Name: obtaining human microglia from adult human brain tissue
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue at JoVE.com

SJ's laboratorium blev etableret med institutionelle tilskud fra IITJ og finansieres af tilskud fra Department of Biotechnology (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) og Ministeriet for Elektronik og Informationsteknologi regering i Indien (Nr. 4(16)/2019-ITEA). Den menneskelige hjernevæv sektioner blev opnået fra All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur efter institutionelle etiske komité clearance. Vi takker Mayank Rathor, B.Tech Student medlem af Design and Arts Society IIT Jodhpur, for videography støtte.

Alle væv blev erhvervet efter etisk godkendelse fra instituttet etiske udvalg af indiske Institute of Technology Jodhpur og All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.
1.Tissue erhvervelse og behandling (Dag 0)
<ol><li>Væv i et 50 ml rør indeholdende 10 ml iskold kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) (2 mM CaCl2 ∙2H2O 10 mM glukose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2∙6H2O, 202 mM sac...

<ol>
	<li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+-+more+than+just+brain+glue.">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li><li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+Beyond:+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function.">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li><li>Gordon, S., Pl&#252;ddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+heterogeneity+in+tissues:+phenotypic+diversity+and+functions.">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease:+A+microglial+conundrum.">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li><li>Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+phagocytic+clearance+in+Parkinson's+disease.">Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).</li><li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functions+of+Microglia+in+Ischemic+Stroke.">Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).</li><li>Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Central+Nervous+System+Inflammation+and+Multiple+Sclerosis+Pathology.">Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology.</a> Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).</li><li>Loane, D. J., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+TBI+brain:+The+good,+the+bad,+and+the+dysregulated.">Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated.</a> Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).</li><li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neuropathic+pain:+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential.">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).</li><li>Bellver-Landete, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+are+an+essential+component+of+the+neuroprotective+scar+that+forms+after+spinal+cord+injury.">Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury.</a> Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).</li><li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/Brain+Macrophages+as+Central+Drivers+of+Brain+Tumor+Pathobiology.">Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li><li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+side+of+microglia.">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Brain+Myeloid+Expression+Profiles+Reveal+Distinct+Microglial+Activation+States+and+Aspects+of+Alzheimer's+Disease+Not+Evident+in+Mouse+Models.">Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+Alzheimer's+disease-associated+genes+in+primary+human+microglia.">PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).</li><li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile.">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55 (4), 412-424 (2007).</li><li>Mizee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+microglia+from+the+human+post-mortem+brain:+effects+of+ante-+and+post-mortem+variables.">Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+enriched+primary+human+microglia+for+functional+studies.">Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies.</a> Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).</li><li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics.">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li><li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples.">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inflammasome+Sensor,+NLRP3,+Regulates+CNS+Inflammation+and+Demyelination+via+Caspase-1+and+Interleukin-18.">The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).</li><li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes.">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li><li>Plant, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphotoxin+beta+receptor+(Lt+betaR):+dual+roles+in+demyelination+and+remyelination+and+successful+therapeutic+intervention+using+Lt+betaR-Ig+protein.">Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model.">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination.">TNF&#945; promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li><li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+macrophage+production.">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).</li><li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant.">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li><li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells.">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li></ol>

Mikroglia sikre homøostase i den normale hjerne og spille centrale roller i patofysiologi af forskellige neurologiske sygdomme4. Mikroglia er centrale for neuroudvikling og dannelse af synapser2. Mikrogliale undersøgelser har vist sig afgørende for at forstå udviklingen og udviklingen af forskellige neurologiske sygdomme4. Gnavere mikroglia er den fremherskende model for valg for primære mikrogliale undersøgelser, selv om gnaver mikroglia er fo...

Centralnervesystemet (CNS) er konstrueret af et komplekst netværk af neuroner og gliaceller1. Blandt gliacellerne fungerer mikroglia som de medfødte immunceller i CNS2,3. Mikroglia er ansvarlige for at opretholde homøostase i den sunde CNS4. Microglia spiller også en vigtig rolle i neuroudvikling, ved beskæring synapser2. Mikroglia er centrale for patofysiologi af flere neurologiske sygdomme, herunder men ikke begrænset til; Alzheimers sygdom5, Parkinsons sygdom6, slagtilfælde7, multipel sklerose8, traumatisk hjerneskade9, neuropatisksmerte 10,rygmarvsskade11 og hjernetumorer såsom gliomer12.
Undersøgelser i forbindelse med CNS homøostase og sygdomme udnytter gnavere mikroglia på grund af en mangel på omkostningseffektive og tidseffektive menneskelige primære mikroglia isolation protokoller13. Gnavere mikroglia ligne primære humane mikroglia i udtryk for gener som Iba-1, PU.1, DAP12 og M-CSF receptor og har været effektive i forståelsen af normale såvel som syge hjerne13. Interessant, udtrykket af flere immun-relaterede gener såsom TLR4, MHC II, Siglec-11 og Siglec-3 varierer mellem menneskelige og gnaver mikroglia13. Ekspressionen af flere gener varierer også i tidsmæssigt udtryk og i neurodegenerative sygdomme hos begge art14,15. Disse betydelige forskelle gør humane mikroglia en væsentlig model til at studere mikroglia funktion i homøostase og sygdom. Primær human mikroglia kan også være et effektivt redskab til præklinisk screening af potentielle lægemiddelkandidater16. Ovennævnte årsager understreger det stigende behov for omkostningseffektive protokoller for isolering af primære humane mikroglia.
Vi har udviklet en protokol for isolering af primære menneskelige mikroglia fra voksne humane hjernevæv indsamlet som følge af kirurgisk vindue skabt til tumor resektion eller andre kirurgiske resektioner. Metoden her er væsentligt forskellig fra de eksisterende metoder. Vi var i stand til at isolere og kultur mikroglia efter en transit tid på omkring 75 minutter fra væv indsamling site til at starte isolation protokol i laboratoriet. Vi har brugt supernatant af L929 fibroblast celler til at fremme væksten af isolerede mikroglia. Denne metode fokuserer specifikt på kultur og udvikling af kun primære mikroglia. Den resulterende kultur forberedt er omkring 80% mikroglia. Mens andre protokoller giver en beriget kultur af mikroglia ved tæthed gradient centrifugering, flow cytometri og magnetiske perler, protokollen er en hurtig, enkel, robust og omkostningseffektiv måde at kultur primære menneskelige mikroglia17,18,19,20. Evnen til at udnytte kirurgisk fjernet levende voksen hjernevæv i stedet for faste hjernevæv fra kadavere viser en ekstra fordel ved denne metode i modsætning tileksisterende procedurer 18,21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>A002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (4 &#176;C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>146532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>New Brunswik</td>
			<td>Galaxy 170 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium with glutamine</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>AL007S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM9955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flacon tube (50 ml)</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>50CD1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1</td>
			<td>Vector</td>
			<td>FL-1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>GA5</td>
			<td>3670S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswik Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC&#160;CCL-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar air flow</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monosodium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Mixture F-12 Ham Medium</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Al106S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td>237554805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>ML023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Labware</td>
			<td>LW-SP1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.2&#956;, 25 mm diameter)</td>
			<td>Axiva</td>
			<td>SFPV25R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture.</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TCG4-20X10NO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining human microglia from adult human brain tissue

Mikroglia er hjemmehørende medfødte immunceller i centralnervesystemet (CNS). Microglia spiller en afgørende rolle under udviklingen, i at opretholde homøostase, og under infektion eller skade. Flere uafhængige forskningsgrupper har fremhævet den centrale rolle, som mikroglia spiller i autoimmune sygdomme, autoinflammatoriske syndromer og kræft. Aktivering af mikroglia i nogle neurologiske sygdomme kan direkte deltage i patogene processer. Primær mikroglia er et effektivt redskab til at forstå immunrespons i hjernen, celle-celle interaktioner og dysregulated mikroglia fænotyper i sygdom. Primære mikroglia efterligne in vivo mikrogliale egenskaber bedre end udødeliggjorte mikrogliale cellelinjer. Human voksen mikroglia udviser forskellige egenskaber i forhold til menneskelige føtal og gnaver mikroglia. Denne protokol giver en effektiv metode til isolering af primære mikroglia fra voksne menneskelige hjerne. Undersøgelse af disse mikroglia kan give kritisk indsigt i celle-celle interaktioner mellem mikroglia og andre hjemmehørende cellulære populationer i CNS, herunder oligodendrocytter, neuroner og astrocytter. Derudover kan mikroglia fra forskellige menneskelige hjerner dyrkes til karakterisering af unikke immunresponser for personlig medicin og et utal af terapeutiske anvendelser.

Ved at bruge ovennævnte protokol (Figur 1) var vi i stand til at isolere primære humane mikroglia fra levende kirurgisk resected hjernevæv. Kultiverede celler blev plettet med Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) lectin for mikroglia (grøn) og med Glial fibrillary acidic protein (GFAP) for astrocytter (rød) (Figur 2) som tidligere beskrevet22,23,...

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue at JoVE.com

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Denne protokol er en effektiv, omkostningseffektiv og robust metode til isolering af primære mikroglia fra levende, voksne, menneskelige hjernevæv. Isolerede primære menneskelige mikroglia kan tjene som et redskab til at studere cellulære processer i homøostase og sygdom.

Opnåelse humane mikroglia fra voksent humant hjernevæv

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Det overordnede mål med protokollen er at isolere primære mikrogliaceller fra levende voksne humane hjernevæv. I vores tilfælde blev dette indsamlet som kirurgisk vindue under operationen. Dette opnås ved i første omgang at indsamle hjernen væv i iskold PBS, er vævet derefter hakkede i 1-mm terning små stykker, og jeg gjorde bare ved hjælp af trypsin EDTA.Efter dette, cellerne er høstet ved centrifugering og belagt i en kolbe egnet til androgen celle kultur i 48 timer. Cellerne høstes igen fra kolben og dyrkes til videre brug. Primære humane mikrogliaceller kan nu karakteriseres ved hjælp af immunokytokemi og anvendes til yderligere forsøg.Den største fordel ved vores protokol for isolering af mikrogliaceller fra voksne humane hjernevæv er, at det effektivt giver primære voksne humane mikrogliaceller på en meget omkostningseffektiv måde. Protokollen er robust, og den reducerer tab af celler ved at reducere antallet af trin, der anvendes i eksisterende protokoller. Vævet opsamls i et 50-ml Falcon-rør, der indeholder 10 ml iskold aCSF.Afd indsamlingsrøret omhyggeligt med 70% alkohol og overfør til et aseptisk laminar luftstrømskammer. Kassér aCSF omhyggeligt og veje væv i Falcon røret. Vævs vægt beregnes ved at udlede vægten af det tomme Falcon-rør.Varm frisk aCSF til 37 grader celsius. Hold vævet i varm aCSF i fem minutter. Dette trin er afgørende for at undgå celledød.Kassér aCSF omhyggeligt. Og vask væv en gang med 1X PBS opvarmet til 37 grader celsius. Sørg for, at alt blod vaskes væk med gentagne PBS-vaske efter behov.Væv i varm PBS inkuberes i 5 minutter. Halvdelen af PBS kasseres omhyggeligt. Overfør væv sammen med resterende PBS til en steriliseret petriskål.Fjern den resterende PBS forsigtigt med 1-ml pipette. Dette vil forhindre tab af væv. Terninger, der udsteder i mindst 1-mm terning små stykker ved hjælp af en steril skalpel.Tilsæt 2 ml 0,25% trypsin EDTA til petriskål og vask pladen grundigt ved hjælp af pipetten. Det hakkede væv overføres til et 50-ml Falcon-rør med 10 ml pr. gramvæv på 0,25 % trypsin EDTA. Bland ved pipettering gennem en 10-ml serologisk pipette.Inkuber røret på en shaker i 30 minutter ved 37 grader celsius og hastigheden på 250 rpm. Tilføj 10 ml neutraliserende medium til at neutralisere trypsin. Bland grundigt med en 10-ml serologisk pipette.Centrifuge røret ved 2000G ved 4 grader celsius i 10 minutter. Kassér supernatanten og opspjæn pellet i 1 ml kulturmedium. Læg cellerne i en T25 kolbe egnet til androgen celler og tilsæt 4 ml ekstra kultur medium.Kultur medium vil indeholde 20% L929 supernatant og 1% streptomycin. Det anbefales at tilsætte L929 supernatant separat i kolber i stedet for at tilføje til bestanden kultur medium. Vi er færdige med kolben for at bortskaffe vævet homogent.Undgå at bringe mediet til kolbens hals under omrystning, da dette kan øge risikoen for kontaminering. Kolben inkuberes ved 37 grader celsius med 5 %CO2 i 48 timer. Indsamle medier fra T25 kulturkolbe forberedt på dag 0 i centrifuge rør.Centrifuge de indsamlede medier på 1, 466G ved 4 grader celsius i 4 minutter. Mens de indsamlede medier centrifugeres, vaskes dag 0-kolben én gang med 1X PBS. Kolben rystes forsigtigt for at fjerne eventuelle rester af vævsfragmenter tilbage.Undgå hård omrystning af kolben, da eventuelle rester fragmenter ikke vil påvirke kulturen negativt. Der tilsættes 5 ml frisk kulturmedier til kolben. Kassér supernatanten fra centrifugerede rør.Tilsæt 1 ml kulturmedium til et af rørene og bland grundigt med pipette. Serialt tilføje blandede medier med celler til andre rør og bland grundigt. Læg cellerne i en separat T25 kolbe egnet til androgen celler.Der tilsættes 4 ml friske kulturmedier til kolben. Der inkuberes begge kolber ved 37 grader celsius med 5 % CO2 i 48 timer. Smid mediet ud af begge kolber, og tilsæt friske 5 ml kulturmedier.Kolber ne hældes ved 37 grader celsius ved 5 %CO2 i 48 timer. På sjette dag vil cellerne være klar til yderligere eksperimenter. I de billeder, der repræsenteres her.Første panel af afsnittet A astrocytter farves med GFAP, grøn i farven. I det andet panel, af afsnit En mikroglia plet med RCA, grøn farve. I afsnittet B mikroglia farves med RCA, som er grøn i farven, og astrocytter er farves med GFAP, rød farve.Overlejring af billederne viser mikroglia og astrocytter sammen. Det fremgår klart af billederne, at størstedelen af cellerne i den forberedte kultur er mikroglia. Billederne blev kvantificeret af blindet kontrol og resultatet er repræsenteret i afsnit C.Resultaterne viste, at omkring 80% af cellerne i den forberedte kultur er mikrogliaceller.Denne teknik kan udføres i omkring en og en halv time. Efter denne procedure bør have en god forståelse af, hvordan jeg vælger priming mikroglia fra voksne humane hjernevæv, som yderligere kan anvendes til downstream eksperimenter.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Stamfader-afledt oligodendrocyt Culture System fra human føtal hjerne

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Fiberoptisk implantation for kronisk Optogenetic Stimulation af hjernevæv

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering af pericyt-afledte Celler af Voksen Menneskelige hjerne til Inducerede Neuroner

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Simpel Generation af højtydende kultur af inducerede neuroner fra menneskelige voksen hud fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolering af cerebrale kapillærer fra frisk menneskelige hjernevæv

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolation og RNA udvinding af neuroner, makrofager og mikroglia fra larve zebrafisk hjerner

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Kortsigtede fritflydende udsnit kulturer fra den voksne menneskelige hjerne

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Cochlear-overflade forberedelse i voksen musen

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...