Name: assessing the expression of major histocompatibility complex class i on primary murine hippocampal neurons by flow cytometry
Uploaded: 2020-05-19T15:00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry at JoVE.com

Эта работа была поддержана NIA R00 AG053412 (KEF).

<ol>
	<li>Galea, I., Bechmann, I., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+immune+privilege+(not).">What is immune privilege (not).</a> Trends in Immunology. 28 (1), 12-18 (2007).</li><li>Morimoto, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Immune+System+in+the+Development+of+the+Central+Nervous+System.">Role of the Immune System in the Development of the Central Nervous System.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 916 (2019).</li><li>Klein, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+During+RNA+Viral+Infections.">Neuroinflammation During RNA Viral Infections.</a> Annual Review of Immunology. 37, 73-95 (2019).</li><li>Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+receptor+as+a+multicomponent+signalling+machine:+CD4/CD8+coreceptors+and+CD45+in+T+cell+activation.">The T cell receptor as a multicomponent signalling machine: CD4/CD8 coreceptors and CD45 in T cell activation.</a> Annual Review of Immunology. 10, 645-674 (1992).</li><li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding.">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 24, 343-368 (2008).</li><li>Donaldson, J. G., Williams, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Assembly+and+Trafficking+of+MHC+Class+I+Molecules.">Intracellular Assembly and Trafficking of MHC Class I Molecules.</a> Traffic. 10 (12), 1745-1752 (2009).</li><li>Charles, A., Janeway, J., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-mediated+cytotoxicity.">T cell-mediated cytotoxicity.</a> Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. , (2001).</li><li>Guidotti, L. G., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncytolytic+control+of+viral+infections+by+the+innate+and+adaptive+immune+response.">Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response.</a> Annual Review of Immunology. 19, 65-91 (2001).</li><li>Chevalier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+are+MHC+class+I-dependent+targets+for+CD8+T+cells+upon+neurotropic+viral+infection.">Neurons are MHC class I-dependent targets for CD8 T cells upon neurotropic viral infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (11), 1002393 (2011).</li><li>Shrestha, B., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD8++T+Cells+in+Control+of+West+Nile+Virus+Infection.">Role of CD8+ T Cells in Control of West Nile Virus Infection.</a> Journal of Virology. 78 (15), 8312-8321 (2004).</li><li>Plaisted, W. C., Weinger, J. G., Walsh, C. M., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+mediated+suppression+of+neurotropic+coronavirus+replication+in+neural+precursor+cells.">T cell mediated suppression of neurotropic coronavirus replication in neural precursor cells.</a> Virology. 449, 235-243 (2014).</li><li>Marten, N. W., Stohlman, S. A., Zhou, J., Bergmann, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+virus-specific+CD8++-T-cell+expansion+and+trafficking+following+central+nervous+system+infection.">Kinetics of virus-specific CD8+ -T-cell expansion and trafficking following central nervous system infection.</a> Journal of Virology. 77 (4), 2775-2778 (2003).</li><li>Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I:+an+unexpected+role+in+neuronal+plasticity.">MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity.</a> Neuron. 64 (1), 40-45 (2009).</li><li>Corriveau, R. A., Huh, G. S., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+class+I+MHC+gene+expression+in+the+developing+and+mature+CNS+by+neural+activity.">Regulation of class I MHC gene expression in the developing and mature CNS by neural activity.</a> Neuron. 21 (3), 505-520 (1998).</li><li>Goddard, C. A., Butts, D. A., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CNS+synapses+by+neuronal+MHC+class+I.">Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (16), 6828-6833 (2007).</li><li>Needleman, L. A., Liu, X. B., El-Sabeawy, F., Jones, E. G., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I+molecules+are+present+both+pre-+and+postsynaptically+in+the+visual+cortex+during+postnatal+development+and+in+adulthood.">MHC class I molecules are present both pre- and postsynaptically in the visual cortex during postnatal development and in adulthood.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16999-17004 (2010).</li><li>Syken, J., Grandpre, T., Kanold, P. O., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PirB+restricts+ocular-dominance+plasticity+in+visual+cortex.">PirB restricts ocular-dominance plasticity in visual cortex.</a> Science. 313 (5794), 1795-1800 (2006).</li><li>Atwal, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PirB+is+a+functional+receptor+for+myelin+inhibitors+of+axonal+regeneration.">PirB is a functional receptor for myelin inhibitors of axonal regeneration.</a> Science. 322 (5903), 967-970 (2008).</li><li>Takai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+immunoglobulin-like+receptors+and+their+MHC+class+I+recognition.">Paired immunoglobulin-like receptors and their MHC class I recognition.</a> Immunology. 115 (4), 433-440 (2005).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+elimination+and+learning+rules+co-regulated+by+MHC+class+I+H2-Db.">Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db.</a> Nature. 509 (7499), 195-200 (2014).</li><li>Ribic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+MHC+class+I+expression+in+the+developing+primary+visual+cortex+of+the+common+marmoset+monkey.">Activity-dependent regulation of MHC class I expression in the developing primary visual cortex of the common marmoset monkey.</a> Behavioral and Brain Functions. 7, 1 (2011).</li><li>Sahu, M. P., Nikkil&#228;, O., L&#229;gas, S., Kolehmainen, S., Castr&#233;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+primary+neurons+from+rat+hippocampus+and+cortex.">Culturing primary neurons from rat hippocampus and cortex.</a> Neuronal Signaling. 3 (2), (2019).</li><li>Gordon, J., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).</li><li>Zhang, X., Hu, D., Shang, Y., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+induced+pluripotent+stem+cell+neuronal+models+to+study+neurodegenerative+diseases.">Using induced pluripotent stem cell neuronal models to study neurodegenerative diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1866 (4), 165431 (2020).</li><li>Berry, B. J., Smith, A. S. T., Young, J. E., Mack, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Current+Challenges+Associated+with+the+Use+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Modeling+Neurodegenerative+Disease.">Advances and Current Challenges Associated with the Use of Human Induced Pluripotent Stem Cells in Modeling Neurodegenerative Disease.</a> Cells, Tissues, Organs. 205 (5-6), 331-349 (2018).</li><li>Ho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Single-Cell+Transcriptomics+in+Adult+Rodent+Brain:+The+Medium+Spiny+Neuron+Transcriptome+Revisited.">A Guide to Single-Cell Transcriptomics in Adult Rodent Brain: The Medium Spiny Neuron Transcriptome Revisited.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 159 (2018).</li><li>Panchision, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Flow+Cytometric+Analysis+of+Central+Nervous+System+Tissue+Reveals+Novel+Functional+Relationships+Among+Cells+Expressing+CD133,+CD15,+and+CD24.">Optimized Flow Cytometric Analysis of Central Nervous System Tissue Reveals Novel Functional Relationships Among Cells Expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).</li><li>Snaidero, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+at+a+glance.">Myelination at a glance.</a> Journal of Cell Science. 127 (14), 2999-3004 (2014).</li><li>Martin, D., Xu, J., Porretta, C., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurocytometry:+Flow+Cytometric+Sorting+of+Specific+Neuronal+Populations+from+Human+and+Rodent+Brain.">Neurocytometry: Flow Cytometric Sorting of Specific Neuronal Populations from Human and Rodent Brain.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 356-367 (2017).</li><li>Lv, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+MHC+Class+I+Expression+Is+Regulated+by+Activity+Driven+Calcium+Signaling.">Neuronal MHC Class I Expression Is Regulated by Activity Driven Calcium Signaling.</a> PLoS One. 10 (8), 0135223 (2015).</li><li>Barco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+facilitated+L-LTP+in+VP16-CREB+mice+reveals+that+BDNF+is+critical+for+the+maintenance+of+LTP+and+its+synaptic+capture.">Gene expression profiling of facilitated L-LTP in VP16-CREB mice reveals that BDNF is critical for the maintenance of LTP and its synaptic capture.</a> Neuron. 48 (1), 123-137 (2005).</li><li>Glynn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHCI+negatively+regulates+synapse+density+during+the+establishment+of+cortical+connections.">MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 442-451 (2011).</li><li>Facci, L., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Rodent+Cortical,+Hippocampal,+and+Striatal+Neurons.">Culture of Rodent Cortical, Hippocampal, and Striatal Neurons.</a> Methods Molecular Biology. 1727, 39-47 (2018).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Этот протокол описывает вскрытие и культуру первичных гиппокампа нейронов от пренатальных щенков мыши в эмбриональный день 18. Использование первичных нейронов, выуфрапаемых у грызунов, является одним из наиболее фундаментальных методологий, разработанных в современнойнейробиологии 22. Хотя увековеченные клеточные линии могут моделировать определенные аспекты нейронов, их природа как опухолевые клетки, неспособность разработать определенные аксоны, и продолжающееся деление клеток вызывает сомнения в том, что они точно подысовывляют свойства постмитотических нейронов in vivo23. Другой альтернативой первичным нейронам является использование индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (HiPSCs). Технология использования HiPSCs, особенно те, которые являются пациентом полученных, быстро продвинулась в последние годы24. Тем не менее, есть еще ограничения для работы с HiPSCs в том числе изменчивость между линиями клеток, отсутствие функциональной зрелости, и различия в эпигенетическихпрофилей 25. Хотя существуют также ограничения на работу с демоционистской моделью первичных нейронов грызунов, культурные нейроны сохраняют постмитотическую природу нейронов in vivo. Кроме того, экспансивные инструменты молекулярной биологии и генетические модификации, доступные для мышей, благоприятствуют использованию первичных нейронов над HiPSCs для многих применений, и исследования мышей могут быть легко переведены на более сложный организм in vivo, не теряя экспериментальной генетической системы. По этим причинам, многие исследователи используют первичные нейроны грызунов для проверки ключевых аспектов, если не основная часть, их исследований.
Для некоторых анализов, нейроны могут быть проанализированы непосредственно после изоляции от мозга ex vivo. Это особенно желательно для экспериментов с участием взрослых мышей, которые могут подвергаться определенным экспериментальным условиям или которые могут зависеть от взаимодействия нескольких типов клеток; однако существует ряд вопросов, которые ограничивают тип анализов, которые могут быть сделаны. Это технически сложно подготовить одноклеточную подвеску нейронов из мозга взрослых мышей, потому что нейроны однозначно взаимосвязаны и оболочки миелина26. Неизиматические методы тритурации тканей неэффективны при диссоциации тканей и вызывают гибель клеток, в то время как энзиматические препараты часто расщепляют поверхностныеантигены клеток 27. Кроме того, в то время как миелин в значительной степени отсутствует у эмбриональных мышей, он составляет около 20% взрослого мозга, и может ухудшить жизнеспособную изоляцию клеток и препятствовать анализуцитометрии потока 28. Многие из методов, которые были разработаны в конечном итоге полосы нейронов их цитозола и оставить небольшие, округлые тела клеток, которые состоят в основном изядер 29. Хотя это приемлемо для некоторых анализов, это не подходит для количественной оценки цитоплазмической или внеклеточной экспрессии белка. Кроме того, система культуры клеток-двойственных клеток позволяет тестировать конкретные механистические вопросы в более коротком масштабе времени, чем это часто возможно с системой in vivo.
В этом протоколе также описаны методы стимулирования фармакологическиго выражения MHCI с помощью ИФНЗ, а также количественная оценка внеклеточного выражения MHCI по цитометрии потока. Стимулирование СФНЗ является полезным положительным контролем для тестирования других экспериментальных условий, но можно отметить, что ИФНЗ и кайновая кислота также могут стимулировать выражение MHCIв нейронах 9,30, в то время как тетродотоксин уменьшает выражение MHCI14. Предыдущие методы обнаружения выражения MHCI опирались на гибридизацию на месте и иммуногистохимический анализ14,15,20,31. В то время как анализы на основе мРНК, такие как гибридизация на месте и qRT-PCR, могут определить патиотемпоральную локализацию, специфичность типа клеток и уровни транскрипции генов, эти анализы не могут оценить перевод белка или транспортировку к плазменной мембране. Иммуногистохимический и западный анализ помарки может определить различия в экспрессии белка и потенциально клеточной локализации, но может быть трудно точно количественно. Кроме того, многие антитела MHCI распознают третичную структуру комплекса и очень чувствительны к конформативным изменениям. Таким образом, проницаемость или денатурации условия приводят к потере иммунореактивности MHCI32. Представленный здесь метод использует иммуностимунизацию на месте для MHCI, что позволяет распознавание белка антителом в его родной конформации, а затем методы фиксации и пермеабилизации.
С небольшими изменениями, методы, описанные здесь могут быть использованы для культуры других популяций нейронов или для оценки выражения других внеклеточных белков, представляющих интерес. В этом протоколе отмечены простые изменения, которые могут быть сделаны для того, чтобы культура корковых нейронов, но методы, описанные здесь также могут быть использованы для культуры других нейронных популяций, таких как стриатальные нейроны33. Кроме того, хотя этот протокол определяет иммуностимунирование MHCI и NeuN, другие клеточные маркеры могут быть определены аналогичным образом. В целом, внеклеточные маркеры можно рассматривать как MHCI и внутриклеточные маркеры можно рассматривать как NeuN. Однако следует отметить, что во время клеточной диссоциации от сомы отодряются аксональные проекции. Поскольку стратегия гэтинга, определенная здесь, отсеив клеточный мусор и фокусируется на маркере ядер нейронов NeuN, белки, которые выражаются исключительно в аксональных проекциях, могут не быть обнаружены.
До недавнего времени считалось, что нейроны выражают MHCI только в ответ на повреждение, инфекцию или стимуляцию цитокинов in vitro, чтобы задействовать цитотоксические CD8и Т-клетки 9. Новое исследование прояснит другую функцию MHCI в регулировании синаптических связей во время разработки13. Описанный здесь протокол использует IFN для стимулирования экспрессии MHCI в культурных нейронах wildtype, но аналогичные методы могут быть использованы с различными клеточными стимулами или генетическими модификациями для проверки конкретных гипотез. Этот метод позволит исследователям исследовать молекулярные механизмы, которые регулируют выражение MHCI, что улучшит понимание дихотомиозной роли MHCI на этих двух различных клеточных функций.

Центральная нервная система (ЦНС) когда-то считалась лишенной иммунного наблюдения, именуемого «иммуннымпривилегированным 1». Теперь ясно, что эта привилегия не приравнивается к абсолютному отсутствию иммунных компонентов, а, скорее, специализированные регулирования, которые функции по ограничению ущерба, связанного симмунопатологией 1. В самом деле, связь между ЦНС и иммунной системы является постоянный разговор, который необходим для здорового развития мозга и ответна инфекции 2,3.
Основные молекулы комплекса гистосовости I (MHCI) являются полигенными и полиморфными трансмембранными белками, наиболее известными своей функцией в представлениях антигенных пептидов CD8и Т-клеток во времяинфекции 4. Классические комплексы MHCI состоят из трансмембрана α цепи и внеклеточной световой цепи, называемой q2-микроглобулин. В α содержит полиморфную канавку, которая связывает антигенный пептид для представления5. Правильное выражение MHCI на внеклеточной мембране требует скоординированного действия молекулярных сопровождающихся в эндоплазмической цитулуме для обеспечения правильного складывания α-цепного и 2-микроглобулина вместе с загрузкой пептидного лигандавысокого сродства 5. Только после сборки комплексов MHCI они экспортируются из эндоплазмической цитулумы в плазменную мембрану6. После взаимодействия рецептора cognate T клеток с пептид-нагруженным комплексом MHCI,CD8 и T клетки опосредуют убийство клетки путем выпускать lytic гранулы содержа перфорин и granzymes или путем индуцировать апоптоз через связывая приемный устройства Fas на мембранеклетки цели 7. Кроме того, CD8и Т-клетки производят цитокины, такие как гамма-интерферон (ИФНЗ) и фактор некроза опухоли альфа (ТНФЗ), которые могут активировать противовирусные механизмы в инфицированных клетках без цитопатическихэффектов 8,9. Для многих нейротропных вирусов,CD8 и Т-клеток, необходимых для очищения инфекции от ЦНС10,11,12.
Ранее считалось, что нейроны выражают MHCI только в условиях повреждения, вирусной инфекции, или с стимуляцией цитокинов in vitro. Недавно исследования выявили роль для нейронального выражения MHCI в синаптической реконструкции ипластичности 13,14. Хотя точные механизмы, лежащие в основе регулирования синапса, не очень хорошо изучены, данные указывают на то, что уровень экспрессии MHCI регулируетсясинаптической активностью 15,16. Одна из гипотез утверждает, что нейроны выражают парный иммуноглобулин-как рецептор B (PirB) пресинаптически, который связывает MHCI трансинаптически13,17. Это взаимодействие инициирует сигнальный каскад PirB, который противостоит путям, участвующим в синаптической реконструкции, тем самым укрепляя и стабиливсинаптической связи 17,18,19. При отсутствии нейронной активности экспрессия MHCIснижается на 14,а потеря MHCI приводит к неполноценной ликвидации синапса и неправильной синаптическойсхеме 20,21.
Анализ, описанный здесь, который был адаптирован из Шевалье и др.9, использует поток цитометрического анализа для количественной оценки внеклеточного экспрессии белка MHCI на первичных культурах нейронов гиппокампа мурина. Этот протокол иллюстрирует первоначальные методы микродиссекции ткани гиппокампа от эмбриональных щенков мыши. Затем в нем подробно процессы для энзиматической и механической диссоциации тканей в одноклеточную подвеску и методы поддержания культур впробирке. Потому что они не делят, как только они находятся в культуре, нейроны должны быть помыты в тарелке и плотности подходит для их экспериментальной конечной точки. Далее в нем излагаются шаги по индуцированию экспрессии MHCI с помощью бета-интерферона (ИФНЗ), иммунолабеля для MHCI и маркера нейронных ядер NeuN, а также анализ клеток с помощью цитометрии потока. Наконец, в нем описаны процедуры оценки цитометрии потока для идентификации MHCI-положительных нейронов и количественной оценки уровня экспрессии MHCI. Также отмечены в этом протоколе небольшие корректировки, которые могут быть сделаны для того, чтобы культура корковых нейронов в дополнение к или вместо гиппокампа нейронов. Этот протокол может быть легко изменен для проверки конкретных гипотез с использованием генетических вариаций или фармакологических методов лечения.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm sterile culture dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB012924</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge Tubes</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>21-103</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>21-108</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>FACS Buffer Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP82031Gal</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom plate</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-221</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borate Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28341</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Pasteur Pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13 678 20C</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13 151 014</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>90083</td>
			<td>Dissociation Solution Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-235</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91113-10</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fix and Perm Cell Permeabilization Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>GAS003</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-E Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1247601</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Sealing Sterilization Pouches</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>181254</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon Beta</td>
			<td>PBL Assay Science</td>
			<td>12405-1</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td>Flow Cytometry Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116513</td>
			<td>Flow Cytometry Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Solution</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>Dissociation Solution Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Pattern Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91100-12</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo dissection microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>M29TZ-SM99CL-BTW1</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91401-10</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipets</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357575</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101319</td>
			<td>Flow Cytometry Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the expression of major histocompatibility complex class i on primary murine hippocampal neurons by flow cytometry

Увеличение доказательств подтверждает гипотезу о том, что нейроиммунерные взаимодействия влияют на функцию нервной системы как в гомеостатических, так и в патологических условиях. Хорошо изученной функцией основных гистосовместимости комплексного класса I (MHCI) является представление пептидов, полученных клетками, для адаптивной иммунной системы, особенно в ответ на инфекцию. Совсем недавно было показано, что выражение молекул MHCI на нейронах может модулировать деятельность зависимых изменений в синаптической связи во время нормального развития и неврологических расстройств. Важность этих функций для здоровья мозга поддерживает необходимость чувствительного анализа, который легко обнаруживает выражение MHCI на нейронах. Здесь мы описываем метод первичной культуры нейронов гиппокампа мурина, а затем оценку экспрессии MHCI с помощью цитометрического анализа потока. Гиппокамп Мурина микродисципирован из пренатальных щенков мыши в эмбриональный день 18. Ткань разобщается в одноклеточную подвеску с использованием энзиматических и механических методов, а затем культурируется в безотхвосточном средстве массовой информации, что ограничивает рост не нейрональных клеток. После 7 дней в пробирке, выражение MHCI стимулируется путем лечения культурных клеток фармакологически с бета-интерферона. Молекулы MHCI помечены на месте флуоресцентно помеченными антителами, затем клетки не мезизматически разобщены в одноклеточную подвеску. Чтобы подтвердить нейронную идентичность, клетки фиксируются параформальдегидом, проницаемы и помечены флуоресцентно помеченными антителами, которые распознает нейрональный ядерный антиген NeuN. Выражение MHCI затем количественно на нейроны по потоку цитометрического анализа. Нейронными культурами можно легко манипулировать либо генетическими модификациями, либо фармакологическими вмешательствами для проверки конкретных гипотез. С небольшими изменениями, эти методы могут быть использованы для культуры других популяций нейронов или для оценки выражения других белков, представляющих интерес.

Используя представленную здесь процедуру, ткань гиппокампа была расчленена из пренатальных щенков мышей в эмбриональный день 18. Ткань была разобщена в одноклеточную суспензию с использованием энзиматических и механических методов, а затем отработалась в 12 хорошо пластин, которые были предварительно обработаны поли-D-лизин. После 7 дней в пробирке, клетки были обработаны с 100 U/mL ИФН или средств массовой информации только для 72 ч, которые стимулировали выражение MHCI. Нейроны были окрашены на месте для MHCI, прежде чем быть не-энзиматично разобщены в одной клеточной подвески. Нейроны были зафиксированы и проницаемы, затем окрашены внутриклеточно для нейрональных ядер маркер NeuN. Образцы оценивались по цитометрии потока, а данные анализировались с помощью связанного программного обеспечения. Нейроны были выявлены путем последовательного gating общих событий, чтобы исключить клеточный мусор и дублеты (Рисунок 1A,B). Нейроны были окончательно определены NeuN-положительность (Рисунок 1C). Клетки NeuN были дополнительно проанализированы на МХКИ-позитив путем построения клеток на гистограмме с количеством клеток, нормализованных в режиме на йосе и флуоресценции MHCI на х-оси. Ворота MHCIи были нарисованы в точке, где положительные и отрицательные пики разошлись(рисунок 1D). Из этого, процент нейронов положительный для окрашивания MHCI(рисунок 1E) и медианной интенсивности флуоресценции (МФО; Рисунок 1F) были рассчитаны. Результаты показывают, что лечение ИФНС значительно улучшило процент нейронов, положительных для внеклеточного окрашивания MHCI, а также уровень экспрессии, как указано МФО. Статистический анализ и графическое представление были сделаны с использованием коммерчески доступного статистического программного обеспечения.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2.jpg"> Рисунок 1: Репрезентативная стратегия гэтинга и количественная оценка MHCI. Первичные гиппокамповые нейроны лечились только 100 U/mL ИФН или мультимедиа. После 72 ч, нейроны были окрашены внеклеточно с Pacific Blue-спряженных MHCI (1 мкг / мл H2-Kb), а затем внутриклеточно помечены PE-спряженных NeuN (1:100 разбавления). Клеточная флуоресценция оценивалась цитометрией потока, анализировались данные. (A) Всего событий были построены как SSC-A (журнал) против FSC-A (линейный), и клетки (P1) были закрыты, чтобы исключить мусор. (B)В популяции P1 ячейки были построены как FSC-H (линейный) против FSC-A (линейный) для ворот одной популяции клеток. (C)В пределах одноклеточной популяции ячейки были построены SSC-A (журнал) против NeuN-PE (журнал). NeuNклетки были закрыты для идентификации нейронов. (D)В популяции нейронов, клетки были построены на гистограмме с MHCI-PacBlu на x-оси и номера клеток нормализовались, чтобы режим на оси. Горизонтальные ворота были нарисованы для количественной оценки процент нейронов положительные для окрашивания MHCI. (E ) Количественная оценка процентов MHCIи NeuN- клеток только в средствах массовой информации и IFN- обработанных нейронов. (F)Количественная оценка средней интенсивности флуоресценции (МФО) MHCI на NeuNи клетках в средствах массовой информации (черный) и IFN- обработанных (красных) нейронов. Статистическая значимость была рассчитана неоплаченным тестом t. Вопрос, P < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Средства роста нейронов (50 мл)</td>
		</tr>
<tr>
<td>реагент</td>
			<td>Окончательная концентрация</td>
			<td>Концентрация запасов</td>
			<td>За 50 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Дополнение B27</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>1,0 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-глутамин</td>
			<td>2 мМ</td>
			<td>200 мМ</td>
			<td>0,5 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Пенициллин-Стрептомицин</td>
			<td>100 U/мл</td>
			<td>10 000 U/ml</td>
			<td>0,5 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Нейробазальные средства массовой информации</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>48,0 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Буфер FACS (500 мл)</td>
		</tr>
<tr>
<td>реагент</td>
			<td>Окончательная концентрация</td>
			<td>Концентрация запасов</td>
			<td>За 500 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Сыворотка из плода крупного рогатого скота</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>10 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Эдта</td>
			<td>1 мМ</td>
			<td>500 мМ</td>
			<td>1 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>dPBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>489 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Решение о диссоциации папайна</td>
		</tr>
<tr>
<td>реагент</td>
			<td>Окончательная концентрация</td>
			<td>Концентрация запасов</td>
			<td>На 1 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Подвеска Папаин</td>
			<td>20 U/мл</td>
			<td>1000 U/мл</td>
			<td>0,020 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase I</td>
			<td>2,5 U/мл</td>
			<td>2500 U/мл</td>
			<td>0,001 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Спячка-E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,0 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Примечание: Объем необходимого раствора диссоциации папаина будет варьироваться в зависимости от количества вскрытых эмбриональных мозгов. Подготовка 0,5 мл на мозг для гиппокампа нейронов или 1,0 мл на мозг для корковых нейронов.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Примечание: Подготовьте решение диссоциации путем вихревой подвески папаина в Hibernate-E в течение 3 мин. После того, как папаин тщательно растворяется, добавьте DNase I. Не вихрь DNase I.</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Средства массовой информации и решения.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry at JoVE.com

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Этот протокол описывает метод культивирования первичных нейронов гиппокампа из эмбрионального мозга мыши. Выражение основных гистосовместимости сложного класса I на внеклеточной поверхности культурных нейронов затем оценивается с помощью цитометрического анализа потока.

Оценка экспрессии основных гистосовместимости комплекс класса I на первичном Murine гиппокампа нейронов потока цитометрии

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Проточной цитометрии анализа иммунных клеток мышей В аорты

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Человек In Vitro Борьбе как инструмент для скрининга Признание ранней стадии иммунного дисбаланса

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Экспертиза тимуса позитивной и негативной селекции с помощью проточной цитометрии

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Обнаружение Люминесцентные наночастиц Взаимодействие с первичного иммунного субпопуляциях Сотовые помощью проточной цитометрии

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

В Ситу обнаружения Аутореактивных CD4 Т-клеток в мозг и сердце Использование главного комплекса гистосовместимости Dextramers комплекс класса II

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Флуоресценция активированных сортировки клеток для очистки плазмоцитов дендритных клеток из костного мозга мыши

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Оценка сетчатке микроглии фагоцитарной функции<em&gt; В Vivo</em&gt; С использованием анализа проточной цитометрии на основе

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Флуоресцентный на основе нейраминидазы Анализ ингибирования для оценки восприимчивости вирусов гриппа к нейраминидазы Ингибитор классу противовирусных препаратов

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Изоляции и в пробирке культуры мышиных и человека альвеолярные макрофаги

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Характеристика человека Моноцит подмножеств по цельной крови Cytometry анализ потока

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...