Name: obtaining human microglia from adult human brain tissue
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue at JoVE.com

המעבדה של SJ הוקמה עם מענקים מוסדיים מ-IITJ ומומנה על ידי מענקים מהמחלקה לביוטכנולוגיה (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) ומשרד האלקטרוניקה וטכנולוגיה של הודו (מס' 4(16)/2019-ITEA). סעיפים רקמת המוח האנושי הושגו מכל הודו המכון למדעי הרפואה (AIIMS) ג'ודפור לאחר אישור ועדת האתיקה המוסדית. אנו מודים למאיאנק ראתור, סטודנט B.Tech של האגודה לעיצוב ואמנויות IIT ג'ודפור, על תמיכת הווידאוגרפיה.

כל הרקמות נרכשו לאחר אישור אתי מוועדת האתיקה של המכון ההודי לטכנולוגיה ג'ודפור וכל המכון ההודי למדעי הרפואה (AIIMS) ג'ודפור.
1.רכישת רקמות ועיבוד (יום 0)
<ol><li>לאסוף את הרקמה בצינור 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של נוזל מוחי מוחי שדרתי קר כקרח (aCSF) (2 מ'מ CaCl2∙2H2O, 10 מ', 3 מ"מ KCl, 26 מ', NaHCO3,<...

<ol>
	<li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+-+more+than+just+brain+glue.">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li><li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+Beyond:+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function.">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li><li>Gordon, S., Pl&#252;ddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+heterogeneity+in+tissues:+phenotypic+diversity+and+functions.">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease:+A+microglial+conundrum.">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li><li>Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+phagocytic+clearance+in+Parkinson's+disease.">Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).</li><li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functions+of+Microglia+in+Ischemic+Stroke.">Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).</li><li>Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Central+Nervous+System+Inflammation+and+Multiple+Sclerosis+Pathology.">Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology.</a> Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).</li><li>Loane, D. J., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+TBI+brain:+The+good,+the+bad,+and+the+dysregulated.">Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated.</a> Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).</li><li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neuropathic+pain:+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential.">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).</li><li>Bellver-Landete, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+are+an+essential+component+of+the+neuroprotective+scar+that+forms+after+spinal+cord+injury.">Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury.</a> Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).</li><li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/Brain+Macrophages+as+Central+Drivers+of+Brain+Tumor+Pathobiology.">Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li><li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+side+of+microglia.">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Brain+Myeloid+Expression+Profiles+Reveal+Distinct+Microglial+Activation+States+and+Aspects+of+Alzheimer's+Disease+Not+Evident+in+Mouse+Models.">Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+Alzheimer's+disease-associated+genes+in+primary+human+microglia.">PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).</li><li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile.">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55 (4), 412-424 (2007).</li><li>Mizee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+microglia+from+the+human+post-mortem+brain:+effects+of+ante-+and+post-mortem+variables.">Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+enriched+primary+human+microglia+for+functional+studies.">Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies.</a> Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).</li><li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics.">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li><li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples.">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inflammasome+Sensor,+NLRP3,+Regulates+CNS+Inflammation+and+Demyelination+via+Caspase-1+and+Interleukin-18.">The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).</li><li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes.">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li><li>Plant, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphotoxin+beta+receptor+(Lt+betaR):+dual+roles+in+demyelination+and+remyelination+and+successful+therapeutic+intervention+using+Lt+betaR-Ig+protein.">Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model.">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination.">TNF&#945; promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li><li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+macrophage+production.">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).</li><li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant.">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li><li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells.">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li></ol>

Microglia להבטיח הומוסטאזיס במוח הרגיל ולשחק תפקידים מרכזיים בפתופיזיולוגיה של מחלות נוירולוגיות שונות4. Microglia הם מרכזיים נוירו-פיתוח היווצרות של סינופסות2. מחקרים Microglial הוכיחו מרכזי בהבנת הפיתוח וההתקדמות של מחלות נוירולוגיות מגוונות4. מיקרוליה מכרסמ?...

מערכת העצבים המרכזית (CNS) בנויה של רשת מורכבת של נוירונים ותאי גליה1. בין תאי גליה, microglia לתפקד כמו התאים החיסוניים המולדים של CNS2,,3. Microglia אחראים לשמירה על הונואוסטזיס ב CNSבריא 4. Microglia גם לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות עצבית, על ידי גיזום סינאפסות2. Microglia הם מרכזיים הפתופיזיולוגיה של מספר מחלות נוירולוגיות כולל אך לא מוגבל; מחלתאלצהיימר 5, מחלת פרקינסון6,שבץ 7, טרשת נפוצה8, פגיעה מוחיתטראומטית 9, כאבנוירופתי 10,פגיעה בחוט השדרה 11 ותגידולים במוח כגון גליומס12.
מחקרים הקשורים הומוסטאזיס CNS ומחלות לנצל microglia מכרסמים בשל דקט של עלות יעילה ויעילה בזמן אנושי ראשי microglia פרוטוקוליםבידוד 13. מיקרוליה מכרסמים דומים microglia האנושי העיקרי בביטוי של גנים כגון Iba-1, PU.1, DAP12 ו M-CSF קולטן היו יעילים בהבנת נורמלי, כמוגם מוח מחלה 13. מעניין, הביטוי של מספר גנים הקשורים למערכת החיסון כגון TLR4, MHC II, Siglec-11 ו Siglec-3 משתנה בין מיקרוליהאדם מכרסמים 13. הביטוי של מספר גנים משתנה גם בביטוי זמני ובמחלות ניווניות בשני המינים14,15. הבדלים משמעותיים אלה הופכים את המיקרוליה האנושית למודל חיוני לחקר תפקוד מיקרוליה בהומטזיס ובמחלות. microglia האנושי העיקרי יכול להיות גם כלי יעיל עבור הקרנה פרה-סרטנית של מועמדים פוטנציאליים לסמים16. הסיבות שהוזכרו לעיל מדגישות את הצורך הגובר בפרוטוקולים חסכוניים לבידוד של מיקרוליה אנושית ראשית.
פיתחנו פרוטוקול לבידוד של microglia אנושי ראשוני מרקמות מוח אנושיות בוגר שנאספו כתוצאה של חלון כירורגי שנוצר עבור ניתוחים או ניתוחים אחרים. השיטה כאן שונה במידה ניכרת מהשיטות הקיימות. הצלחנו לבודד ולתרבות מיקרוליה לאחר זמן מעבר של כ-75 דקות מאתר איסוף הרקמות כדי להתחיל את פרוטוקול הבידוד במעבדה. השתמשנו supernatant של L929 פיברובלסט תאים כדי לקדם את הצמיחה של microglia מבודד. שיטה זו מתמקדת במיוחד בתרבות ופיתוח של מיקרוליה ראשונית בלבד. התרבות שנוצרה מוכנה היא כ 80% microglia. בעוד פרוטוקולים אחרים מספקים תרבות מועשרת של microglia על ידי צנטריפוגציה הדרגתית צפיפות, ציתום זרימה חרוזים מגנטיים, הפרוטוקול הוא מהיר, פשוט, חזק וחסכוני דרך לתרבות microgliaאדם העיקרי 17,18,19,20. היכולת לנצל בניתוח הוסר רקמת מוח מבוגר חי במקום רקמות מוח קבועות של גופות מוכיח יתרון נוסף של שיטה זו בניגוד הליכיםקיימים 18,21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>A002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (4 &#176;C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>146532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>New Brunswik</td>
			<td>Galaxy 170 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium with glutamine</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>AL007S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM9955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flacon tube (50 ml)</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>50CD1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1</td>
			<td>Vector</td>
			<td>FL-1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>GA5</td>
			<td>3670S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswik Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC&#160;CCL-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar air flow</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monosodium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Mixture F-12 Ham Medium</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Al106S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td>237554805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>ML023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Labware</td>
			<td>LW-SP1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.2&#956;, 25 mm diameter)</td>
			<td>Axiva</td>
			<td>SFPV25R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture.</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TCG4-20X10NO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining human microglia from adult human brain tissue

Microglia הם תאים חיסוניים מולדים תושב של מערכת העצבים המרכזית (CNS). Microglia לשחק תפקיד קריטי במהלך הפיתוח, בשמירה על הומוסטאזיס, ובמהלך זיהום או פציעה. מספר קבוצות מחקר עצמאיות הדגישו את התפקיד המרכזי כי microglia לשחק במחלות אוטואימוניות, תסמונות דלקת אוטואיציה וסרטן. ההפעלה של microglia במחלות נוירולוגיות מסוימות עשויה להשתתף ישירות בתהליכים פתוגנים. microglia העיקרי הם כלי רב עוצמה כדי להבין את התגובות החיסוניות במוח, אינטראקציות תא ופנוטיפים microglia dysregulated במחלה. microglia העיקרי לחקות תכונות microglial vivo טוב יותר מאשר קווי תא microglial מונצחים. מיקרוליה למבוגרים אנושיים להפגין תכונות נפרדות לעומת מיקרוליה העובר והכורסמים האנושיים. פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה לבידוד של microglia ראשוני ממוח אנושי בוגר. לימוד microglia אלה יכול לספק תובנות קריטיות על אינטראקציות תא בין microglia ואוכלוסיות תאים תושבים אחרים ב-CNS כולל, oligodendrocytes, נוירונים ואסטרוציטים. בנוסף, microglia ממוחות אנושיים שונים עשוי להיות מתורבת לאפיון של תגובות חיסוניות ייחודיות לרפואה מותאמת אישית ואינספור יישומים טיפוליים.

באמצעות הפרוטוקול הנ"ל(איור 1),הצלחנו לבודד מיקרוליה אנושית ראשית מרקמות מוח ותוכותות בניתוח. תאים תרבותיים היו מוכתמים עם Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) לקטין עבור microglia (ירוק) ועם חלבון חומצי פרפור גליאלי (GFAP) עבור אסטרוקיטים(אדום)( איור 2 ) כפי ?...

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue at JoVE.com

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה, חסכונית וחזקה של בידוד microglia ראשוני מלחיות, מבוגר, רקמת מוח אנושית. microglia אנושי ראשוני מבודד יכול לשמש ככלי לחקר תהליכים תאיים בהונואוסטזיס ומחלות.

קבלת מיקרוליה אנושית רקמת מוח אנושית בוגרת

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

המטרה הכוללת של הפרוטוקול היא לבודד תאי microglia ראשוניים מרקמות מוח אנושיות בוגרות חיות. במקרה שלנו, זה נאסף כחלון כירורגי במהלך הניתוח. זה מושגת על ידי בתחילה איסוף רקמות המוח בקרח קר PBS, הרקמה לאחר מכן חתוך לקוביה 1 מ"מ חתיכות קטנות, ואני פשוט עשיתי בעזרת טריפסין EDTA.לאחר מכן, התאים נקצרים על ידי צנטריפוגה מצופה בקבוקון מתאים לתרבות תאי אנדרוגן במשך 48 שעות. תאים נקצרים שוב מן הבקבוק ותרבתו עד לשימוש נוסף. תאי מיקרוגליה אנושיים ראשוניים יכולים כעת להיות מאופיינים באמצעות אימונוציטוכימיה ולהשתמש בהם לניסוי נוסף.היתרון העיקרי של הפרוטוקול שלנו לבודד תאי microglia מרקמות המוח האנושיות הבוגרות הוא שהוא מספק ביעילות תאי microglia אנושיים בוגרים ראשוניים בצורה חסכונית מאוד. הפרוטוקול חזק ומפחית את אובדן התאים על-ידי הפחתת מספר השלבים המשמשים בפרוטוקולים קיימים. לאסוף את הרקמה בצינור פלקון 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של קרח קר aCSF.נגבו את צינור האיסוף בזהירות עם 70% אלכוהול והעברו לתא זרימת אוויר למינארי אספטי. השלך את aCSF בזהירות ולשקול רקמה בצינור פלקון. לחשב את המשקל המשוער של רקמה על ידי הסיק את המשקל של צינור פלקון ריק.ACSF טרי וחם עד 37 מעלות צל"ש. שמור את הרקמה ב- aCSF חם במשך חמש דקות. צעד זה הוא קריטי כדי למנוע מוות תאי.השלך ACSF בזהירות. ולשטוף רקמה פעם אחת עם PBS 1X מחומם ל 37 מעלות צל"ש. ודא שכל הדם נשטף עם שטיפות PBS חוזרות ונשנות לפי הצורך.הדגירה את הרקמה PBS חם במשך 5 דקות. השלך חצי מה-PBS בזהירות. מעבירים רקמה יחד עם PBS שנותר לצלחת פטרי מעקרת.הסר את ה- PBS הנותר בזהירות עם פיפטה של 1 מ"ל. זה ימנע אובדן של רקמה. קוביות המנפיקות לקוביה לפחות 1 מ"מ חתיכות קטנות באמצעות אזמל סטרילי.הוסיפו 2 מ"ל של 0.25% טריפסין EDTA לצלחת פטרי ושטפו את הצלחת ביסודיות בעזרת פיפטה. העבר את הרקמה חצויה לצינור פלקון 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל לגרם רקמה של 0.25% טריפסין EDTA. מערבבים על ידי צינור דרך פיפטה סרולוגית 10 מ"ל.הדגירה את הצינור על שייקר במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלסיגרד ואת המהירות של 250 סל"ד. מוסיפים 10 מ"ל של נטרול בינוני כדי לנטרל טריפסין. מערבבים היטב עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל.צנטריפוגה הצינור ב 2000G ב 4 מעלות צלחים במשך 10 דקות. להשליך את supernatant ולתלות מחדש את גלולה ב 1 מ"ל של מדיום תרבות. מניחים את התאים בבקבוק T25 המתאים לתאי אנדרוגן ומוסיפים 4 מ"ל של מדיום תרבותי נוסף.מדיום תרבות יכיל 20%L929 על-טבעי ו-1%סטרפטומיצין. מומלץ להוסיף L929 על טבעי בנפרד בבקבוקונים במקום להוסיף למדיום תרבות המניות. סיימנו עם הבקבוק כדי להיפטר הומוגנית את הרקמה.הימנע להביא את התקשורת לצוואר של הבקבוק תוך רועד כמו זה עשוי להגדיל את הסיכויים לזיהום. הדגירה את הבקבוק ב 37 מעלות צלסיאדה עם 5% CO2 במשך 48 שעות. לאסוף את התקשורת מבקבוק תרבות T25 מוכן ביום 0 בצינורות צנטריפוגה.צנטריפוגה התקשורת שנאספה ב 1, 466G ב 4 מעלות צל"ש במשך 4 דקות. בעוד התקשורת שנאספה הוא להיות צנטריפוגה, לשטוף את היום 0 בקבוק פעם אחת עם 1X PBS. לנער את הבקבוק בעדינות כדי להסיר את כל שברי רקמת שאריות שנותרו.הימנע טלטולים קשים של הבקבוק כמו כל שברי קרן לא ישפיע לרעה על התרבות. הוסף 5 מ"ל של מדיה תרבותית טרייה לבקבוקון. השלך את העל-טבעי מצינורות צנטריפוגליים.מוסיפים 1 מ"ל של תרבות בינוני לאחד הצינורות ומערבבים ביסודיות עם פיפטה. מוסיפים באופן סדרתי את המדיה המעורבת עם תאים לצינורות אחרים ומערבבים היטב. הניחו את התאים בבקבוק T25 נפרד המתאים לתאי אנדרוגן.הוסף 4 מ"ל של מדיה תרבותית טרייה לבקבוקון. הדגירה שני flasks ב 37 מעלות צל"ש עם 5% CO2 במשך 48 שעות. השלך את המדיה משני הבקבוקים והוסף מדיה טרייה של תרבות 5 מ"ל.דגירה flasks ב 37 מעלות צל"ש ב 5%CO2 במשך 48 שעות. ביום השישי, התאים יהיו מוכנים לניסויים נוספים. בתמונות המיוצגות כאן.החלונית הראשונה של הקטע אסטרוציטים מוכתמים ב- GFAP, בצבע ירוק. בלוח השני, של קטע כתם microglia עם RCA, ירוק בצבע. בחלק B microglia מוכתם RCA, שהוא ירוק בצבע, ואסטרוציטים מוכתמים GFAP, אדום בצבע.שכבת-על של התמונות מציגה מיקרוגליה ואסטרוציטים יחד. ברור מן התמונות כי רוב התאים בתרבות מוכנים הם microglia. התמונות כומתו על ידי שליטה עיוורת והתוצאה מיוצגת בסעיף C.התוצאות הראו כי כ -80% מהתאים בתרבות שהוכנו הם תאי מיקרוגליה.טכניקה זו יכולה להתבצע בערך שעה וחצי. בעקבות הליך זה צריכה להיות הבנה טובה של איך אני בוחר microglia priming מרקמות המוח האנושיות הבוגרות, אשר ניתן להשתמש בהם עוד יותר עבור ניסויים במורד הזרם.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

משחק מחשב המבוסס על שילוב של ניסויים ההתנהגות עם מעקב צפיפות גבוהה מבט EEG ו אינפרא אדום

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

מערכת מוליד-נגזר Oligodendrocyte תרבות ממוח העוברי של אדם

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

השרשה של סיבים אופטיות לגירוי Optogenetic כרוני של רקמת המוח

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

שושלת תכנות מחדש של תאי שמקורם בpericyte של המוח האנושי למבוגרים לנוירונים מושרה

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

דור פשוטה של תרבות תשואה גבוהה של נוירונים המושרה מ Fibroblasts עור מבוגר

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

בידוד של נימים מוחי מרקמות המוח האנושי טריים

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

לטווח קצר-מתרבות פרוסה שצפה בחינם מהמוח האנושי המבוגר

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...