Name: super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons
Uploaded: 2020-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons at JoVE.com

Författarna vill tacka Edoardo Micotti för konstruktiv kritik av manuskriptet. Denna studie stöddes av BrightFocus A2019296F, av Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), av Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) och av Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (JK).

1. Primära kulturer
<ol><li>Kultur mus hippocampus primära nervceller i kammar coverslips (såsom Ibidi μ-Slide 8 Well eller Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) som matchar det objektiva kravet på #1,5 (0,17 mm) coverslip tjocklek.</li>
	<li>Täckkammarens täckliner med 100 μL poly-L-lysin (100 μg/mL).</li>
	<li>Nästa dag, tvätta de kammade täcken två gånger med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).</li>
	<li>För att erhålla mus primära nervceller, isolera hippocampi från P1-P4 pups2...

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).</li><li>Choquet, D., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+Synapse.">The Dynamic Synapse.</a> Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Aspects+of+CNS+Synapse+Formation.">Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).</li><li>Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Classes+of+Secreted+Synaptic+Organizers+in+the+Central+Nervous+System.">Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System.</a> Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist.">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).</li><li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses.">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).</li><li>Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+the+Inhibitory+Synapse+Organization+Using+Superresolution+Microscopy.">Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).</li><li>Yang, X., Specht, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+Domains+in+Super-Resolution+Microscopy:+The+Treachery+of+Images.">Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).</li><li>Monro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+diffraction+limit.">Beyond the diffraction limit.</a> Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).</li><li>Won, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+super-resolution.">Eyes on super-resolution.</a> Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination.">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathy:+dysfunction+of+synaptic+function.">Synaptopathy: dysfunction of synaptic function.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).</li><li>Tyebji, S., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathic+mechanisms+of+neurodegeneration+and+dementia:+Insights+from+Huntington's+disease.">Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease.</a> Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).</li><li>Won, H., Mah, W., Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorder+causes,+mechanisms,+and+treatments:+focus+on+neuronal+synapses.">Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+State+of+Synapses+in+Fragile+X+Syndrome.">The State of Synapses in Fragile X Syndrome.</a> The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).</li><li>Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+major+synaptic+signaling+pathways+involved+in+intellectual+disability.">Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability.</a> Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).</li><li>Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+dysfunction+in+prion+diseases:+a+trafficking+problem.">Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem.</a> International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).</li><li>Colnaghi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super+Resolution+Microscopy+of+SUMO+Proteins+in+Neurons.">Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., M&#246;nkem&#246;ller, V., Hennig, S., H&#252;bner, W., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-source+image+reconstruction+of+super-resolution+structured+illumination+microscopy+data+in+ImageJ.">Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ.</a> Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy.">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).</li><li>Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+microscopy:+artefact+analysis+and+reduction+utilizing+a+parameter+optimization+approach.">Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach.</a> Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).</li><li>Culley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoJ-SQUIRREL:+quantitative+mapping+and+minimisation+of+super-resolution+optical+imaging+artefacts.">NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts.</a> Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+co-localization+of+objects+in+dual-colour+confocal+images.">Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images.</a> Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander&#8217;s+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander&#8217;s overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li><li>Bolte, S., Cordeli&#232;res, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>Bae, J. R., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+neurodegenerative+diseases.">Synapses in neurodegenerative diseases.</a> BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).</li><li>Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+Approaches+for+Live+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging.</a> Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Karras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+optimization+of+reconstruction+parameters+in+structured+illumination+microscopy+-+A+practical+guide.">Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide.</a> Optics Communications. 436, 69-75 (2019).</li><li>Bereczki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+markers+of+cognitive+decline+in+neurodegenerative+diseases:+a+proteomic+approach.">Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach.</a> Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).</li><li>Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Changes+in+Synaptic+Markers+as+a+Function+of+Sleep+and+Wakefulness+in+Drosophila.">Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila.</a> Science. 324 (5923), 109-112 (2009).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander's+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li></ol>

Att belysa synapsens struktur och sammansättning är avgörande för att förstå de fysiologiska och patologiska processer som reglerar minne och kognition. Även i det normala tillståndet, synapser är byggstenarna i minnet, de ligger också bakom komplexa neurologiska sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom32. Protokollet som beskrivs här tjänar till att studera samlokalisering av neuronala proteiner med en super-upplösning mikroskopi teknik som kallas SIM. Med hjälp av ett visst ljusmönster...

Förståelsen och synen på synapsen har förändrats enormt sedan dess första beskrivning av Foster och Sherrington 18971. Sedan dess har vår kunskap om neuronal kommunikation och de molekylära processerna bakom det vuxit exponentiellt2. Det har blivit tydligt att synapser kan ses som ett tvåfackssystem: ett pre-synapsfack som innehåller vesiklar för frisättning av signalsubstanser och ett postsynapsfack med receptorer3. Denna förenklade syn, under de senaste tjugo åren, har utvecklats till ett komplext nätverk av de proteiner som krävs för att transduce sändarbindning till signalering4.
Vinsterna i förståelsen beror delvis på super-upplösning tekniker som övervann diffraktion gränsen för konventionell ljusmikroskopi för att passa dimensionen av synapser bättre5,6,7,8,9,10. På grund av diffraktionsgränsen kan ett optiskt mikroskop inte nå en upplösning över 200 nm i lateritet11,12. För att kringgå denna gräns, super-upplösning tekniker skapades, med hjälp av olika tillvägagångssätt och nå olika sub-diffraktion gräns upplösningar: SIM, STED (Stimulerad emission depletion mikroskopi), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) och STORM (Stokastisk Optisk Rekonstruktion Mikroskopi)13,14. SIM fördubblar den rumsliga upplösningen hos laserbaserade mikroskopisystem med bredfältsbaserad genom att sätta in ett diffraktionsgaller i magnetiseringsstrålensväg 15. Den rörliga galler diffracts laserstrålarna för att skapa en känd belysning mönster, vanligtvis ränder. Detta avsiktligt strukturerade ljusmönster läggs ovanpå den okända rumsliga fördelningen av det fluorescerande färgämnet (av provet). De störningar fransar som bildas av de två mönster koda för annars omöjlig att skilja fina detaljer med normala wide-field mikroskopi. Den slutliga super-lösta bilden erhålls genom att kombinera och avkoda med matematiska metoder flera råa bilder av samma prov som erhållits genom översättningar och rotationer av diffraction galler. Upplösningen på de super-lösta bilderna når 100 nm i den laterala och 500 nm i axiella riktningar för 2D-SIM15 eller 100 nm i den laterala och 250 nm i axial riktningar för 3D-SIM16.
Den nya förståelsen av synapsen är ännu viktigare i ljuset av de många neurologiska sjukdomar där synaptisk dysfunktion spelar en stor roll i debuten och progression17,18. Alzheimers sjukdom, Downs syndrom, Parkinsons sjukdom, prionsjukdomar, epilepsi, autismspektrumstörningar och bräckligt X syndrom bland andra har kopplats till avvikelser i synapssammansättning, morfologioch funktion 19,20,21,22.
Nyligen, med hjälp av en uppsättning SUMO-specifika antikroppar, vi använde SIM för att visa samlokalisering i primära hippocampus nervceller av SUMO-proteinerna med pre- och post-synapsmarkörer synaptophysin och PSD95 på super-upplösning nivå23. Detta gjorde det möjligt för oss att bekräfta biokemiska och konfokala mikroskopi bevis på SUMO lokalisering i nervceller.
Här beskriver vi ett protokoll för att studera lokalisering av proteiner i mus hippocampus primära nervceller. Samtidigt kan detta protokoll anpassas till olika typer av primära neuronala kulturer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue solution&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15250061</td>
			<td >Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibody SENP1</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-271360</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >17504044</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CaCl2</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >21115</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chambered coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DyLight</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (Hyclone)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SH3007002 (CHA1111L)</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow&#8211;green fluorescent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8803</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >G8769</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td>H3537</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Cystein&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MAP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AB15452</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM&#160;</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21575022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >M8266</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaOH</td>
			<td >VWR International</td>
			<td>1,091,371,000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal A</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10888022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-SIM Super Resolution Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Papain</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td >P-3125</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/Strep 10x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >15140122</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-L lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProLong Diamond Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PSD95&#160;</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>K28/43</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round coverglass</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12052712</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SUMO1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32058</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptophysin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5768&#160;</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin inhibitor&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>T9003-500MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons

Synapser är de funktionella elementen i nervceller och deras defekter eller förluster ligger på grundval av flera neurodegenerativa och neurologiska sjukdomar. Imaging studier används ofta för att undersöka deras funktion och plasticitet i fysiologiska och patologiska förhållanden. På grund av deras storlek och struktur kräver lokaliseringsstudier av proteiner högupplösta avbildningstekniker. I detta protokoll beskriver vi ett förfarande för att studera i primära nervceller samlokalisering av målproteiner med synaptiska markörer på en super-upplösning nivå med hjälp av strukturerad belysning mikroskopi (SIM). SIM är en mönstrad ljus belysning teknik som fördubblar den rumsliga upplösningen av breda fält mikroskopi, nå en detalj på cirka 100 nm. Protokollet anger de kontroller och inställningar som krävs för robusta samlokaliseringsstudier och en översikt över de statistiska metoderna för att analysera bilddata ordentligt.

Vi presenterar här standard arbetsflödet för att studera neuronal proteiner co-lokalisering. Vi kalibrerade först mikroskopet och nästa vi utförde SIM-analys av proverna. För att kalibrera systemet använde vi fluorescerande mikrosfärer med 0,1 μm diameter. Vid erhållande super-löst 3D-SIM bilder av pärlorna, är den underliggande bilddata Fourier-omvandlas för att åter konvertera dem till en rumslig frekvens representation. I figur 2Apresenteras det distinkta blommönstret som...

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons at JoVE.com

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Detta protokoll visar hur man använder super-upplösning mikroskopi för att studera protein medlokalisering i primära neuronala kulturer.

Super-Resolution Imaging att studera samlokalisering av proteiner och synaptiska markörer i primära nervceller

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Synapser är de funktionella elementen i nervceller och deras defekter eller förluster ligger på grundval av flera neurodegenerativa och neurologiska sjukdomar. Imaging studier används ofta för att undersöka deras funktion och plasticitet i fysiologiska och patologiska förhållanden. På grund av deras storlek och struktur kräver lokaliseringsstudier av proteiner högupplösta avbildningstekniker.I detta protokoll beskriver vi ett förfarande för att studera i primära nervceller samlokalisering av målproteiner med synaptiska markörer på en super-upplösning nivå med hjälp av strukturerad belysning mikroskopi. SIM är en mönstrad ljus belysning teknik som fördubblar den rumsliga upplösningen av widefield mikroskopi, nå en detalj på cirka 100 nanometer. Protokollet anger de kontroller och inställningar som krävs för robusta samlokaliseringsstudier och en översikt över de statistiska metoderna för att analysera bilddata ordentligt.Nyckeln till att tillåta analysen på en superupplösningsnivå är dock de reagenser som används vid förvärvet, såsom kammaröverdrag och monteringslösningar som är kompatibla med syftets diffraktionsindex. För att erhålla en mus hippocampus primära neuron, isolera hippocampi från P1 till P4 valpar. Plattceller vid 70, 000 celler per brunn i en volym av 200 mikroliter per brunn.Vänta tills hippocampus primära nervceller är fullt mognat 12 till 14 dagar efter plätering att utföra samlokalisering studier. Lägg till 4%paraformaldehyd, PFA, i PBS 200 mikroliter per brunn till nervceller för att fixa dem snabbt. Ta bort lösningen och inkubera proverna med 1%bovint serumalbumin, BSA, i PBS vid 200 mikroliter per brunn under en timme vid rumstemperatur för att passivt täcka alla fribindande ytor av plattan med ett irrelevant protein för analysen.En BSA-baserad blockerande buffert utan Triton X-100 minskar antikroppsbakgrunden effektivare än samma buffert med 0,2%Triton X-100. Lägg till den primära antikroppen. Som en negativ kontroll, tillsätt inte någon primär antikropp till en av brunnarna.Montera celler med hjälp av ett SIM-kompatibelt mountant, t ex ProLong Glass Antifade Mountant. Täck över och skydda cellerna med ett täckglas, till exempel ett runt täckglas med en diameter på åtta millimeter.Ruta ettor kan också användas. Förvara de kammade täcken i rumstemperatur och vänta minst 48 timmar innan du skaffar bilder. Diamantglas kräver minst två dagars härdning innan super-upplösning förvärv.Använd två strategier för att försäkra antikroppssysstlighet. Den första är användningen av minst två olika antikroppar riktade mot samma substrat. Den andra strategin är antikroppsneutralisering genom inkubation med det renade proteinmålet, eller det som används för att höja antikroppen.Vi använder rutinmässigt en N-SIM super-upplösning mikroskop som tillverkas av Nikon för vår analys. De anvisningar som följer är att vara avsedda för förvärv av SIM-bilder oberoende av mikroskopet av användning. Det är också viktigt att maximera mikroskopets prestanda för att utföra en noggrann kalibrering av instrumenten, inklusive korrigeringsring, laserinriktning och gallerblocksfokusering.Innan förvärvet av SIM-bilder, systemet kräver en ordentlig kalibrering med särskilda sub-resolution storlek lysrör pärlor. Ett exempel är TetraSpeck mikrosfärer. Dessa pärlor färgas med olika fluorescerande färgämnen för att möjliggöra kalibrering av olika lasrar med ett prov.I ett vattenbad, sonikera runt 1,8 gånger 10 till 8: e fluorescerande mikrosfärer i 10 minuter. Späd de fluorescerande mikrosfärerna en av 500 i dubbelt destillerat vatten. Sonikera en andra gång i ytterligare 10 minuter.Pipett 15 mikroliter av de utspädda pärlorna i en brunn av en kammare coverslip. Låt lösningen torka i fem minuter i rumstemperatur. Tillsätt 10 mikroliter av monteringslösningen, t.ex.ProLong Glas, och placera en åtta millimeter coverslip ovanpå. Vänta minst 48 timmar för att möjliggöra en ordentlig härdning. Slå på mikroskopet och lasrar.Låt systemet värmas upp för att nå termisk jämvikt av alla mikroskopkomponenter och SIM-mikroskopsystemet med superupplösning kräver minst tre timmar. Välj målsättningen 100X. Starta kalibreringen genom att rikta in lasrarna till mitten av diffraktionsgallerblocket.I N-SIM-systemet tillåter en mikrometerknopp och en dedikerad kamera centrering av ljusstrålarna till målet. Sätt in mikroskopets kammarkläp för visning. Ställ in systemet på den kammade täcktjockleken genom att justera det objektiva korrigeringsskyddet.NIS Software, den egenutvecklade programvara som tillhandahålls med N-SIM super-upplösning mikroskopsystem, har en automatisk funktion för att reglera korrigering av färger. Justera gallerblocksfokus för varje kanal för att säkerställa fokuserad strukturerad mönsterbelysning på provet. Programvaran ger en automatisk funktion för denna uppgift.Förvärva råa 3D SIM-bilder av multicolor mikrosfärer. Beräkna för varje separat våglängd den Fourier-transformen av den super-lösta bilden. Om den transformerade bilden inte lyckas få ett korrekt blomliknande mönster, startar du om kalibreringen sedan superupplösning inte har uppnåtts.I den supermatchade bilden väljer du en enda mikrosfär och beräknar dess intensitetsprofil för varje kanal för att mäta den upplösning som uppnåtts. Det bör nu vara nära 100 nanometer i stället. Utför kanalregistrering genom att överlagra ett flerkanalsförvärv av mikrosfärerna.Målet är att samverka alla kanalsignaler i alls och axiellt. Detta kommer att eliminera kromatiska avvikelser på grund av feljustering av de olika kanalerna och hjälpa samlokalisering analys. Bekräfta kvaliteten på kalibreringen genom att använda funktionerna belysning fas steg och belysning mönstrad fokus simcheck, en svit av plugins för den öppna källkoden ansökan ImageJ.Börja analysera provet med hjälp av ett 40X-mål i konfokalt eller vidfältsläge. Detta möjliggör navigering av provet, upprätthålla god detalj och ett stort synfält. Använd MAP2 antikroppssignal för att upptäcka ett område som representerar neuronala processer.Skaffa bilder av provet i konfokalt läge för att bestämma kvaliteten på färgningen. Byt till målsättningen 100X. Applicera olja på 100X-målsättningen.Skaffa en bredfältsbild eller konfokal bild som kommer att användas senare för att bedöma kvaliteten på den super-lösta bilden. Byt till 3D SIM-läge. Använda dialog fönster för att ställa in parametrarna för förvärv, välj den högsta bitdjupet inställningen tillgänglig för att maximera färginformation.Vanligtvis är 16 bitar standardvalet. För att förbättra signal-brusförhållandet väljer du dessutom ett lågfrekvent värde för förvärv, till exempel en megahertz. Använda histogram fönster, ställa in laser makt för att få en linjär svar av signal för att undvika förlust av information, begränsa mättade pixlar i bilderna.N-SIM-systemet använder en Andor iXon3-kamera. När du arbetar på 16 bitar, välj en målintensitet på 16, 000 för att säkerställa den linjära svar av kameran. Alternativt väljer du ett intervall mellan 30, 000 till 45, 000 för att maximera det dynamiska omfånget av förvärven.Ställ in lasereffekten mellan 0,1 %och 50 % när du avbildar proverna och exponeringstiderna mellan 50 millisekunder och två sekunder. Laserkrafter över 50 %kan orsaka snabb fotoblekning av de fluorforer som används. Börja skaffa bilderna i 3D SIM-läge.Använd SIMcheck, en svit av gratis plugins för ImageJ, för att bedöma kvaliteten på förvärv av de råa bilderna. Om SIMcheck inte upptäcker några artefakter eller problem kvalitet, skaffa ett minimum av 10 bilder från fullständiga tekniska replikat för att möjliggöra statistisk analys. Förvärvade bilder är rådata som måste bearbetas för att få rekonstruerade SIM-bilder som kommer att användas för vidare analys.I protokollet föreslår vi att använda synaptophysin och PSD-95 som pre och post synaptic markörer. Ytterligare markörer kan dock användas. En enorm litteraturkropp stöder användningen av andra proteiner, såsom drebrin och fagott som synaptiska markörer.3D SIM förvärvade bilder är råa bilder som måste bearbetas för att erhålla rekonstruerade super-lösta bilder. Felaktig rekonstruktion av råa bilder kan leda till artefakter som skulle påverka analysen av proverna. Stor uppmärksamhet bör därför ägnas åt att korrekt välja återuppbyggnadsparametrar.Bearbeta de råa bilderna med hjälp av mikroskoprekonstruktionsanalysprogramvaran för att få en superförenad bild. Alternativt, använda en fritt tillgänglig ImageJ plugin fairSIM att rekonstruera de råa bilder. Beräkna Fourier-transformeringen av de super-lösta bilderna med hjälp av mikroskoprekonstruktionsprogramvaran eller ImageJ-plugin-SIMcheck.En bra rekonstruerad bild bör återvända, för varje kanal, en blomma-liknande bild. Om de rekonstruerade bilderna misslyckas med att återskapa en blomliknande form startar du om från de obehandlade bilderna och rekonstruerar dem genom att ändra rekonstruktionsparametrar, till exempel linjär filtrering, apodization och zero order suppression. I NIS Software med hjälp av förhandsgranskningen för att övervaka hur ändra parametrarna påverkar den slutliga löst bild, ändra parameterns belysning modulering kontrast, högupplösta brusundertryckning, och ur fokus undertryckande.Analysera den rekonstruerade bilden för att opartiskt upptäcka artefakter genom att använda NanoJ-SQUIRREL, en ImageJ-baserad plugin, för att bedöma kvaliteten på super-lösta bilder. I vår analys av samlokalisering använde vi två tillvägagångssätt. Den första är ett visuellt tillvägagångssätt som bygger på den profilanalys som visar enstaka händelser av samlokalisering och som identifierar bidraget från varje kanal.Som ett första steg för att studera samlokalisering mellan synaptiska markörer och ett protein av intresse, ta en super-löst bild och analysera en enda locus att bestämma signal överlappning. Identifiera en enda locus på super-löst bild. Erhåll intensitetsprofilerna för de fluorescerande signalerna till locus av intresse.Om profilanalys har föreslagit enda locus samlokalisering, en mer allmän analys av hela bilden kan utföras genom att beräkna Pearsons och Manders koefficienter. Använd JACoP, en ImageJ plugin, för att bestämma två parametrar för samlokalisering, Pearsons och Mander's. Efter att ha kalibrerat systemet och bedömt kvaliteten på de rekonstruerade bilderna, började vi nästa analysera de primära neuronala kulturer färgas med en antikropp mot MAP2, en neuronal markör, PSD-95, en postsynaptic markör, och vårt mål protein SUMO1.Vi analyserade först provet utför fyra-kanals confocal mikroskopi med en 40X mål. Vid valet av ett område som representerar neuronala processer, bytte vi till en 100X mål. Vi förvärvade både confocal och SIM bilder av samma område för att bedöma kvaliteten på återuppbyggnaden med NanoJ-SQUIRREL och utföra samlokalisering analys.Att klarlägga synapsens struktur och sammansättning är avgörande för förståelsen av både fysiologiska och patologiska processer som reglerar minne och kognition. Medan i normalt tillstånd synapser är byggstenarna i minnet, de är också på grundval av komplexa neurologiska sjukdomar, såsom en av de vanligaste formerna av demens Alzheimers sjukdom. Det protokoll som beskrivs här möjliggör studier av proteinsammansättning av synapser med en super-upplösning mikroskopi teknik som kallas strukturerad belysning mikroskopi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection av Drosophila Neuron

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation av nervceller från Slices Gnagare Brain att studera synaptisk transmission och bild Presynaptiska Terminaler

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Lateral Diffusion och exocytos av membranproteiner i odlade nervceller utvärderas med hjälp av fluorescens återhämtning och fluorescens-förlust fotoblekning

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Imaging pHluorin-märkta receptor Insättning till plasmamembranet i primärt odlade mus Nervceller

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo Två-foton avbildning av erfarenhet beroende molekylära förändringar i kortikala neuron

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-upplösning avbildning av neurala Tät-core Blåsor

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Realtid avbildning av axonal transport av Quantum Dot-märkta BDNF i primära neuroner

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Mäta synaptiskt vesikelprotein endocytos i odlade nervceller i hippocampus

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellering neuronala dödsfall och Degeneration i mus primära cerebellär Granule nervceller

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

En optisk analys för synaptiskt vesikelprotein återvinning i odlade nervceller överuttryck av presynaptiska proteiner

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...