Name: obtaining human microglia from adult human brain tissue
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00
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Le laboratoire de SJ a été créé grâce à des subventions institutionnelles de l’IITJ et est financé par des subventions du Département de la biotechnologie (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) et du Ministère de l’électronique et des technologies de l’information du Gouvernement de l’Inde (no 4(16)/2019-ITEA). Les sections de tissu cérébral humain ont été obtenues du All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur après l’autorisation du comité d’éthique institutionnel. Nous remercions Mayank Rathor, B.Tech Student membre de design and Arts Society IIT Jodhpur, pour son soutien en vidéographie.

Tous les tissus ont été acquis après l’autorisation éthique des comités d’éthique de l’Institut indien de technologie Jodhpur et de l’Institut indien des sciences médicales (AIIMS) Jodhpur.
1.Acquisition et traitement de tissus (Jour 0)
<ol><li>Recueillir le tissu dans un tube de 50 ml contenant 10 ml de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) (2 mM CaCl2•2H2O, 10 mM glucose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, ...

<ol>
	<li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+-+more+than+just+brain+glue.">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li><li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+Beyond:+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function.">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li><li>Gordon, S., Pl&#252;ddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+heterogeneity+in+tissues:+phenotypic+diversity+and+functions.">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease:+A+microglial+conundrum.">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li><li>Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+phagocytic+clearance+in+Parkinson's+disease.">Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).</li><li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functions+of+Microglia+in+Ischemic+Stroke.">Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).</li><li>Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Central+Nervous+System+Inflammation+and+Multiple+Sclerosis+Pathology.">Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology.</a> Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).</li><li>Loane, D. J., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+TBI+brain:+The+good,+the+bad,+and+the+dysregulated.">Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated.</a> Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).</li><li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neuropathic+pain:+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential.">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).</li><li>Bellver-Landete, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+are+an+essential+component+of+the+neuroprotective+scar+that+forms+after+spinal+cord+injury.">Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury.</a> Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).</li><li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/Brain+Macrophages+as+Central+Drivers+of+Brain+Tumor+Pathobiology.">Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li><li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+side+of+microglia.">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Brain+Myeloid+Expression+Profiles+Reveal+Distinct+Microglial+Activation+States+and+Aspects+of+Alzheimer's+Disease+Not+Evident+in+Mouse+Models.">Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+Alzheimer's+disease-associated+genes+in+primary+human+microglia.">PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).</li><li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile.">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55 (4), 412-424 (2007).</li><li>Mizee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+microglia+from+the+human+post-mortem+brain:+effects+of+ante-+and+post-mortem+variables.">Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+enriched+primary+human+microglia+for+functional+studies.">Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies.</a> Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).</li><li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics.">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li><li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples.">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inflammasome+Sensor,+NLRP3,+Regulates+CNS+Inflammation+and+Demyelination+via+Caspase-1+and+Interleukin-18.">The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).</li><li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes.">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li><li>Plant, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphotoxin+beta+receptor+(Lt+betaR):+dual+roles+in+demyelination+and+remyelination+and+successful+therapeutic+intervention+using+Lt+betaR-Ig+protein.">Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model.">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination.">TNF&#945; promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li><li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+macrophage+production.">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).</li><li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant.">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li><li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells.">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li></ol>

Microglie assurer l’homéostasie dans le cerveau normal et jouer un rôle central dans la pathophysiologie de diverses maladies neurologiques4. Les microglies sont au cœur du neurodéveloppement et de la formation des synapses2. Les études microgliale se sont avérées essentielles dans la compréhension du développement et de la progression de diverses maladies neurologiques4. Les microglies de rongeurs sont le modèle de choix prédominant pou...

Le système nerveux central (SNC) est construit à partir d’un réseau complexe de neurones et de cellules gliales1. Parmi les cellules gliales, les microglies fonctionnent comme les cellules immunitaires innées du SNC2,3. Les microglies sont responsables du maintien de l’homéostasie dans le SNC4en bonne santé . Les microglies jouent également un rôle important dans le neurodéveloppement, en élaguant les synapses2. Les microglies sont au cœur de la pathophysiologie de plusieurs maladies neurologiques, y compris, mais pas limitée à; Maladie d’Alzheimer5, maladie de Parkinson6, ACCIDENT VASCULAIRE CÉRÉBRAL7, Sclérose en plaques8, lésion cérébrale traumatique9, douleur neuropathique10, lésions de la moelle épinière11 et tumeurs cérébrales telles que les gliomes12.
Les études liées à l’homéostasie et aux maladies du SNC utilisent des microglies de rongeurs en raison d’une pénurie de protocoles d’isolement des microglies primaires humaines efficaces et rentables13. Les microglies de rongeurs ressemblent à des microglies humaines primaires dans l’expression de gènes tels que Iba-1, PU.1, DAP12 et M-CSF récepteur et ont été efficaces dans la compréhension normale ainsi que le cerveau malade13. Fait intéressant, l’expression de plusieurs gènes immunitaires connexes tels que TLR4, MHC II, Siglec-11 et Siglec-3 varie entre les microglies humaines et les rongeurs13. L’expression de plusieurs gènes varie également dans l’expression temporelle et dans les maladies neurodégénératives chez les deux espèces14,15. Ces différences significatives font de la microglie humaine un modèle essentiel pour étudier la fonction de microglie dans l’homéostasie et la maladie. La microglie humaine primaire peut également être un outil efficace pour le dépistage préclinique des candidats potentiels16. Les raisons mentionnées ci-dessus soulignent le besoin croissant de protocoles rentables pour l’isolement des microglies humaines primaires.
Nous avons développé un protocole pour l’isolement de la microglie humaine primaire du tissu humain adulte de cerveau recueilli à la suite de la fenêtre chirurgicale créée pour les résections de tumeur ou d’autres résections chirurgicales. La méthode ici est considérablement différente des méthodes existantes. Nous avons pu isoler et culturer des microglies après un temps de transit d’environ 75 minutes entre le site de collecte des tissus et le début du protocole d’isolement en laboratoire. Nous avons utilisé le supernatant des cellules fibroblastiques L929 pour favoriser la croissance de microglies isolées. Cette méthode se concentre spécifiquement sur la culture et le développement de microglies primaires seulement. La culture qui en résulte est d’environ 80% de microglies. Alors que d’autres protocoles fournissent une culture enrichie de microglies par centrifugation gradient de densité, cytométrie de flux et perles magnétiques, le protocole est un moyen rapide, simple, robuste et rentable à la culture primaire microglie humaine17,18,19,20. La capacité d’utiliser le tissu cérébral adulte vivant enlevé chirurgicalement au lieu des tissus fixes du cerveau des cadavres prouve un avantage supplémentaire de cette méthode contrairement aux procédures existantes18,21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>A002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (4 &#176;C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>146532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>New Brunswik</td>
			<td>Galaxy 170 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium with glutamine</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>AL007S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM9955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flacon tube (50 ml)</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>50CD1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1</td>
			<td>Vector</td>
			<td>FL-1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>GA5</td>
			<td>3670S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswik Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC&#160;CCL-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar air flow</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monosodium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Mixture F-12 Ham Medium</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Al106S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td>237554805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>ML023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Labware</td>
			<td>LW-SP1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.2&#956;, 25 mm diameter)</td>
			<td>Axiva</td>
			<td>SFPV25R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture.</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TCG4-20X10NO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining human microglia from adult human brain tissue

Les microglies résident les cellules immunitaires innées du système nerveux central (SNC). Les microglies jouent un rôle essentiel pendant le développement, dans le maintien de l’homéostasie, et pendant l’infection ou les blessures. Plusieurs groupes de recherche indépendants ont mis en évidence le rôle central que jouent les microglies dans les maladies auto-immunes, les syndromes autoinflammatoires et les cancers. L’activation de la microglie dans certaines maladies neurologiques peut participer directement aux processus pathogènes. Les microglies primaires sont un outil puissant pour comprendre les réponses immunitaires dans le cerveau, les interactions cellule-cellule et les phénotypes dysrégulés de microglie dans la maladie. Les microglies primaires imitent mieux les propriétés microgliales in vivo que les lignées cellulaires microgliales immortalisées. Les microglies adultes humains présentent des propriétés distinctes par rapport aux microglies foetales et rongeurs humaines. Ce protocole fournit une méthode efficace pour l’isolement des microglies primaires du cerveau humain adulte. L’étude de ces microglies peut fournir des informations critiques sur les interactions cellule-cellule entre les microglies et d’autres populations cellulaires résidentes dans le SNC, y compris les oligodendrocytes, les neurones et les astrocytes. En outre, les microglies de différents cerveaux humains peuvent être cultivées pour la caractérisation des réponses immunitaires uniques pour la médecine personnalisée et une myriade d’applications thérapeutiques.

En utilisant le protocole mentionné ci-dessus (Figure 1), nous avons été en mesure d’isoler les microglies humaines primaires des tissus cérébraux vivants réséqués chirurgicalement. Les cellules cultivées ont été tachées de ricinus communis agglutinine-1 (RCA-1) lectine pour microglie (vert) et avec des protéines acides fibrillaires gliales (GFAP) pour les astrocytes (rouge) (Figure 2) comme décrit préc?...

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Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Ce protocole est une méthode efficace, rentable et robuste d’isoler les microglies primaires des tissus cérébraux vivants, adultes et humains. Les microglies humains primaires isolés peuvent servir d’outil pour étudier les processus cellulaires dans l’homéostasie et la maladie.

Obtention de microglies humaines à partir de tissus cérébraux humains adultes

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

L’objectif global du protocole est d’isoler les cellules primaires des microglies des tissus cérébraux humains adultes vivants. Dans notre cas, ceci a été rassemblé comme fenêtre chirurgicale pendant la chirurgie. Ceci est accompli en recueillant d’abord les tissus cérébraux dans la glace froide PBS, le tissu est ensuite en dés en petits morceaux cube de 1 mm, et je viens de le faire avec l’aide de trypsine EDTA.Par la suite, les cellules sont récoltées par centrifugation et plaquées dans un flacon adapté à la culture des cellules androgènes pendant 48 heures. Les cellules sont récoltées une fois de plus dans le flacon et cultivés jusqu’à nouvel usage. Les cellules primaires des microglies humaines peuvent maintenant être caractérisées par l’immunocytochimie et utilisées pour d’autres expériences.Le principal avantage de notre protocole pour isoler les cellules de microglies des tissus cérébraux humains adultes est qu’il fournit effectivement les cellules primaires adultes de microglies humaines d’une manière très rentable. Le protocole est robuste et il réduit la perte de cellules en réduisant le nombre d’étapes utilisées dans les protocoles existants. Recueillir les tissus dans un tube Falcon de 50 mL contenant 10 mL d’aCSF glacé.Essuyez soigneusement le tube de collecte avec 70% d’alcool et transférez-le dans une chambre d’écoulement d’air laminaire aseptique. Jetez soigneusement l’aCSF et pesez les tissus dans le tube Falcon. Calculez le poids environ des tissus en déduisant le poids du tube Falcon vide.Chaud frais aCSF à 37 degrés centigrades. Gardez le tissu au chaud aCSF pendant cinq minutes. Cette étape est essentielle pour éviter la mort cellulaire.Jetez soigneusement l’aCSF. Et laver les tissus une fois avec 1X PBS réchauffé à 37 degrés centigrades. Assurez-vous que tout le sang est emporté par des lavages répétés de PBS au besoin.Incuber le tissu dans du PBS chaud pendant 5 minutes. Jetez soigneusement la moitié du PBS. Transférer le tissu avec le reste du PBS dans une boîte de Pétri stérilisée.Retirer soigneusement le reste du PBS avec une pipette de 1 mL. Cela permettra d’éviter la perte de tissu. Couper ce problème en petits morceaux cubes d’au moins 1 mm à l’aide d’un scalpel stérile.Ajouter 2 mL de 0,25% trypsine EDTA à la boîte de Petri et bien laver l’assiette à l’aide de pipette. Transférer le tissu en dés dans un tube Falcon de 50 mL contenant 10 mL par gramme de tissu de 0,25% trypsine EDTA. Mélanger au pipetage à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.Incuber le tube sur un shaker pendant 30 minutes à 37 degrés centigrades et la vitesse de 250 rpm. Ajouter 10 mL de milieu neutralisant pour neutraliser la trypsine. Bien mélanger avec une pipette sérologique de 10 mL.Centrifugeuse du tube à 2000G à 4 degrés centigrades pendant 10 minutes. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille dans 1 mL de milieu de culture. Déposer les cellules dans un flacon T25 adapté aux cellules androgènes et ajouter 4 mL de milieu de culture supplémentaire.Le milieu culturel contiendra 20%L929 supernatant et 1% streptomycine. Il est recommandé d’ajouter le supernatant L929 séparément dans les flacons au lieu d’ajouter au milieu de culture des stocks. Nous en avons fini avec le flacon pour éliminer homogènement le tissu.Évitez d’amener les médias au cou du flacon tout en secouant car cela peut augmenter les risques de contamination. Incuber le flacon à 37 degrés centigrades avec 5% de CO2 pendant 48 heures. Recueillir les médias à partir de flacon de culture T25 préparé le jour 0 dans des tubes de centrifugeuse.Centrifugeuse les médias recueillis à 1466G à 4 degrés centigrades pendant 4 minutes. Pendant que les supports collectés sont centrifugés, lavez le flacon jour 0 une fois avec 1X PBS. Secouez doucement le flacon pour enlever les fragments de tissu restants.Évitez les secousses dures de la fiole car tout fragment de reste n’affectera pas négativement la culture. Ajouter 5 mL de culture fraîche dans le flacon. Jeter le surnatant des tubes centrifugés.Ajouter 1 mL de culture moyenne à l’un des tubes et bien mélanger avec la pipette. Ajouter en série les supports mélangés avec des cellules à d’autres tubes et bien mélanger. Déposer les cellules dans un flacon T25 séparé adapté aux cellules androgènes.Ajouter 4 mL de médias de culture frais à la fiole. Incuber les deux flacons à 37 degrés centigrades avec 5% de CO2 pendant 48 heures. Jetez les médias des deux flacons et ajoutez des supports culturels frais de 5 mL.Incuber les flacons à 37 degrés centigrades à 5% de CO2 pendant 48 heures. Le sixième jour, les cellules seront prêtes pour d’autres expériences. Dans les images représentées ici.Premier panneau de la section A astrocytes tachés de GFAP, de couleur verte. Dans le deuxième panneau, de la section A microglia tache avec RCA, vert en couleur. Dans la section B microglies tachées de RCA, qui est de couleur verte, et les astrocytes sont tachés de GFAP, de couleur rouge.La superposition des images montre des microglies et des astrocytes ensemble. Il est clair d’après les images que la majorité des cellules de la culture préparées sont des microglies. Les images ont été quantifiées par un contrôle aveugle et le résultat est représenté dans la section C.Les résultats ont montré qu’environ 80% des cellules de la culture préparées sont des cellules microgliales.Cette technique peut être effectuée en environ une heure et demie. Après cette procédure devrait avoir une bonne compréhension de la façon dont je sélectionne l’amorçage microglies à partir de tissus cérébraux humains adultes, qui peuvent être utilisés pour des expériences en aval.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

Jeu-Based Computer combinant les expériences comportementales à haute densité Suivi Gaze EEG et infrarouge

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Recherche

Neurosciences

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