Name: obtaining human microglia from adult human brain tissue
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00
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Das Labor des SJ wurde mit institutionellen Zuschüssen des IITJ eingerichtet und wird durch Zuschüsse der Abteilung Biotechnologie (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) und des Ministeriums für Elektronik und Informationstechnologie der indischen Regierung (Nr. 4(16)/2019-ITEA) finanziert. Die menschlichen Hirngewebeabschnitte wurden vom All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur nach der Freigabe der institutionellen Ethikkommission bezogen. Wir danken Mayank Rathor, B.Tech Student Mitglied der Design and Arts Society IIT Jodhpur, für die Videofilmunterstützung.

Alle Gewebe wurden nach ethischer Freigabe von den Ethikkommissionen des Indian Institute of Technology Jodhpur und all India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur erworben.
1.Gewebeerwerb und -verarbeitung (Tag 0)
<ol><li>Sammeln Sie das Gewebe in einem 50 ml Rohr mit 10 ml eiskalte künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) (2 mM CaCl22 H2O, 10 mM Glukose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2-H2<...

<ol>
	<li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+-+more+than+just+brain+glue.">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li><li>Lenz, K. M., Nelson, L. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Brain+Myeloid+Expression+Profiles+Reveal+Distinct+Microglial+Activation+States+and+Aspects+of+Alzheimer's+Disease+Not+Evident+in+Mouse+Models.">Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+Alzheimer's+disease-associated+genes+in+primary+human+microglia.">PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).</li><li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination.">TNF&#945; promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li><li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+macrophage+production.">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).</li><li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant.">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li><li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells.">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li></ol>

Mikroglia sorgen für Homöostase im normalen Gehirn und spielen eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie verschiedener neurologischer Erkrankungen4. Mikroglia sind zentral für die Neuroentwicklung und Bildung von Synapsen2. Mikroglia-Studien haben sich als entscheidend für das Verständnis der Entwicklung und des Fortschreitens verschiedener neurologischer Erkrankungen erwiesen4. Nagetier-Mikroglia sind das vorherrschende Modell der Wahl für p...

Das Zentralnervensystem (ZNS) besteht aus einem komplexen Netzwerk von Neuronen und Gliazellen1. Unter den Gliazellen fungieren Mikroglia als angeborene Immunzellen der ZNS2,3. Microglia sind verantwortlich für die Aufrechterhaltung der Homöostase im gesunden ZNS4. Mikroglia spielen auch eine wichtige Rolle in der Neuroentwicklung, durch den Schnitt von Synapsen2. Mikroglia sind zentral für die Pathophysiologie mehrerer neurologischer Erkrankungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf; Alzheimer-Krankheit5, Parkinson-Krankheit6, Schlaganfall7, Multiple Sklerose8, traumatische Hirnverletzung9, neuropathische Schmerzen10, Rückenmarksverletzung11 und Hirntumoren wie Gliome12.
Studien im Zusammenhang mit ZNS-Homöostase und Krankheiten nutzen Nagetier-Mikroglia aufgrund eines Mangels an kosteneffizienten und zeiteffizienten menschlichen primären Mikroglia-Isolationsprotokollen13. Nagetier-Mikroglia ähneln primären menschlichen Mikroglia in Der Expression von Genen wie Iba-1, PU.1, DAP12 und M-CSF-Rezeptor und haben wirksam beim Verständnis normaler sowie kranker Gehirn13. Interessanterweise variiert die Expression mehrerer immunbezogener Gene wie TLR4, MHC II, Siglec-11 und Siglec-3 zwischen menschlicher und Nagetier-Mikroglia13. Die Expression mehrerer Gene variiert auch in der zeitlichen Expression und bei neurodegenerativen Erkrankungen bei beiden Arten14,15. Diese signifikanten Unterschiede machen menschliche Mikroglia zu einem wesentlichen Modell, um die Mikrogliafunktion bei Homöostase und Krankheit zu untersuchen. Primäre menschliche Mikroglia kann auch ein wirksames Werkzeug für das präklinische Screening von potenziellen Wirkstoffkandidaten16sein. Die oben genannten Gründe unterstreichen den wachsenden Bedarf an kostengünstigen Protokollen zur Isolierung primärer menschlicher Mikroglia.
Wir haben ein Protokoll zur Isolierung von primären menschlichen Mikroglia aus erwachsenen menschlichen Hirngewebe als Ergebnis der chirurgischen Fenster für Tumorresektionen oder andere chirurgische Resektionen erstellt entwickelt. Die Methode unterscheidet sich hier erheblich von den bestehenden Methoden. Wir waren in der Lage, Mikroglia nach einer Transitzeit von etwa 75 Minuten von der Gewebesammelstelle bis zum Start des Isolationsprotokolls im Labor zu isolieren und zu kultiieren. Wir haben den Überstand von L929-Fibroblastenzellen verwendet, um das Wachstum isolierter Mikroglia zu fördern. Diese Methode konzentriert sich speziell auf die Kultur und Entwicklung von nur primären Mikroglia. Die resultierende Kultur vorbereitet ist etwa 80% Mikroglia. Während andere Protokolle eine angereicherte Kultur der Mikroglia durch Dichtegradientzentrifugation, Durchflusszytometrie und magnetische Perlen bieten, ist das Protokoll eine schnelle, einfache, robuste und kostengünstige Möglichkeit, primäre menschliche Mikroglia17,18,19,20zu kulturieren. Die Fähigkeit, chirurgisch entferntes lebendes erwachsenes Hirngewebe anstelle von festem Hirngewebe von Kadavern zu nutzen, erweist sich als zusätzlicher Vorteil dieser Methode im Gegensatz zu bestehenden Verfahren18,21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>A002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (4 &#176;C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>146532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>New Brunswik</td>
			<td>Galaxy 170 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium with glutamine</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>AL007S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM9955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flacon tube (50 ml)</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>50CD1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1</td>
			<td>Vector</td>
			<td>FL-1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>GA5</td>
			<td>3670S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswik Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC&#160;CCL-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar air flow</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monosodium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Mixture F-12 Ham Medium</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Al106S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td>237554805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>ML023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Labware</td>
			<td>LW-SP1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.2&#956;, 25 mm diameter)</td>
			<td>Axiva</td>
			<td>SFPV25R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture.</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TCG4-20X10NO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining human microglia from adult human brain tissue

Mikroglia sind ansässige angeborene Immunzellen des Zentralnervensystems (ZNS). Mikroglia spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung, bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und bei Infektionen oder Verletzungen. Mehrere unabhängige Forschungsgruppen haben die zentrale Rolle hervorgehoben, die Mikroglia bei Autoimmunerkrankungen, autoinflammatorischen Syndromen und Krebserkrankungen spielt. Die Aktivierung von Mikroglia bei einigen neurologischen Erkrankungen kann direkt an pathogenen Prozessen beteiligt sein. Primäre Mikroglia sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Immunantworten im Gehirn, Zell-Zell-Wechselwirkungen und dysregulierte Mikroglia-Phänotypen bei Krankheiten zu verstehen. Primäre Mikroglia imitieren in vivo mikroglia-Eigenschaften besser als verewigte mikrogliarische Zelllinien. Menschliche Erwachsene Mikroglia weisen unterschiedliche Eigenschaften im Vergleich zu menschlichen fetalen und Nagetier Mikroglia. Dieses Protokoll bietet eine effiziente Methode zur Isolierung von primären Mikroglia aus erwachsenen menschlichen Gehirn. Das Studium dieser Mikroglia kann kritische Einblicke in Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen Mikroglia und anderen ansässigen Zellpopulationen im ZNS liefern, einschließlich Oligodendrozyten, Neuronen und Astrozyten. Darüber hinaus können Mikroglia aus verschiedenen menschlichen Gehirnen für die Charakterisierung einzigartiger Immunantworten für personalisierte Medizin und eine Vielzahl von therapeutischen Anwendungen kultiviert werden.

Durch die Verwendung des oben genannten Protokolls (Abbildung 1) konnten wir primäre menschliche Mikroglia aus lebendem chirurgisch resektiertem Hirngewebe isolieren. Kultivierte Zellen wurden mit Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) Lektin für Mikroglia (grün) und mit Glial fibrilläres saures Protein (GFAP) für Astrozyten (rot)(Abbildung 2) gefärbt, wie zuvor beschrieben22,<sup ...

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Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Dieses Protokoll ist eine effiziente, kostengünstige und robuste Methode zur Isolierung primärer Mikroglia aus lebendem, erwachsenem, menschlichem Hirngewebe. Isolierte primäre menschliche Mikroglia kann als Werkzeug für die Untersuchung zellulärer Prozesse bei Homöostase und Krankheit dienen.

Gewinnung menschlicher Mikroglia aus erwachsenem menschlichem Hirngewebe

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist es, primäre Mikrogliazellen aus lebenden erwachsenen menschlichen Hirngeweben zu isolieren. In unserem Fall wurde dies als chirurgisches Fenster während der Operation gesammelt. Dies wird durch das zuerst sammeln des Gehirngewebes in eiskalten PBS erreicht, das Gewebe wird dann in 1-mm-Würfel kleine Stücke gewürfelt, und ich habe gerade mit Hilfe von Trypsin EDTA.Danach werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und 48 Stunden lang in einem Kolben plattiert, der für die Androgenzellkultur geeignet ist. Die Zellen werden wieder aus dem Kolben geerntet und bis zur weiteren Verwendung kultiviert. Primäre menschliche Mikrogliazellen können nun durch Immunzytochemie charakterisiert und für weitere Experimente verwendet werden.Der Hauptvorteil unseres Protokolls zur Isolierung von Mikrogliazellen aus adulten menschlichen Hirngeweben besteht darin, dass es die primären adulten menschlichen Mikrogliazellen effektiv auf sehr kostengünstige Weise bereitstellt. Das Protokoll ist robust und reduziert den Zellverlust, indem es die Anzahl der Schritte reduziert, die in vorhandenen Protokollen verwendet werden. Sammeln Sie das Gewebe in einem 50-ml Falcon-Rohr mit 10 ml eiskaltem aCSF.Wischen Sie das Sammelrohr sorgfältig mit 70% Alkohol ab und übertragen Sie es in eine aseptische laminare Luftstromkammer. Entsorgen Sie das aCSF sorgfältig und wiegen Sie Gewebe in der Falcon-Röhre. Berechnen Sie das ungefähre Gewicht des Gewebes, indem Sie das Gewicht des leeren Falcon-Rohrs ableiten.Warm frisch aCSF bis 37 Grad Celsius. Halten Sie das Gewebe fünf Minuten lang in warmem ACSF auf. Dieser Schritt ist entscheidend, um den Zelltod zu vermeiden.Entsorgen Sie aCSF sorgfältig. Und waschen Gewebe einmal mit 1X PBS erwärmt auf 37 Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Blut bei Bedarf mit wiederholten PBS-Waschungen weggespült wird.Inkubieren Sie das Gewebe in warmen PBS für 5 Minuten. Entsorgen Sie die Hälfte der PBS sorgfältig. Übertragen Sie Gewebe zusammen mit den verbleibenden PBS in eine sterilisierte Petrischale.Entfernen Sie die verbleibendePBS sorgfältig mit 1-ml Pipette. Dies verhindert den Verlust von Gewebe. Würfel, die mit einem sterilen Skalpell in mindestens 1-mm-Würfel kleine Stücke würfeln.Fügen Sie 2 ml 0,25%Trypsin EDTA in die Petrischale und waschen Sie den Teller gründlich mit Hilfe von Pipette. Übertragen Sie das gewürfelte Gewebe in ein 50-ml Falcon-Rohr mit 10 ml pro Gramm Gewebe von 0,25%Trypsin EDTA. Mischen Sie durch Pipettieren durch eine 10-ml-Serologische Pipette.Inkubieren Sie die Röhre auf einem Shaker für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und der Geschwindigkeit von 250 U/min. Fügen Sie 10 ml neutralisierendes Medium hinzu, um Trypsin zu neutralisieren. Mit einer 10-ml-Serologischen Pipette gründlich mischen.Zentrifugieren Sie das Rohr bei 2000G bei 4 Grad Celsius für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml Kulturmedium wieder auf. Legen Sie die Zellen in einem T25-Kolben, der für Androgenzellen geeignet ist, und fügen Sie 4 ml zusätzliches Kulturmedium hinzu.Kulturmedium wird 20%L929 Überstand und 1%Streptomycin enthalten. Es wird empfohlen, L929 Überstand separat in Kolben hinzuzufügen, anstatt das Stoffkulturmedium hinzuzufügen. Wir sind mit dem Kolben fertig, um das Gewebe homogen zu entsorgen.Vermeiden Sie es, die Medien beim Schütteln an den Hals des Kolbens zu bringen, da dies die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination erhöhen kann. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 für 48 Stunden. Sammeln Sie die Medien aus T25 Kulturkolben am Tag 0 in Zentrifugenröhren vorbereitet.Zentrifuge die gesammelten Medien bei 1, 466G bei 4 Grad Celsius für 4 Minuten. Während die gesammelten Medien zentrifugiert werden, waschen Sie den Tag 0 Kolben einmal mit 1X PBS. Schütteln Sie den Kolben vorsichtig, um alle restlichen Gewebefragmente zu entfernen.Vermeiden Sie ein hartes Schütteln des Kolbens, da Restfragmente die Kultur nicht beeinträchtigen. Fügen Sie 5 ml frische Kulturmedien in den Kolben. Entsorgen Sie den Überstand aus zentrifugierten Rohren.1 ml Kulturmedium in eines der Rohre geben und gründlich mit Pipette mischen. Serial fügen Sie das Mischmedium mit Zellen zu anderen Röhren und mischen gründlich. Legen Sie die Zellen in einem separaten T25-Kolben, der für Androgenzellen geeignet ist.Fügen Sie 4 ml frische Kulturmedien in den Kolben. Inkubieren Sie beide Kolben bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 für 48 Stunden. Entsorgen Sie die Medien aus beiden Kolben, und fügen Sie neue 5 ml Kulturmedien hinzu.Inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius bei 5% CO2 für 48 Stunden. Am sechsten Tag werden die Zellen für weitere Experimente bereit sein. In den hier dargestellten Bildern.Erste Platte des Abschnitts A Astrozyten mit GFAP gebeizt, grün in der Farbe. Im zweiten Panel, Abschnitt A Mikroglia Fleck mit RCA, grün in der Farbe. Im Abschnitt B Mikroglia mit RCA gefärbt, die grün in der Farbe ist, und Astrozyten sind mit GFAP, rot in der Farbe gefärbt.Die Überlagerung der Bilder zeigt Mikroglia und Astrozyten zusammen. Aus den Bildern geht klar hervor, dass die Mehrheit der Zellen in der vorbereiteten Kultur Mikroglia sind. Die Bilder wurden durch geblendete Kontrolle quantifiziert und das Ergebnis wird in Abschnitt C dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass etwa 80% der Zellen in der vorbereiteten Kultur Mikrogliazellen sind.Diese Technik kann in etwa eineinhalb Stunden durchgeführt werden. Nach diesem Verfahren sollte ein gutes Verständnis dafür haben, wie ich Grundierung Mikroglia aus erwachsenen menschlichen Gehirngeweben, die weiter für nachgelagerte Experimente verwendet werden kann wählen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Forschung

Neurowissenschaften

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