Name: obtaining human microglia from adult human brain tissue
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue at JoVE.com

تم تأسيس مختبر SJ بمنح مؤسسية من IITJ ويتم تمويله من خلال منح من إدارة التكنولوجيا الحيوية (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) ووزارة الإلكترونيات وتكنولوجيا المعلومات الحكومية في الهند (No.4(16)/2019-ITEA). تم الحصول على أقسام أنسجة الدماغ البشري من معهد عموم الهند للعلوم الطبية (AIIMS) جودبور بعد موافقة لجنة الأخلاقيات المؤسسية. نشكر مايانك راثور، عضو B.Tech Student في جمعية التصميم والفنون IIT Jodhpur، لدعم التصوير بالفيديو.

تم الحصول على جميع الأنسجة بعد موافقة أخلاقية من لجان أخلاقيات المعهد الهندي للتكنولوجيا جودبور ومعهد عموم الهند للعلوم الطبية (AIIMS) جودبور.
1.نسيج اكتساب وتجهيز (يوم 0)
<ol><li>جمع الأنسجة في أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل من الجليد السائل النخاعي الاصطناعي البارد (aCSF) (2 mM CaCl2∙ 2...

<ol>
	<li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+-+more+than+just+brain+glue.">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li><li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+Beyond:+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function.">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li><li>Gordon, S., Pl&#252;ddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+heterogeneity+in+tissues:+phenotypic+diversity+and+functions.">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease:+A+microglial+conundrum.">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li><li>Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+phagocytic+clearance+in+Parkinson's+disease.">Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).</li><li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functions+of+Microglia+in+Ischemic+Stroke.">Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).</li><li>Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Central+Nervous+System+Inflammation+and+Multiple+Sclerosis+Pathology.">Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology.</a> Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).</li><li>Loane, D. J., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+TBI+brain:+The+good,+the+bad,+and+the+dysregulated.">Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated.</a> Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).</li><li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neuropathic+pain:+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential.">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).</li><li>Bellver-Landete, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+are+an+essential+component+of+the+neuroprotective+scar+that+forms+after+spinal+cord+injury.">Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury.</a> Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).</li><li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/Brain+Macrophages+as+Central+Drivers+of+Brain+Tumor+Pathobiology.">Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li><li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+side+of+microglia.">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Brain+Myeloid+Expression+Profiles+Reveal+Distinct+Microglial+Activation+States+and+Aspects+of+Alzheimer's+Disease+Not+Evident+in+Mouse+Models.">Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+Alzheimer's+disease-associated+genes+in+primary+human+microglia.">PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).</li><li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile.">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55 (4), 412-424 (2007).</li><li>Mizee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+microglia+from+the+human+post-mortem+brain:+effects+of+ante-+and+post-mortem+variables.">Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+enriched+primary+human+microglia+for+functional+studies.">Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies.</a> Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).</li><li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics.">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li><li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples.">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inflammasome+Sensor,+NLRP3,+Regulates+CNS+Inflammation+and+Demyelination+via+Caspase-1+and+Interleukin-18.">The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).</li><li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes.">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li><li>Plant, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphotoxin+beta+receptor+(Lt+betaR):+dual+roles+in+demyelination+and+remyelination+and+successful+therapeutic+intervention+using+Lt+betaR-Ig+protein.">Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model.">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination.">TNF&#945; promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li><li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+macrophage+production.">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).</li><li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant.">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li><li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells.">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li></ol>

Microglia ضمان التوازن في الدماغ العادي وتلعب أدوارا مركزية في علم الفيزيولوجيا المرضية من مختلف الأمراض العصبية4. Microglia هي مركزية لنماء الأعصاب وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي2. وقد أثبتت الدراسات microglial محوري في فهم تطور وتطور الأمراض العصبية المتنوعة4. microg...

تم بناء الجهاز العصبي المركزي (CNS) من شبكة معقدة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية1. بين الخلايا الدبقية، وظيفة microglia كالخلايا المناعية الفطرية من الجهاز العصبي المركزي2،3. Microglia هي المسؤولة عن الحفاظ على التوازن في الجهاز العصبي المركزي صحية4. Microglia تلعب أيضا دورا هاما في النمو العصبي، عن طريق تقليم نقاط الاشتباك العصبي2. Microglia هي مركزية في علم الفيزيولوجيا المرضية من عدة أمراض عصبية بما في ذلك ولكن لا تقتصر على; مرض الزهايمر5, مرض باركنسون6, السكتة الدماغية7, التصلب المتعدد8, إصابة الدماغ الرضية9, آلام الأعصاب10, إصابة الحبل الشوكي11 وأورام الدماغ مثل الأورام الدبقية12.
الدراسات المتعلقة بالسوستاسيس CNS والأمراض استخدام microglia القوارض بسبب ندرة كفاءة التكلفة والوقت كفاءة الإنسان microglia بروتوكولات العزلة الأساسية13. القوارض microglia تشبه microglia الإنسان الأولية في التعبير عن الجينات مثل Iba-1، PU.1، DAP12 ومستقبلات M-CSF وكانت فعالة في فهم الدماغ العادي وكذلك المريض13. ومن المثير للاهتمام، والتعبير عن العديد من الجينات المناعية ذات الصلة مثل TLR4، MHC الثاني، Siglec-11 وسيجلج-3 يختلف بين الإنسان والقوارض microglia13. التعبير عن العديد من الجينات يختلف أيضا في التعبير الصدغي والأمراض العصبية في كلا النوعين14,15. هذه الاختلافات الكبيرة تجعل من ميكروجليا الإنسان نموذجا أساسيا لدراسة وظيفة microglia في التوازن والمرض. يمكن أن تكون ميكروجليا الإنسان الأولية أيضا أداة فعالة للفحص قبل الإكلينيكي للمرشحين المحتملين المخدرات16. وتؤكد الأسباب المذكورة أعلاه الحاجة المتزايدة إلى بروتوكولات فعالة من حيث التكلفة لعزل الغليا البشري الأولي.
لقد وضعنا بروتوكول لعزل ميكروليا الإنسان الأولية من أنسجة الدماغ البشرية الكبار التي تم جمعها نتيجة نافذة جراحية تم إنشاؤها لاستئصال الورم أو ال استئصالات جراحية أخرى. الأسلوب هنا يختلف بشكل كبير عن الأساليب الموجودة. تمكنا من عزل واستزراع الميكولا بعد مرور 75 دقيقة من موقع جمع الأنسجة إلى بدء بروتوكول العزل في المختبر. لقد استخدمنا سوبرات من الخلايا الليفية L929 لتعزيز نمو microglia معزولة. تركز هذه الطريقة على وجه التحديد على ثقافة وتطوير ميكروجليا الأولية فقط. الثقافة الناتجة عن إعداد حوالي 80٪ microglia. بينما البروتوكولات الأخرى توفر ثقافة غنية من microglia بالانقسام المركزي للانقسام الانحدار الكثافة ، cytometry التدفق والخرز المغناطيسي ، فإن البروتوكول هو طريقة سريعة وبسيطة وقوية وفعالة من حيث التكلفة لثقافة ميكروجليا الإنسان الأولية17،18،19،20. القدرة على استخدام جراحيا إزالة حية أنسجة المخ الكبار بدلا من أنسجة الدماغ الثابتة من الجثث يثبت ميزة إضافية من هذه الطريقة على النقيض من الإجراءات القائمة18,21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>A002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (4 &#176;C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>146532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>New Brunswik</td>
			<td>Galaxy 170 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium with glutamine</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>AL007S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM9955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flacon tube (50 ml)</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>50CD1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1</td>
			<td>Vector</td>
			<td>FL-1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>GA5</td>
			<td>3670S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswik Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC&#160;CCL-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar air flow</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monosodium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Mixture F-12 Ham Medium</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Al106S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td>237554805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>ML023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Labware</td>
			<td>LW-SP1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.2&#956;, 25 mm diameter)</td>
			<td>Axiva</td>
			<td>SFPV25R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture.</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TCG4-20X10NO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining human microglia from adult human brain tissue

Microglia هي الخلايا المناعية الفطرية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS). تلعب Microglia دورًا حاسمًا أثناء التطوير ، وفي الحفاظ على التوازن ، وأثناء الإصابة أو العدوى. وقد سلطت عدة مجموعات بحثية مستقلة الضوء على الدور المركزي الذي تلعبه المايكجليا في أمراض المناعة الذاتية، ومتلازمات المناعة الذاتية والسرطانات. قد يؤدي تنشيط الوميكروجليا في بعض الأمراض العصبية إلى المشاركة مباشرة في العمليات المسببة للأمراض. microglia الأولية هي أداة قوية لفهم الاستجابات المناعية في الدماغ، والتفاعلات الخلية الخلية والأنماط الظاهرية microglia dysregulated في المرض. ميكروجليا الأولية تقليد في خصائص ميكروجليال الجسم الحي أفضل من خطوط الخلايا الصغيرة الخالدة. تظهر ميكروجليا الإنسان الكبار خصائص متميزة بالمقارنة مع الجنين البشري والقوارض microglia. يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة لعزل ميكروجليا الأولية عن الدماغ البشري البالغ. دراسة هذه microglia يمكن أن توفر رؤى حاسمة في التفاعلات الخلية الخلية بين microglia وغيرها من السكان الخلوية المقيمين في الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك، oligodendrocytes، الخلايا العصبية والخلايا الفلكية. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون مثقفة microglia من أدمغة بشرية مختلفة لتوصيف الاستجابات المناعية الفريدة للطب الشخصي وعدد لا يحصى من التطبيقات العلاجية.

باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه(الشكل 1) ، تمكنا من عزل ميكروجليا الإنسان الأولية من أنسجة الدماغ الحية التي تم استئصالها جراحيًا. كانت الخلايا المستزرعة ملطخة بالريسينوس كومونيس agglutinin-1 (RCA-1) للليكتين للميكروجليا (الأخضر) ومع البروتين الضبي الرجي?...

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue at JoVE.com

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

هذا البروتوكول هو وسيلة فعالة وفعالة من حيث التكلفة وقوية لعزل microglia الأولية من العيش، والكبار، أنسجة الدماغ البشرية. يمكن أن تكون ميكروجليا الإنسان المعزولة أداة لدراسة العمليات الخلوية في التوازن والمرض.

الحصول على ميكروجليا الإنسان من أنسجة الدماغ البشري الكبار

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

الهدف العام للبروتوكول هو عزل الخلايا الدقيقة الأولية من أنسجة الدماغ البشرية الحية للبالغين. في حالتنا، تم جمع هذه كنافذة جراحية أثناء الجراحة. ويتم ذلك عن طريق جمع أنسجة الدماغ في البداية في الجليد البارد PBS ، ثم يتم قطع الأنسجة إلى قطع مكعبات صغيرة 1 ملم ، وفعلت للتو بمساعدة التربسين EDTA.بعد ذلك، يتم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي ومطلية في قارورة مناسبة لثقافة الخلايا الاندروجين لمدة 48 ساعة. يتم حصاد الخلايا مرة أخرى من القارورة و مثقف حتى استخدام مزيد من. يمكن الآن أن تتميز الخلايا الدقيقة البشرية الأولية باستخدام الكيمياء المناعية وتستخدم لمزيد من التجربة.والميزة الرئيسية لبروتوكولنا لعزل الخلايا الصغيرة من أنسجة الدماغ البشرية البالغة هي أنها توفر بشكل فعال خلايا ميكروجليا الإنسان البالغة الأولية بطريقة فعالة للغاية من حيث التكلفة. البروتوكول قوي و فإنه يقلل من فقدان الخلايا عن طريق تقليل عدد الخطوات المستخدمة في البروتوكولات الموجودة. جمع الأنسجة في أنبوب فالكون 50 مل تحتوي على 10 مل من الجليد aCSF الباردة.امسح أنبوب الجمع بعناية مع 70٪ من الكحول ونقلها إلى غرفة تدفق الهواء المتعفنة. تخلص من aCSF بعناية ووزن الأنسجة في أنبوب فالكون. حساب الوزن تقريبا من الأنسجة عن طريق deducing وزن أنبوب فالكون فارغة.دافئ aCSF الطازجة إلى 37 درجة مئوية. الحفاظ على الأنسجة في aCSF الحارة لمدة خمس دقائق. هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لتجنب موت الخلايا.تجاهل ACSF بعناية. وغسل الأنسجة مرة واحدة مع 1X PBS ارتفعت درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. تأكد من غسل جميع الدم مع غسل برنامج تلفزيوني المتكررة حسب الحاجة.احتضان الأنسجة في برنامج تلفزيوني دافئ لمدة 5 دقائق. تجاهل نصف برنامج تلفزيوني بعناية. نقل الأنسجة جنبا إلى جنب مع برنامج تلفزيوني المتبقية إلى طبق بيتري تعقيم.إزالة برنامج تلفزيوني المتبقية بعناية مع ماصة 1 مل. وهذا سوف يمنع فقدان الأنسجة. النرد التي قضية على الأقل 1 ملم مكعب قطع صغيرة باستخدام مشرط معقم.أضف 2 مل من 0.25٪ التربسين EDTA إلى طبق بيتري وغسل الطبق جيدا مع مساعدة من الماصات. نقل النسيج مكعبات إلى أنبوب فالكون 50 مل تحتوي على 10 مل لكل غرام من 0.25٪ التربسين EDTA. مزيج عن طريق الأنابيب من خلال ماصة المصلية 10 مل.احتضان الأنبوب على شاكر لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية وسرعة 250 دورة في الدقيقة. إضافة 10 مل من تحييد المتوسطة لتحييد التربسين. اخلطي جيدا مع ماصة مصلية 10 مل.جهاز طرد مركزي الأنبوب في 2000G في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تجاهل افرا و resuspend بيليه في 1 مل من الثقافة المتوسطة. وضع الخلايا في قارورة T25 مناسبة لخلايا الاندروجين وإضافة 4 مل من ثقافة إضافية المتوسطة.الثقافة المتوسطة سوف تحتوي على 20٪ L929 فائقة و 1٪ ستريبتوميسين. من المستحسن إضافة L929 supernatant بشكل منفصل في قارور بدلا من إضافة إلى الأسهم ثقافة المتوسطة. لقد انتهينا من القارورة للتخلص من الأنسجة بشكل متجانس.تجنب جلب وسائل الإعلام إلى عنق القارورة في حين تهتز لأن هذا قد يزيد من فرص التلوث. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. جمع وسائل الإعلام من قارورة ثقافة T25 المعدة في اليوم 0 في أنابيب الطرد المركزي.أجهزة الطرد المركزي وسائل الإعلام التي تم جمعها في 1، 466G في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. في حين يتم طرد الوسائط التي تم جمعها ، اغسل قارورة اليوم 0 مرة واحدة مع PBS 1X. هز القارورة بلطف لإزالة أي بقايا الأنسجة شظايا اليسار.تجنب اهتزاز قاسية من قارورة كما أي بقايا شظايا لن تؤثر سلبا على الثقافة. أضف 5 مل من وسائل الإعلام الثقافية الطازجة إلى القارورة. تجاهل المُندفع من الأنابيب المُهزّقة.إضافة 1 مل من الثقافة المتوسطة إلى واحدة من الأنابيب واخلط جيدا مع ماصة. تسلسل إضافة الوسائط المختلطة مع الخلايا إلى أنابيب أخرى ومزيج شامل. وضع الخلايا في قارورة T25 منفصلة مناسبة لخلايا الاندروجين.أضف 4 مل من وسائل الإعلام الثقافية الطازجة إلى القارورة. احتضان كل من القارورة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. تجاهل وسائل الإعلام من كل من القارورة وإضافة وسائل الإعلام ثقافة 5 مل جديدة.احتضان القارورة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. في اليوم السادس، ستكون الخلايا جاهزة لمزيد من التجارب. في الصور الممثلة هنا.اللوحة الأولى من القسم a astrocytes ملطخة بـ GFAP ، خضراء اللون. في اللوحة الثانية، من القسم وصمة ميكروجليا مع RCA، والأخضر في اللون. في القسم B microglia ملطخة RCA، وهو أخضر اللون، وstrocytes ملطخة بGFAP، والأحمر في اللون.تراكب من الصور يظهر microglia وatrocytes معا. ومن الواضح من الصور أن غالبية الخلايا في الثقافة المعدة هي microglia. تم تحديد كمية الصور عن طريق السيطرة المكفوفين والنتيجة ممثلة في القسم C.The وأظهرت النتائج أن حوالي 80٪ من الخلايا في الثقافة المعدة هي خلايا microglia.يمكن تنفيذ هذه التقنية في حوالي ساعة ونصف الساعة. بعد هذا الإجراء يجب أن يكون لها فهم جيد لكيفية تحديد microglia فتيلة من أنسجة الدماغ البشرية الكبار, التي يمكن استخدامها كذلك لتجارب المصب.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

الجمع بين لعبة الكمبيوتر المستندة إلى تجارب السلوكي مع ارتفاع الكثافة تتبع النظرة EEG والأشعة تحت الحمراء

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

نهج السريع إلى التصوير الإسفار عالية الدقة في الدماغ شرائح شبه سميكة

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

السلف المستمدة من نظام الثقافة دبقية قليلة التغصن من دماغ الجنين البشري

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

الألياف الضوئية للزراعة تحفيز Optogenetic المزمن من أنسجة المخ

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

النسب-إعادة برمجة الخلايا المشتقة من خلية حوطية الدماغ البشري الكبار في الخلايا العصبية المستحثة

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

جيل بسيطة من ثقافة عالية الغلة المستحث الخلايا العصبية من الخلايا الليفية الجلد الكبار البشرية

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

عزل من الشعيرات الدموية الدماغية من أنسجة المخ البشري الطازج

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

العزلة واستخراج الحمض النووي الريبي للخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من العقول الزرد اليرقات

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

قصيرة الأجل الحرة العائمة شريحة الثقافات من الدماغ البشري الكبار

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

اعداد سطح القوقعة في فاره الكبار

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...