Name: super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons
Uploaded: 2020-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons at JoVE.com

Los autores quieren agradecer a Edoardo Micotti por la crítica constructiva del manuscrito. Este estudio fue apoyado por BrightFocus A2019296F, por Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), por la Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) y por la Red de Formación Innovadora Marie Sk-odowska-Curie (JK).

1. Culturas primarias
<ol><li>Neuronas primarias de hipocampo de ratón de cultivo en cubreobjetos con cámara (como Ibidi μ-Slide 8 Well o Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) que coinciden con el requisito objetivo para el espesor de la cubierta de #1,5 (0,17 mm).</li>
	<li>Cubiertas con cámara de abrigo con 100 ml de poli-L-lisina (100 g/ml).</li>
	<li>Al día siguiente, lave los cubreobjetos a cámara dos veces con solución salina estéril tamponada por fosfato (PBS).</li>
	<li>Para obtener neuronas primarias de r...

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).</li><li>Choquet, D., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+Synapse.">The Dynamic Synapse.</a> Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Aspects+of+CNS+Synapse+Formation.">Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).</li><li>Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Classes+of+Secreted+Synaptic+Organizers+in+the+Central+Nervous+System.">Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System.</a> Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist.">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).</li><li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses.">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).</li><li>Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+the+Inhibitory+Synapse+Organization+Using+Superresolution+Microscopy.">Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).</li><li>Yang, X., Specht, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+Domains+in+Super-Resolution+Microscopy:+The+Treachery+of+Images.">Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).</li><li>Monro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+diffraction+limit.">Beyond the diffraction limit.</a> Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).</li><li>Won, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+super-resolution.">Eyes on super-resolution.</a> Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination.">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathy:+dysfunction+of+synaptic+function.">Synaptopathy: dysfunction of synaptic function.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).</li><li>Tyebji, S., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathic+mechanisms+of+neurodegeneration+and+dementia:+Insights+from+Huntington's+disease.">Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease.</a> Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).</li><li>Won, H., Mah, W., Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorder+causes,+mechanisms,+and+treatments:+focus+on+neuronal+synapses.">Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+State+of+Synapses+in+Fragile+X+Syndrome.">The State of Synapses in Fragile X Syndrome.</a> The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).</li><li>Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+major+synaptic+signaling+pathways+involved+in+intellectual+disability.">Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability.</a> Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).</li><li>Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+dysfunction+in+prion+diseases:+a+trafficking+problem.">Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem.</a> International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).</li><li>Colnaghi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super+Resolution+Microscopy+of+SUMO+Proteins+in+Neurons.">Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., M&#246;nkem&#246;ller, V., Hennig, S., H&#252;bner, W., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-source+image+reconstruction+of+super-resolution+structured+illumination+microscopy+data+in+ImageJ.">Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ.</a> Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy.">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).</li><li>Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+microscopy:+artefact+analysis+and+reduction+utilizing+a+parameter+optimization+approach.">Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach.</a> Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).</li><li>Culley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoJ-SQUIRREL:+quantitative+mapping+and+minimisation+of+super-resolution+optical+imaging+artefacts.">NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts.</a> Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+co-localization+of+objects+in+dual-colour+confocal+images.">Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images.</a> Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander&#8217;s+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander&#8217;s overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li><li>Bolte, S., Cordeli&#232;res, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>Bae, J. R., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+neurodegenerative+diseases.">Synapses in neurodegenerative diseases.</a> BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).</li><li>Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+Approaches+for+Live+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging.</a> Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Karras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+optimization+of+reconstruction+parameters+in+structured+illumination+microscopy+-+A+practical+guide.">Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide.</a> Optics Communications. 436, 69-75 (2019).</li><li>Bereczki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+markers+of+cognitive+decline+in+neurodegenerative+diseases:+a+proteomic+approach.">Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach.</a> Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).</li><li>Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Changes+in+Synaptic+Markers+as+a+Function+of+Sleep+and+Wakefulness+in+Drosophila.">Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila.</a> Science. 324 (5923), 109-112 (2009).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander's+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li></ol>

Elucidar la estructura y composición de la sinapsis es crucial para entender los procesos fisiológicos y patológicos que regulan la memoria y la cognición. Mientras que en el estado normal, las sinapsis son los bloques de construcción de la memoria, también subyacen a trastornos neurológicos complejos como la enfermedad de Alzheimer32. El protocolo descrito aquí sirve para estudiar la co-localización de proteínas neuronales con una técnica de microscopía de superresor resolución llama...

La comprensión y la visión de la sinapsis ha cambiado enormemente desde su primera descripción por Foster y Sherrington en 18971. Desde entonces, nuestro conocimiento de la comunicación neuronal y los procesos moleculares detrás de ella ha crecido exponencialmente2. Ha quedado claro que las sinapsis pueden considerarse como un sistema de dos compartimentos: un compartimento presináptico que contiene vesículas para la liberación de neurotransmisores y un compartimento postsináptico con receptores3. Esta visión simplista, en los últimos veinte años, se ha convertido en una compleja red de proteínas necesarias para transducir la unión del transmisor a la señalización4.
Las ganancias en el entendimiento se deben en parte a las técnicas de superrescencia que superaron el límite de difracción de la microscopía de luz convencional para adaptarse a la dimensión de las sinapsis mejores5,6,7,8,9,10. Debido al límite de difracción, un microscopio óptico no puede alcanzar una resolución superior a 200 nm lateralmente11,12. Para eludir este límite, se crearon técnicas de superrescencia, utilizando diferentes enfoques y alcanzando diferentes resoluciones de límite de subdifacción: SIM, STED (Microscopía de Agotamiento de Emisiones Estimuladas), PALM (Microscopía de Localización Fotoactiva) y STORM (Microscopía de Reconstrucción Óptica Estocástica)13,,14. SIM duplica la resolución espacial de los sistemas de microscopía de campo ancho basados en láser mediante la inserción de una rejilla de difracción en la trayectoria del haz de excitación15. La rejilla móvil difracta los rayos láser para crear un patrón de iluminación conocido, generalmente rayas. Este patrón de luz estructurado específicamente se superpone a la distribución espacial desconocida del tinte fluorescente (de la muestra). Los flecos de interferencia formados por los dos patrones codifican para detalles finos indistinguibles con microscopía de campo ancho normal. La imagen superconsfectada final se obtiene combinando y decodificando con métodos matemáticos varias imágenes crudas de la misma muestra obtenidas por las traducciones y rotaciones de la rejilla de difracción. La resolución de las imágenes superconsueltas alcanza los 100 nm en las direcciones lateral y 500 nm en las direcciones axiales para 2D-SIM15 o 100 nm en las direcciones lateral y 250 nm en las direcciones axiales para 3D-SIM16.
La nueva comprensión de la sinapsis es aún más importante a la luz de los muchos trastornos neurológicos donde la disfunción sináptica juega un papel importante en la aparición y progresión17,,18. Enfermedad de Alzheimer, Síndrome de Down, Enfermedad de Parkinson, enfermedades priónicas, epilepsia, trastornos del espectro autista y síndrome X frágil entre otros se han relacionado con anomalías en la composición sináptica, morfología y función19,,20,,21,,22.
Recientemente, utilizando un conjunto de anticuerpos específicos de SUMO, utilizamos SIM para mostrar la co-localización en las neuronas primarias del hipocampo de las proteínas SUMO con los marcadores pre y postsinápticos sinaptofisina y PSD95 en el nivel de superrescresía23. Esto nos permitió confirmar la evidencia de microscopía bioquímica y confocal de la localización SUMO en las neuronas.
Aquí, describimos un protocolo para estudiar la localización de proteínas en las neuronas primarias del hipocampo de ratón. Al mismo tiempo, este protocolo puede adaptarse a diferentes tipos de cultivos neuronales primarios.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue solution&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15250061</td>
			<td >Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibody SENP1</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-271360</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >17504044</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CaCl2</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >21115</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chambered coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DyLight</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (Hyclone)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SH3007002 (CHA1111L)</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow&#8211;green fluorescent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8803</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >G8769</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td>H3537</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Cystein&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MAP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AB15452</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM&#160;</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21575022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >M8266</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaOH</td>
			<td >VWR International</td>
			<td>1,091,371,000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal A</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10888022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-SIM Super Resolution Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Papain</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td >P-3125</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/Strep 10x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >15140122</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-L lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProLong Diamond Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PSD95&#160;</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>K28/43</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round coverglass</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12052712</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SUMO1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32058</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptophysin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5768&#160;</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin inhibitor&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>T9003-500MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
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super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons

Las sinapsis son los elementos funcionales de las neuronas y sus defectos o pérdidas están en la base de varios trastornos neurodegenerativos y neurológicos. Los estudios por imágenes se utilizan ampliamente para investigar su función y plasticidad en condiciones fisiológicas y patológicas. Debido a su tamaño y estructura, los estudios de localización de proteínas requieren técnicas de imagen de alta resolución. En este protocolo, describimos un procedimiento para estudiar en las neuronas primarias la co-localización de proteínas diana con marcadores sinápticos a nivel de superresción utilizando microscopía de iluminación estructurada (SIM). SIM es una técnica de iluminación de luz estanco que duplica la resolución espacial de la microscopía de campo ancho, alcanzando un detalle de alrededor de 100 nm. El protocolo indica los controles y la configuración necesarios para estudios de co-localización robustos y una visión general de los métodos estadísticos para analizar los datos de imagen correctamente.

Aquí presentamos el flujo de trabajo estándar para estudiar la co-localización de proteínas neuronales. Primero calibramos el microscopio y luego realizamos el análisis SIM de las muestras. Para calibrar el sistema, utilizamos microesferas fluorescentes de 0,1 m de diámetro. Al obtener imágenes 3D-SIM superconsúcesas de los cordones, los datos de imagen subyacentes se transforman en Fourier para volver a convertirlas en una representación de frecuencia espacial. En la Figura 2A,el p...

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Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Este protocolo muestra cómo emplear la microscopía de superresorción para estudiar la co-localización de proteínas en cultivos neuronales primarios.

Imágenes de Superresoridad para estudiar la co-localización de proteínas y marcadores sinápticos en neuronas primarias

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Las sinapsis son los elementos funcionales de las neuronas y sus defectos o pérdidas están en la base de varios trastornos neurodegenerativos y neurológicos. Los estudios por imágenes se utilizan ampliamente para investigar su función y plasticidad en condiciones fisiológicas y patológicas. Debido a su tamaño y estructura, los estudios de localización de proteínas requieren técnicas de imagen de alta resolución.En este protocolo, describimos un procedimiento para estudiar en las neuronas primarias la co-localización de proteínas diana con marcadores sinápticos a un nivel de superresción utilizando microscopía de iluminación estructurada. SIM es una técnica de iluminación de luz con patrón que duplica la resolución espacial de la microscopía de campo ancho, alcanzando un detalle de alrededor de 100 nanómetros. El protocolo indica los controles y la configuración necesarios para estudios de co-localización robustos y una visión general de los métodos estadísticos para analizar los datos de imagen correctamente.La clave para permitir el análisis a nivel de superrescencia es, sin embargo, los reactivos utilizados durante la adquisición, tales como cubiertas con cámara y soluciones de montaje compatibles con el índice de difracción del objetivo. Para obtener una neurona primaria hipocampal de ratón, aísle los hipocampos de P1 a P4 cachorros. Células de placa a 70.000 células por pozo en un volumen de 200 microlitros por pozo.Espere hasta que las neuronas primarias del hipocampo maduren completamente de 12 a 14 días después del enchapado para realizar estudios de co-localización. Añadir 4%paraformaldehído, PFA, en PBS 200 microlitros por pozo a las neuronas para fijarlas rápidamente. Retire la solución e incubar las muestras con 1%albúmina sérica bovina, BSA, en PBS a 200 microlitros por pozo durante una hora a temperatura ambiente para cubrir pasivamente todas las superficies de unión libre de la placa con una proteína irrelevante para el análisis.Un búfer de bloqueo basado en BSA sin Triton X-100 reduce el fondo de anticuerpos de manera más eficiente que el mismo búfer con 0.2%Triton X-100. Agregue el anticuerpo primario. Como control negativo, no agregue ningún anticuerpo primario a uno de los pozos.Monte las células con un montura compatible con SIM, por ejemplo, ProLong Glass Antifade Mountant. Cubra y proteja las celdas con una cubierta, por ejemplo, una cubierta redonda con un diámetro de ocho milímetros.También se pueden utilizar plazas. Guarde los cubreobjetos con cámara a temperatura ambiente y espere al menos 48 horas antes de adquirir imágenes. El vidrio de diamante requiere al menos dos días de curado antes de las adquisiciones de superresor resolución.Utilice dos estrategias para asegurar la especificidad de los anticuerpos. El primero es el uso de al menos dos anticuerpos diferentes dirigidos al mismo sustrato. La segunda estrategia es la neutralización de anticuerpos por incubación con el objetivo de proteína purificada, o la utilizada para aumentar el anticuerpo.Utilizamos rutinariamente un microscopio de superconorción N-SIM fabricado por Nikon para nuestro análisis. Las instrucciones siguientes deben estar destinadas a la adquisición de imágenes SIM independientemente del microscopio de uso. También es importante maximizar el rendimiento del microscopio para realizar una calibración precisa de los instrumentos, incluyendo anillo de corrección, alineación láser y enfoque de bloque de rejilla.Antes de la adquisición de imágenes SIM, el sistema requiere una calibración adecuada con perlas fluorescentes de tamaño de subrescresación específicas. Un ejemplo son las microesferas TetraSpeck. Estas perlas están teñidas con diferentes tintes fluorescentes para permitir la calibración de diferentes láseres con una sola muestra.En un baño de agua, sonicar alrededor de 1.8 veces 10 a la 8a microesferas fluorescentes durante 10 minutos. Diluir las microesferas fluorescentes una de cada 500 en agua doble destilada. Sonicar una segunda vez durante 10 minutos adicionales.Pipeta 15 microlitros de las perlas diluidas en un pozo de un cubreobjetos con cámara. Deje secar la solución durante cinco minutos a temperatura ambiente. Añadir 10 microlitros de la solución de montaje, p. ej.ProLong Glass, y coloque un cubreobjetos de ocho milímetros en la parte superior. Espere al menos 48 horas para permitir un curado adecuado. Encienda el microscopio y los láseres.Deje que el sistema se caliente para alcanzar el equilibrio térmico de todos los componentes del microscopio y el sistema de microscopio de superconorción SIM requiere al menos tres horas. Seleccione el objetivo 100X. Inicie la calibración alineando los láseres con el centro del bloque de rejilla de difracción.En el sistema N-SIM, una perilla de micrómetros y una cámara dedicada permiten centrar los haces de luz al objetivo. Inserte la cubierta con cámara del microscopio para su visualización. Ajuste el sistema al espesor de la cubierta con cámara ajustando la cubierta de corrección objetiva.NIS Software, el software propietario proporcionado con sistemas de microscopio de superresor resolución N-SIM, tiene una función automática para regular la corrección de colores. Ajuste el enfoque del bloque de rejilla para cada canal para garantizar una iluminación de patrón estructurado enfocada en la muestra. El software proporciona una función automática para esta tarea.Adquiera imágenes SIM 3D en bruto de las microesferas multicolores. Calcula para cada longitud de onda separada la transformación de Fourier de la imagen superconsuel. Si la imagen transformada no puede obtener un patrón correcto similar a una flor, reinicie la calibración ya que no se ha logrado la superrtención.En la imagen superconsútil, seleccione una sola microesfera y calcule su perfil de intensidad para cada canal para medir la resolución alcanzada. Ahora debería estar cerca de 100 nanómetros lateralmente. Realice el registro de canales superponiendo una adquisición multicanal de las microesferas.El objetivo es colisionar todas las señales de canal de forma lateral y axial. Esto eliminará las aberraciones cromáticas debido a la desalineación de los diferentes canales y ayudará al análisis de la co-localización. Confirme la calidad de la calibración utilizando el paso de fase de iluminación de funciones y el enfoque con patrón de iluminación de SIMcheck, un conjunto de plugins para la aplicación de código abierto ImageJ.Comience a analizar la muestra utilizando un objetivo 40X en modo confocal o de campo ancho. Esto permite la navegación de la muestra, manteniendo un buen detalle y un gran campo de visión. Utilice la señal de anticuerpos MAP2 para detectar un área que represente procesos neuronales.Adquiera imágenes de la muestra en modo confocal para determinar la calidad de la tinción. Cambie al objetivo 100X. Aplique aceite al objetivo 100X.Adquiera una imagen de campo ancho o confocal que se utilizará más adelante para evaluar la calidad de la imagen superconstionada. Cambie al modo SIM 3D. Mediante las ventanas de diálogo para establecer los parámetros para la adquisición, seleccione la configuración de profundidad de bits más alta disponible para maximizar la información de color.Típicamente, 16 bits es la opción estándar. Además, para mejorar la relación señal-ruido, seleccione un valor de baja frecuencia para la adquisición, como un megahercios. Usando ventanas de histograma, ajuste la potencia del láser para obtener una respuesta lineal de la señal para evitar la pérdida de información, limite los píxeles saturados en las imágenes.El sistema N-SIM utiliza una cámara Andor iXon3. Cuando trabaje a 16 bits, elija una intensidad objetivo de 16.000 para garantizar la respuesta lineal de la cámara. Alternativamente, elija un rango entre 30.000 y 45.000 para maximizar el rango dinámico de las adquisiciones.Establezca la potencia del láser entre 0,1% y 50% al tomar imágenes de las muestras y los tiempos de exposición entre 50 milisegundos y dos segundos. Las potencias láser superiores al 50% pueden causar un fotoblanqueo rápido de los fluoróforos en uso. Comience a adquirir las imágenes en modo 3D SIM.Utilice SIMcheck, un conjunto de plugins gratuitos para ImageJ, para evaluar la calidad de las adquisiciones de las imágenes en bruto. Si SIMcheck no detecta artefactos ni problemas de calidad, adquiera un mínimo de 10 imágenes de réplicas técnicas completas para permitir el análisis estadístico. Las imágenes adquiridas son datos sin procesar que deben procesarse para obtener imágenes SIM reconstruidas que se utilizarán para su posterior análisis.En el protocolo, sugerimos utilizar sinaptofisina y PSD-95 como marcadores sinápticos previos y posteriores. Sin embargo, se pueden utilizar marcadores adicionales. Un enorme cuerpo de literatura apoya el uso de otras proteínas, como la drebrin y el fabanón como marcadores sinápticos.Las imágenes adquiridas por 3D SIM son imágenes sin procesar que deben procesarse para obtener imágenes superconsueltas reconstruidas. La reconstrucción incorrecta de imágenes sin procesar puede dar lugar a artefactos que afectarían al análisis de las muestras. Por lo tanto, se debe prestar una gran atención a la elección adecuada de los parámetros de reconstrucción.Procesar las imágenes sin procesar utilizando el software de análisis de reconstrucción del microscopio para obtener una imagen superconsuel. Alternativamente, utilice un plugin ImageJ freely fairSIM para reconstruir las imágenes sin procesar. Calcule la transformación de Fourier de las imágenes superconsuelven utilizando el software de reconstrucción del microscopio o el plugin ImageJ SIMcheck.Una buena imagen reconstruida debe devolver, para cada canal, una imagen similar a una flor. Si las imágenes reconstruidas no pueden volver a crear una forma similar a una flor, reinicie desde las imágenes sin procesar y reconstruya modificando los parámetros de reconstrucción, como el filtrado lineal, la apodización y la supresión de orden cero. En el software NIS que utiliza la vista previa para supervisar cómo el cambio de los parámetros afecta a la imagen final resuelta, modifique el contraste de modulación de iluminación del parámetro, la supresión de ruido de alta resolución y la supresión fuera de foco.Analice la imagen reconstruida para detectar artefactos de forma imparcial mediante NanoJ-SQUIRREL, un complemento basado en ImageJ, para evaluar la calidad de las imágenes superconsúcedas. En nuestro análisis de la co-localización, utilizamos dos enfoques. El primero es un enfoque visual basado en el análisis de perfil que muestra eventos individuales de co-localización y que identifica la contribución de cada canal.Como primer paso para estudiar la co-localización entre marcadores sinápticos y una proteína de interés, tome una imagen superconsuelta y analice un solo locus para determinar la superposición de la señal. Identifique un solo locus en la imagen superconsuel. Obtener los perfiles de intensidad de las señales fluorescentes al locus de interés.Si el análisis de perfil ha sugerido una sola co-localización de locus, se puede llevar a cabo un análisis más general de toda la imagen calculando los coeficientes de Pearson y Mander. Utilice JACoP, un plugin de ImageJ, para determinar dos parámetros de co-localización, Pearson y Mander. Después de haber calibrado el sistema y evaluado la calidad de las imágenes reconstruidas, comenzamos a analizar los cultivos neuronales primarios manchados con un anticuerpo contra MAP2, un marcador neuronal, PSD-95, un marcador postsináptico, y nuestra proteína objetivo SUMO1.Primero analizamos la muestra realizando microscopía confocal de cuatro canales con un objetivo 40X. Al seleccionar un área que representa los procesos neuronales, cambiamos a un objetivo 100X. Adquirimos imágenes confocales y SIM de la misma zona para evaluar la calidad de la reconstrucción con NanoJ-SQUIRREL y realizar análisis de co-localización.Elucidar la estructura y composición de la sinapsis es crucial para la comprensión de los procesos fisiológicos y patológicos que regulan la memoria y la cognición. Mientras que en el estado normal las sinapsis son los bloques de construcción de la memoria, también están en la base de trastornos neurológicos complejos, como una de las formas más comunes de demencia enfermedad de Alzheimer. El protocolo descrito aquí permite el estudio de la composición proteica de las sinapsis con una técnica de microscopía de superrescidad llamada microscopía de iluminación estructurada.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Láser microdisección de captura de Drosophila Neuronas periféricas

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Investigación

Neurociencias

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Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

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Difusión lateral y exocitosis de proteínas de membrana en neuronas cultivadas evaluó a través de la recuperación de fluorescencia y la pérdida de fluorescencia photobleaching

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