Name: super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons
Uploaded: 2020-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke Edoardo Micotti for konstruktiv kritikk av manuskriptet. Denne studien ble støttet av BrightFocus A2019296F, av Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), av Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) og av Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (JK).

1. Primærkulturer
<ol><li>Kultur mus hippocampal primære nevroner i kamret dekkerlips (som Ibidi μ-Slide 8 Vel eller Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) som samsvarer med det objektive kravet for #1,5 (0,17 mm) dekkslip tykkelse.</li>
	<li>Coat kamret dekkslips med 100 μL poly-L-lysin (100 μg / ml).</li>
	<li>Neste dag vasker du de kamrede dekkglassene to ganger med steril fosfatbufret saltvann (PBS).</li>
	<li>For å oppnå musen primære nevroner, isolere hippocampi fra P1-P4 valper23.</li...

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).</li><li>Choquet, D., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+Synapse.">The Dynamic Synapse.</a> Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Aspects+of+CNS+Synapse+Formation.">Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).</li><li>Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Classes+of+Secreted+Synaptic+Organizers+in+the+Central+Nervous+System.">Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System.</a> Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist.">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).</li><li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses.">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).</li><li>Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+the+Inhibitory+Synapse+Organization+Using+Superresolution+Microscopy.">Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).</li><li>Yang, X., Specht, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+Domains+in+Super-Resolution+Microscopy:+The+Treachery+of+Images.">Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).</li><li>Monro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+diffraction+limit.">Beyond the diffraction limit.</a> Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).</li><li>Won, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+super-resolution.">Eyes on super-resolution.</a> Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination.">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathy:+dysfunction+of+synaptic+function.">Synaptopathy: dysfunction of synaptic function.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).</li><li>Tyebji, S., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathic+mechanisms+of+neurodegeneration+and+dementia:+Insights+from+Huntington's+disease.">Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease.</a> Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).</li><li>Won, H., Mah, W., Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorder+causes,+mechanisms,+and+treatments:+focus+on+neuronal+synapses.">Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+State+of+Synapses+in+Fragile+X+Syndrome.">The State of Synapses in Fragile X Syndrome.</a> The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).</li><li>Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+major+synaptic+signaling+pathways+involved+in+intellectual+disability.">Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability.</a> Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).</li><li>Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+dysfunction+in+prion+diseases:+a+trafficking+problem.">Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem.</a> International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).</li><li>Colnaghi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super+Resolution+Microscopy+of+SUMO+Proteins+in+Neurons.">Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., M&#246;nkem&#246;ller, V., Hennig, S., H&#252;bner, W., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-source+image+reconstruction+of+super-resolution+structured+illumination+microscopy+data+in+ImageJ.">Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ.</a> Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy.">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).</li><li>Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+microscopy:+artefact+analysis+and+reduction+utilizing+a+parameter+optimization+approach.">Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach.</a> Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).</li><li>Culley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoJ-SQUIRREL:+quantitative+mapping+and+minimisation+of+super-resolution+optical+imaging+artefacts.">NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts.</a> Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+co-localization+of+objects+in+dual-colour+confocal+images.">Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images.</a> Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander&#8217;s+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander&#8217;s overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li><li>Bolte, S., Cordeli&#232;res, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>Bae, J. R., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+neurodegenerative+diseases.">Synapses in neurodegenerative diseases.</a> BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).</li><li>Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+Approaches+for+Live+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging.</a> Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Karras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+optimization+of+reconstruction+parameters+in+structured+illumination+microscopy+-+A+practical+guide.">Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide.</a> Optics Communications. 436, 69-75 (2019).</li><li>Bereczki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+markers+of+cognitive+decline+in+neurodegenerative+diseases:+a+proteomic+approach.">Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach.</a> Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).</li><li>Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Changes+in+Synaptic+Markers+as+a+Function+of+Sleep+and+Wakefulness+in+Drosophila.">Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila.</a> Science. 324 (5923), 109-112 (2009).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander's+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li></ol>

Belyse strukturen og sammensetningen av synapsen er avgjørende for å forstå de fysiologiske og patologiske prosessene som regulerer hukommelse og kognisjon. Mens de er i normal tilstand, synapser er byggesteinene i minnet, de ligger også til grunn for komplekse nevrologiske lidelser som Alzheimers sykdom32. Protokollen som er beskrevet her tjener til å studere co-lokalisering av nevronale proteiner med en superoppløsning mikroskopi teknikk kalt SIM. Ved hjelp av et bestemt belysningsmønster...

Forståelsen og synet av synapse har endret seg enormt siden den første beskrivelsen av Foster og Sherrington i 18971. Siden da har vår kunnskap om nevronal kommunikasjon og de molekylære prosessene bak den vokst eksponentielt2. Det har blitt klart at synapser kan tenkes som et to-roms system: et pre-synaptisk rom som inneholder vesikler for frigjøring av nevrotransmittere og et postsynaptisk rom medreseptorer 3. Dette forenklede synet har de siste tjue årene utviklet seg til et komplekst nettverk av proteinene som kreves for å transdusere senderbinding til å signalisere4.
Gevinsten i forståelsen skyldes delvis superoppløsningsteknikker som overvant diffraksjonsgrensen for konvensjonell lett mikroskopi som passer dimensjonen av synapser bedre5,,6,,7,,8,,9,,10. På grunn av diffraksjonsgrensen kan ikke et optisk mikroskop nå en oppløsning over 200 nm side11,,12. For å omgå denne grensen ble det opprettet superoppløsningsteknikker ved hjelp av ulike tilnærminger og når forskjellige sub-diffraksjonsgrenseoppløsninger: SIM, STED (Stimulert utslippsdeplesjonsmikroskopi), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) og STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM dobler den romlige oppløsningen av laserbaserte bredfelts mikroskopisystemer ved å sette inn en diffraksjonsrist i eksitasjonsstrålebanen15. Den bevegelige risten diffracts laserstrålene for å skape et kjent belysningsmønster, vanligvis striper. Dette med hensikt strukturerte lysmønsteret er lagt over til den ukjente romlige fordelingen av fluorescerende fargestoff (av prøven). Interferenskantene dannet av de to mønstrene koder for ellers umulige fine detaljer med normal bredfeltmikroskopi. Det endelige super-løst bildet oppnås ved å kombinere og dekoding med matematiske metoder flere råbilder av samme prøve oppnådd av oversettelser og rotasjoner av diffraksjonsristet. Oppløsningen av super-løst bilder når 100 nm i lateral og 500 nm i aksial retninger for 2D-SIM15 eller 100 nm i sideveis og 250 nm i aksial retninger for 3D-SIM16.
Den nye forståelsen av synapsen er enda viktigere i lys av de mange nevrologiske lidelsene der synaptisk dysfunksjon spiller en viktig rolle i utbruddet ogprogresjon 17,18. Alzheimers sykdom, Down syndrom, Parkinsons sykdom, prion sykdommer, epilepsi, autisme spektrum lidelser og skjøre X syndrom blant annet har vært knyttet til abnormiteter i synaptisk sammensetning, morfologiog funksjon 19,20,21,22.
Nylig, ved hjelp av et sett med SUMO-spesifikke antistoffer, brukte vi SIM til å vise co-lokalisering i primære hippocampal nevroner av SUMO proteiner med pre- og post-synaptiske markører synaptophysin og PSD95 på superoppløsningnivå 23. Dette gjorde oss i stand til å bekrefte biokjemisk og konfokal mikroskopi bevis på SUMO lokalisering i nevroner.
Her beskriver vi en protokoll for å studere lokalisering av proteiner i mus hippocampal primære nevroner. Samtidig kan denne protokollen tilpasses ulike typer primære nevronale kulturer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue solution&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15250061</td>
			<td >Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibody SENP1</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-271360</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >17504044</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CaCl2</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >21115</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chambered coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DyLight</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (Hyclone)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SH3007002 (CHA1111L)</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow&#8211;green fluorescent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8803</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >G8769</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td>H3537</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Cystein&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MAP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AB15452</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM&#160;</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21575022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >M8266</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaOH</td>
			<td >VWR International</td>
			<td>1,091,371,000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal A</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10888022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-SIM Super Resolution Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Papain</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td >P-3125</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/Strep 10x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >15140122</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-L lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProLong Diamond Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PSD95&#160;</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>K28/43</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round coverglass</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12052712</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SUMO1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32058</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptophysin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5768&#160;</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin inhibitor&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>T9003-500MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons

Synapser er de funksjonelle elementene i nevroner og deres defekter eller tap er på grunnlag av flere nevrodegenerative og nevrologiske lidelser. Imaging studier er mye brukt til å undersøke deres funksjon og plastisitet i fysiologiske og patologiske forhold. På grunn av deres størrelse og struktur krever lokaliseringsstudier av proteiner høyoppløselige bildeteknikker. I denne protokollen beskriver vi en prosedyre for å studere i primære nevroner samtidig lokalisering av målproteiner med synaptiske markører på et superoppløsningsnivå ved hjelp av strukturert belysningmikroskopi (SIM). SIM er en mønstret lys belysning teknikk som dobler romlig oppløsning av bredfelt mikroskopi, nå en detalj på rundt 100 nm. Protokollen angir de nødvendige kontrollene og innstillingene for robuste sam lokaliseringsstudier og en oversikt over de statistiske metodene for å analysere bildedataene riktig.

Vi presenterer her standard arbeidsflyt for å studere nevronale proteiner co-lokalisering. Vi kalibrerte først mikroskopet, og deretter utførte vi SIM-analyse av prøvene. For å kalibrere systemet brukte vi fluorescerende mikrosfærer med 0,1 μm diameter. Ved å skaffe super-løst 3D-SIM-bilder av perlene, de underliggende bildedataene er Fourier-forvandlet for å konvertere dem til en romlig frekvens representasjon. I figur 2Apresenteres det distinkte blomstermønsteret som en indikasj...

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons at JoVE.com

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Denne protokollen viser hvordan du bruker superoppløsningsmikroskopi for å studere proteinkon-lokalisering i primære nevronale kulturer.

Superoppløsningsavbildning for å studere samtidig lokalisering av proteiner og synaptiske markører i primære nevroner

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Synapser er de funksjonelle elementene i nevroner og deres defekter eller tap er på grunnlag av flere nevrodegenerative og nevrologiske lidelser. Imaging studier er mye brukt til å undersøke deres funksjon og plastisitet i fysiologiske og patologiske forhold. På grunn av deres størrelse og struktur krever lokaliseringsstudier av proteiner høyoppløselige bildeteknikker.I denne protokollen beskriver vi en prosedyre for å studere i primære nevroner samtidig lokalisering av målproteiner med synaptiske markører på et superoppløsningsnivå ved hjelp av strukturert belysningsmikroskopi. SIM er en mønstret lysbelysningsteknikk som dobler den romlige oppløsningen av widefield mikroskopi, og når en detalj på rundt 100 nanometer. Protokollen angir de nødvendige kontrollene og innstillingene for robuste sam lokaliseringsstudier og en oversikt over de statistiske metodene for å analysere bildedataene riktig.Nøkkelen til å tillate analysen på et superoppløsningsnivå er imidlertid reagensene som brukes under oppkjøpet, for eksempel kamret dekkslips og monteringsløsninger som er kompatible med diffraksjonsindeksen for målet. For å få en mus hippocampal primær nevron, isolere hippocampi fra P1 til P4 valper. Plateceller ved 70 000 celler per brønn i et volum på 200 mikroliter per brønn.Vent til hippocampal primære nevroner er fullt modnet 12 til 14 dager etter plating å utføre co-lokalisering studier. Legg til 4% paraformaldehyd, PFA, i PBS 200 mikroliter per brønn til nevroner for å fikse dem raskt. Fjern løsningen og inkuber prøvene med 1% storfe serumalbumin, BSA, i PBS ved 200 mikroliter per brønn i en time ved romtemperatur for å passivt dekke alle frittbindende overflater av platen med et irrelevant protein for analysen.En BSA-basert blokkeringsbuffer uten Triton X-100 reduserer antistoffbakgrunnen mer effektivt enn den samme bufferen med 0,2 %Triton X-100. Legg til det primære antistoffet. Som en negativ kontroll, ikke legg til noen primære antistoff til en av brønnene.Monter celler ved hjelp av et SIM-kompatibelt monteringsmiddel, for eksempel ProLong Glass Antifade Mountant. Dekk og beskytt cellene med et dekkglass, for eksempel et rundt dekkglass med en diameter på åtte millimeter.Firkantede kan også brukes. Oppbevar de kamret dekkglassene ved romtemperatur og vent minst 48 timer før du anskaffer bilder. Diamantglass krever minst to dager med herding før superoppløsningsoppkjøp.Bruk to strategier for å sikre antistoffspesifisitet. Den første er bruken av minst to forskjellige antistoffer rettet mot samme substrat. Den andre strategien er antistoffnøytrasjon ved inkubasjon med det rensede proteinmålet, eller brukes til å heve antistoffet.Vi bruker rutinemessig et N-SIM-mikroskop med superoppløsning produsert av Nikon for vår analyse. Instruksjonene som følger skal være ment for anskaffelse av SIM-bilder uavhengig av mikroskopet for bruk. Det er også viktig å maksimere ytelsen til mikroskopet for å utføre en nøyaktig kalibrering av instrumentene, inkludert korreksjonsring, laserjustering og risteblokkfokusering.Før oppkjøpet av SIM-bilder krever systemet en riktig kalibrering med spesifikke sub-oppløsning størrelse fluorescerende perler. Et eksempel er TetraSpeck mikrosfærer. Disse perlene er farget med forskjellige fluorescerende fargestoffer for å tillate kalibrering av forskjellige lasere med en prøve.I et vannbad sonikerer du rundt 1,8 ganger 10 til 8th fluorescerende mikrosfærer i 10 minutter. Fortynn den fluorescerende mikrosfæren en av 500 i dobbelt destillert vann. Sonicate en gang til i ytterligere 10 minutter.Pipette 15 mikroliter av fortynnede perler i en brønn av en kamret dekkslips. La løsningen tørke i fem minutter ved romtemperatur. Tilsett 10 mikroliter av monteringsløsningen, f.eks.ProLong Glass, og plasser en åtte millimeter dekkslipp på toppen. Vent i minst 48 timer for å tillate en skikkelig herding. Slå på mikroskopet og lasere.La systemet varme opp for å nå termisk likevekt av alle mikroskopkomponenter, og SIM-mikroskopsystemet med superoppløsning krever minst tre timer. Velg 100X-målet. Start kalibreringen ved å justere laserne til midten av diffraksjonsgitterblokken.I N-SIM-systemet tillater en mikrometerknott og et dedikert kamera sentrering av lysstrålene til målet. Sett inn det kamret dekkslippen på mikroskopet for visning. Sett systemet på den kamret dekkglasstykkelsen ved å justere det objektive korreksjonsdekselet.NIS Software, den proprietære programvaren som leveres med N-SIM superoppløsningsmikroskopsystemer, har en automatisk funksjon for å regulere korrigering av farger. Juster risteblokkfokus for hver kanal for å sikre fokusert strukturert mønsterbelysning på prøven. Programvaren gir en automatisk funksjon for denne oppgaven.Skaff deg rå 3D SIM-bilder av flerfarget mikrosfærer. Beregn for hver egen bølgelengde Fourier-transformeringen av det superforsedede bildet. Hvis det transformerte bildet ikke får et riktig blomsterlignende mønster, starter du kalibreringen på nytt siden superoppløsning ikke er oppnådd.I det superoppsvede bildet velger du én enkelt mikrosfære og beregner intensitetsprofilen for hver kanal for å måle oppløsningen som er oppnådd. Det skal nå være nær 100 nanometer sidealt. Utfør kanalregistrering ved å over legge over et flerkanals oppkjøp av mikrosfærene.Målet er å kollidere alle kanalsignaler sidealt og aksialt. Dette vil eliminere kromatiske avvik på grunn av feiljustering av de ulike kanalene og hjelpe co-lokaliseringsanalysen. Bekreft kvaliteten på kalibreringen ved hjelp av funksjonene belysning fase trinn og belysning mønstret fokus av SIMcheck, en pakke med plugins for åpen kildekode-programmet ImageJ.Begynn å analysere eksemplet ved hjelp av et 40X-mål i konfokal eller widefield-modus. Dette gjør det mulig å navigere i eksemplet, opprettholde gode detaljer og et stort synsfelt. Bruk MAP2 antistoffsignal til å oppdage et område som representerer nevronale prosesser.Få bilder av prøven i konfokal modus for å bestemme kvaliteten på fargingen. Bytt til målet 100X. Påfør olje på 100X-målet.Få et widefield eller konfokalt bilde som vil bli brukt senere for å vurdere kvaliteten på det super-løste bildet. Bytt til 3D SIM-modus. Bruk dialogvinduer til å angi parameterne for anskaffelse, og velg den høyeste innstillingen for bitdybde som er tilgjengelig for å maksimere fargeinformasjonen.Vanligvis er 16 bit standardvalget. Hvis du vil forbedre signal-til-støy-forholdet, velger du også en lavfrekvent verdi for anskaffelse, for eksempel én megahertz. Ved hjelp av histogrammet vinduer, angi laserkraft for å få en lineær respons av signal for å unngå tap av informasjon, begrense mettede piksler i bildene.N-SIM-systemet bruker et Andor iXon3-kamera. Når du arbeider på 16 bit, velger du en målintensitet på 16 000 for å sikre kameraets lineære respons. Alternativt kan du velge et område mellom 30 000 og 45 000 for å maksimere det dynamiske området for oppkjøpene.Still inn lasereffekten mellom 0,1 % og 50 % når du avbilder prøvene og eksponeringstidene mellom 50 millisekunder og to sekunder. Laserkrefter over 50%kan forårsake rask fotobleking av fluoroforene i bruk. Begynn å anskaffe bildene i 3D SIM-modus.Bruk SIMcheck, en pakke med gratis plugins for ImageJ, for å vurdere kvaliteten på oppkjøpene av råbildene. Hvis SIMcheck ikke oppdager artefakter eller kvalitetsproblemer, kan du hente minst 10 bilder fra fullstendige tekniske replikeringer for å tillate statistisk analyse. Anskaffede bilder er rådata som må behandles for å få rekonstruerte SIM-bilder som skal brukes til videre analyse.I protokollen foreslår vi å bruke synaptophysin og PSD-95 som pre og post synaptiske markører. Flere markører kan imidlertid brukes. En stor mengde litteratur støtter bruk av andre proteiner, som drebrin og fagott som synaptiske markører.3D SIM-anskaffede bilder er råbilder som må behandles for å få rekonstruerte super-løste bilder. Feil rekonstruksjon av råbilder kan føre til artefakter som vil påvirke analysen av prøvene. Stor oppmerksomhet bør derfor gis til riktig valg av rekonstruksjonsparametere.Behandle råbildene ved hjelp av programvaren for rekonstruksjon av mikroskop for å få et superopp løst bilde. Alternativt kan du bruke en fritt tilgjengelig ImageJ plugin fairSIM for å rekonstruere råbildene. Beregn Fourier-transformeringen av de superoppgitte bildene ved hjelp av mikroskoprekonstruksjonsprogramvaren eller ImageJ-plugin-programmet SIMcheck.Et godt rekonstruert bilde skal returnere, for hver kanal, et blomsterlignende bilde. Hvis de rekonstruerte bildene ikke klarer å gjenskape en blomsterlignende form, starter du på nytt fra de rå bildene og rekonstruerer dem ved å endre rekonstruksjonsparametere, for eksempel lineær filtrering, apodisering og null ordreundertrykkelse. I NIS-programvaren som bruker forhåndsvisningen til å overvåke hvordan endring av parametrene påvirker det endelige løste bildet, endrer du parameterens belysningsmodulasjonskontrast, høyoppløselig støyundertrykkelse og ut av fokusundertrykkelse.Analyser det rekonstruerte bildet for å objektivt oppdage artefakter ved hjelp av NanoJ-SQUIRREL, en ImageJ-basert plugin, for å vurdere kvaliteten på superoppdagede bilder. I vår analyse av sam lokalisering brukte vi to tilnærminger. Den første er en visuell tilnærming basert på profilanalysen som viser enkelthendelser av sam lokalisering, og som identifiserer bidraget fra hver kanal.Som et første skritt for å studere sam lokalisering mellom synaptiske markører og et protein av interesse, ta et super-løst bilde og analysere en enkelt locus for å bestemme signaloverlapping. Identifiser ett enkelt gress på det super-løste bildet. Få intensitetsprofilene til de fluorescerende signalene til interesselocus.Hvis profilanalyse har foreslått enkelt locus co-lokalisering, kan en mer generell analyse av hele bildet utføres ved å beregne Pearsons og Manders koeffisienter. Bruk JACoP, en ImageJ plugin, for å bestemme to parametere for sam lokalisering, Pearsons og Manders. Etter å ha kalibrert systemet og vurdert kvaliteten på de rekonstruerte bildene, begynte vi deretter å analysere de primære nevronale kulturene farget med et antistoff mot MAP2, en nevronal markør, PSD-95, en postsynaptisk markør og vårt målprotein SUMO1.Vi analyserte først prøven som utførte firekanals konfokal mikroskopi med et 40X-mål. Ved å velge et område som representerer nevronale prosesser, byttet vi til et 100X-mål. Vi kjøpte både konfokale og SIM-bilder av samme område for å vurdere kvaliteten på gjenoppbyggingen med NanoJ-SQUIRREL og utføre co-lokaliseringsanalyse.Belyse strukturen og sammensetningen av synapsen er avgjørende for forståelsen av både fysiologiske og patologiske prosesser som regulerer hukommelse og kognisjon. Mens i normal tilstand synapser er byggesteinene i minnet, de er også på grunnlag av komplekse nevrologiske lidelser, som en av de vanligste former for demens Alzheimers sykdom. Protokollen som er beskrevet her tillater studiet av proteinsammensetning av synapser med en superoppløsning mikroskopi teknikk kalt strukturert belysning mikroskopi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Lateral Diffusjon og eksocytose av membran proteiner i dyrkede Neurons vurdert ved hjelp av Fluorescens Recovery og fluorescens-tap photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

I Vivo to-foton avbildning av erfaring-avhengige molekylære endringer i kortikale Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-oppløsning Imaging nevrale Dense-core Blemmer

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Real-time Imaging av aksonal Transport av Quantum Dot-merket BDNF i Primær Neuroner

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Måle Synaptic Vesicle endocytose i kulturperler hippocampus nerveceller

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellering Neuronal død og forverring av musen primære lillehjernen Granule nerveceller

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

Optisk analysen for Synaptic Vesicle resirkulering i kulturperler Neurons Overexpressing Presynaptic proteiner

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...