神経疾患の観点からさらに重要である17,,18.アルツハイマー病は、ダウン症、パーキンソン病、プリオン病、てんかん、自閉症スペクトラム障害および脆弱X症候群の中でもシナプス組成物、形態および機能19、20、21、22,の異常に関連している19,。21,22
最近では、一連のSUMO特異的抗体を用いて、SIMを用いて、SYNOタンパク質の一次海馬ニューロンにおけるシナプトフィシン前および事後マーカーシナプトフィシンおよびPSD95を超分解能レベル23で共局在化させた。これにより、ニューロンにおけるSUMOの局在化の生化学的および共焦点的な顕微鏡の証拠を確認することができました。
ここでは、マウス海馬の一次ニューロンにおけるタンパク質の局在を研究するプロトコルについて述べている。同時に、このプロトコルは、異なるタイプの主要な神経細胞培養に適応され得る。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue solution&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15250061</td>
			<td >Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibody SENP1</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-271360</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >17504044</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CaCl2</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >21115</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chambered coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DyLight</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (Hyclone)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SH3007002 (CHA1111L)</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow&#8211;green fluorescent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8803</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >G8769</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td>H3537</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Cystein&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MAP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AB15452</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM&#160;</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21575022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >M8266</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaOH</td>
			<td >VWR International</td>
			<td>1,091,371,000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal A</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10888022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-SIM Super Resolution Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Papain</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td >P-3125</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/Strep 10x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >15140122</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-L lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProLong Diamond Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PSD95&#160;</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>K28/43</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round coverglass</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12052712</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SUMO1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32058</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptophysin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5768&#160;</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin inhibitor&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>T9003-500MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons

シナプスはニューロンの機能要素であり、その欠陥または損失はいくつかの神経変性疾患および神経疾患の基礎にある。画像化研究は、生理学的および病理学的状態におけるその機能および可塑性を調べるのに広く使用されている。タンパク質のサイズと構造のため、タンパク質のローカリゼーション研究には高解像度イメージング技術が必要です。本プロトコルでは、構造化された照明顕微鏡(SIM)を用いて、シナプスマーカーを用いた標的タンパク質のシナプスマーカーとの共局在化を一次ニューロンで研究する手順を説明する。SIMは、広視野顕微鏡の空間分解能を2倍にするパターン光照明技術で、約100nmのディテールに達します。このプロトコルは、堅牢な共局化研究に必要な制御と設定、およびイメージングデータを適切に分析するための統計的手法の概要を示します。

ここでは、神経タンパク質の共局在化を研究するための標準的なワークフローを紹介します。まず顕微鏡を校正し、次にサンプルのSIM分析を行いました。システムの較正のために、直径0.1μmの蛍光微小球を用いた。ビーズの超解決 3D-SIM 画像を取得すると、基になる画像データはフーリエ変換されて空間周波数表現に変換されます。 図2Aでは、明確な花のパターンは、?...

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Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

このプロトコルは、一次神経細胞培養におけるタンパク質の共局在化を研究するために超解像顕微鏡を採用する方法を示す。

一次ニューロンにおけるタンパク質とシナプスマーカーの共局在化を研究する超分解能イメージング

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

シナプスはニューロンの機能要素であり、その欠陥または損失はいくつかの神経変性疾患および神経疾患の基礎にある。画像化研究は、生理学的および病理学的状態におけるその機能および可塑性を調べるのに広く使用されている。タンパク質のサイズと構造のため、タンパク質のローカリゼーション研究には高解像度イメージング技術が必要です。本プロトコルでは、構造化された照明顕微鏡を用いて、シナプスマーカーを用いた標的タンパク質のシナプスマーカーの共局在化を一次ニューロンで研究する手順を説明する。SIMは、広視野顕微鏡の空間分解能を2倍にするパターン化された光照明技術で、約100ナノメートルのディテールに達します。このプロトコルは、堅牢な共局化研究に必要な制御と設定、およびイメージングデータを適切に分析するための統計的手法の概要を示します。しかし、超解像レベルで解析を可能にする鍵は、チャンバーカバーリップや目的の回折指数と互換性のある取り付けソリューションなど、取得中に使用される試薬です。マウス海馬の一次ニューロンを得るために、P1からP4子犬に海馬を分離する。プレート細胞はウェルあたり200マイクロリットルの体積でウェルあたり70,000細胞当たり。海馬の一次ニューロンが完全に成熟するまで待ちます 12 から 14 共局在の研究を実行するためにメッキ後 12 〜 14 日.4%パラホルムアルデヒド、PFA、PBSで200マイクロリットルをニューロンに加え、迅速に固定します。溶液を取り除き、PBSで1%ウシ血清アルブミン、BSA、PBSで室温で1時間、PBSでサンプルをインキュベートし、分析のために無関係なタンパク質でプレートのすべての自由結合表面を受動的に覆います。トリトンX-100のないBSAベースのブロッキングバッファーは、0.2%Triton X-100と同じバッファーよりも効率的に抗体の背景を減少させます。一次抗体を追加します。陰性対照として、一次抗体を一つのウェルに添加しないでください。SIM対応のマウントを使用してセルをマウントします(例えばProLongグラスアンチフェードマウンタント)。例えば、直径8ミリメートルの丸いカバーグラスなど、カバーグラスで細胞を覆い保護します。正方形のものも使用できます。室温でチャンバーカバーリップを保存し、画像を取得する前に少なくとも48時間待ちます。ダイヤモンドグラスは、超分解能の獲得前に少なくとも2日間の硬化を必要とします。抗体特異性を保証するために2つの戦略を使用してください。第1の1つは、同じ基質を標的とする少なくとも2つの異なる抗体を用いる。第2の戦略は、精製タンパク質標的とのインキュベーションによる抗体中和、または抗体を上昇させるために使用される抗体です。ニコン製のN-SIM超分解能顕微鏡を解析に日常的に使用しています。以下の手順は、使用顕微鏡とは無関係にSIM画像を取得することを目的としています。また、補正リング、レーザーアライメント、グレーティングブロックの焦点合わせなど、機器の正確なキャリブレーションを実行するために、顕微鏡の性能を最大限に高めることも重要です。SIM画像を取得する前に、システムは特定のサブ解像度サイズの蛍光ビーズを適切にキャリブレーションする必要があります。例としては、テトラスペック微小球があります。これらのビーズは、1つのサンプルで異なるレーザーのキャリブレーションを可能にするために、異なる蛍光色素で染色されています。水浴では、10分の8番目の蛍光微小球に1.8回程度超音波処理します。蛍光微小球を500分の1に希釈し、二重蒸留水で使用します。さらに10分間2回目のソニッケートを行います。希釈されたビーズのピペット15マイクロリットルは、チャンバーカバースリップの井戸に入った。溶液を室温で5分間乾燥させます。取り付け溶液の10マイクロリットルを追加します。ProLongグラス、上に8ミリメートルのカバースリップを置きます。適切な硬化を可能にするために少なくとも48時間待ちます。顕微鏡とレーザーをオンにします。システムがすべての顕微鏡コンポーネントの熱平衡に達するために暖かくさせ、SIM超解像顕微鏡システムは少なくとも3時間を必要とします。100X の目標を選択します。レーザーを回折格子ブロックの中心に合わせて調整を開始します。N-SIMシステムでは、マイクロメーターノブと専用カメラを使用して、光線をターゲットにセンタリングできます。顕微鏡のチャンバーカバースリップを挿入して、観察します。客観的な補正カバーを調整することにより、チャンバーカバースリップの厚さにシステムを設定します。NISソフトウェアは、N-SIM超解像顕微鏡システムで提供される独自のソフトウェアで、色の補正を調節する自動機能を備えています。各チャンネルのグレーティングブロックフォーカスを調整して、サンプルに焦点を合わせて構造化されたパターン照明を確保します。ソフトウェアは、このタスクの自動機能を提供します。多色微小球の生の3D SIM画像を取得します。超分解画像のフーリエ変換を別々の波長ごとに計算します。変換された画像が正しい花のようなパターンを得られない場合は、超解像度が達成されていないので、キャリブレーションを再開します。超解決イメージでは、1 つのマイクロスフィアを選択し、各チャネルの強度プロファイルを計算して、達成した解像度を測定します。それは今横に100ナノメートルに近いはずです。マイクロスフィアのマルチチャンネル集録をオーバーレイして、チャンネル登録を行います。目標は、すべてのチャンネル信号を横に、軸に合致することです。これは異なったチャネルのずれによる色収差を除去し、共局在分析を助ける。オープンソースアプリケーションImageJのためのプラグインのスイートであるSIMcheckの機能照明段階ステップと照明パターンフォーカスを使用してキャリブレーションの品質を確認します。共焦点またはワイドフィールドモードで40Xの目的を使用してサンプルの分析を開始します。これにより、サンプルのナビゲーションが可能になり、良好な詳細と大きな視野を維持できます。MAP2抗体シグナルを使用して、ニューロンプロセスを表す領域を検出します。共焦点モードでサンプルの画像を取得し、染色の品質を決定します。目的 100X に切り替えます。100Xの目的に油を適用します。超解決イメージの品質を評価するために後で使用されるワイドフィールドまたは共焦点イメージを取得します。3D SIM モードに切り替えます。ダイアログ ウィンドウを使用して取得するパラメーターを設定し、色情報を最大化するために使用可能な最高のビット深度設定を選択します。通常、16 ビットが標準の選択肢です。また、信号対雑音比を向上させるために、1メガヘルツなどの低周波値を選択して取得します。ヒストグラムウィンドウを使用して、レーザーパワーを設定して、情報の損失を避けるために信号の線形応答を得、画像内の飽和ピクセルを制限します。N-SIMシステムは、アンドーiXon3カメラを使用しています。16 ビットで作業する場合は、カメラの線形応答を確保するために、目標の強度 16,000 を選択します。または、30,000~45,000の範囲を選択して、集録のダイナミックレンジを最大化します。サンプルをイメージングする場合はレーザーパワーを0.1%~50%、露光時間を50ミリ秒から2秒に設定します。50%を超えるレーザーパワーは、使用中の蛍光色素の急速な光の漂白を引き起こす可能性があります。3D SIMモードで画像の取得を開始します。SIMcheck、ImageJ用の無料プラグインのスイートを使用して、生画像の取得の品質を評価します。SIMcheck がアーティファクトや品質の問題を検出しない場合は、統計分析を可能にするために、完全な技術複製から最低 10 個の画像を取得します。取得した画像は、さらなる分析に使用される再構築されたSIM画像を取得するために処理する必要がある生データです。プロトコルでは、シナプトフィシンとPSD-95をシナプス前および後シナプスマーカーとして使用することを提案する。ただし、追加のマーカーを使用できます。巨大な文献体は、シナプスマーカーとしてのデブリンやファゴットなどの他のタンパク質の使用をサポートしています。3D SIM取得画像は、再構成された超解決画像を取得するために処理する必要がある生の画像です。生画像の誤った再構成は、サンプルの分析に影響を与えるアーティファクトにつながる可能性があります。したがって、再構成パラメータを適切に選択するには、大きな注意を払う必要があります。顕微鏡再構成解析ソフトウェアを用いて生画像を処理し、超解決画像を得る。あるいは、自由に利用できる ImageJ プラグイン fairSIM を使用して、生のイメージを再構築します。顕微鏡再構成ソフトウェアまたは ImageJ プラグイン SIMcheck を使用して、超解決画像のフーリエ変換を計算します。良い再構築された画像は、各チャンネルのために、花のような画像を返す必要があります。再構築されたイメージで花のような形状を再現できない場合は、生の画像から再開し、リニア フィルタリング、アポダイゼーション、ゼロ オーダー抑制などの再構築パラメータを変更して再構築します。NISソフトウェアでは、プレビューを使用してパラメータの変更が最終的な解決されたイメージに与える影響を監視し、パラメータの照明変調コントラスト、高解像度ノイズ抑制、および焦点外抑制を変更します。再構築された画像を解析し、ImageJベースのプラグインNanoJ-SQUIRRELを使用して、超解決画像の品質を評価することで、アーチファクトを公平に検出します。共局在化の分析では、2つのアプローチを用いた。1 つ目は、共同ローカリゼーションの単一イベントを示し、各チャネルの貢献度を識別するプロファイル分析に基づく視覚的アプローチです。シナプスマーカーと目的タンパク質の共同局在化を研究する最初のステップとして、超分解画像を取り、単一の軌跡を分析してシグナルの重複を判断します。超解決画像上の単一の軌跡を識別します。目的の軌跡に蛍光シグナルの強度プロファイルを取得します。プロファイル分析で単一の遺伝子座の共局在化が示唆されている場合、ピアソンとマンダーの係数を計算することで、画像全体のより一般的な分析を行うことができます。JaCoP、ImageJプラグインを使用して、共局化の2つのパラメータ、ピアソンとマンダーのパラメータを決定します。システムを較正し、再構築された画像の品質を評価した後、MAP2、ニューロンマーカー、PSD-95、ポストナプティックマーカー、および標的タンパク質SUMO1に対する抗体で染色された主要な神経細胞培養の分析を開始しました。まず、40Xの目的で4チャンネル共焦点顕微鏡を行うサンプルを分析しました。神経のプロセスを表す領域を選択すると、100Xの目標に切り替えました。同じ領域の共焦点画像とSIM画像を両方取得し、NanoJ-SQUIRRELで再構築の質を評価し、共局在解析を行いました。シナプスの構造と組成を解明することは、記憶と認知を調節する生理学的および病理学的プロセスの両方を理解するために重要である。正常な状態ではシナプスは記憶の構成要素であるが、それらはまた、認知症アルツハイマー病の最も一般的な形態の一つのような複雑な神経疾患の基礎にある。ここで説明するプロトコルは、構造化照明顕微鏡法と呼ばれる超解像顕微鏡技術を用いたシナプスのタンパク質組成の研究を可能にする。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションショウジョウバエ末梢ニューロン

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

培養神経細胞における膜タンパク質の側方拡散とエキソサイトーシスは、蛍光回復と蛍光損失光退色を用いて評価

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

イメージング初代培養マウス神経細胞における形質膜に受容体の挿入をpHluorinタグ付き

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

神経高密度コア小胞の超解像イメージング

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

一次ニューロンにおける量子ドットで標識されたBDNFの軸索輸送のリアルタイムイメージング

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

培養海馬神経細胞のシナプス小胞エンドサイトーシスを測定

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

神経細胞死とマウス プライマリ小脳顆粒ニューロンの変性をモデリング

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

シナプス小胞の培養神経細胞シナプス蛋白質の過剰発現でリサイクルのため光アッセイ

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...