Name: obtaining human microglia from adult human brain tissue
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00
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SJの研究所は、IITJの機関補助金を受けて設立され、バイオテクノロジー省(BT/PR12831/MED/30/10/1089/2015)とインド電子情報技術省(No.4(16)/2019-ITEA)からの助成金を受けています。ヒトの脳組織切片は、全インド医科学研究所(AIIMS)ジョードプルから制度倫理委員会のクリアランスの後に得られた。デザイン・アンド・アーツ・ソサエティIIT JodhpurのB.Tech学生メンバーであるMayank Rathorに、ビデオ撮影のサポートに感謝します。

すべての組織は、インド工科大学ジョードプルと全インド医科学研究所(AIIMS)ジョードプルの研究所倫理委員会からの倫理的クリアランスの後に取得されました。
1.組織の獲得と処理(0日目)
<ol><li>10 mLの氷冷人工脳脊髄液(aCSF)を含む50 mLチューブに組織を収集する(2 mM CaCl2∙2H2O、10 mMグルコース、3 mM KCl、26 mM NaHCO 3、2.5 mM NaH2PO4、1mM MgCl2...

<ol>
	<li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+-+more+than+just+brain+glue.">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li><li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+Beyond:+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function.">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li><li>Gordon, S., Pl&#252;ddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+heterogeneity+in+tissues:+phenotypic+diversity+and+functions.">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease:+A+microglial+conundrum.">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li><li>Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+phagocytic+clearance+in+Parkinson's+disease.">Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).</li><li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functions+of+Microglia+in+Ischemic+Stroke.">Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).</li><li>Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Central+Nervous+System+Inflammation+and+Multiple+Sclerosis+Pathology.">Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology.</a> Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).</li><li>Loane, D. 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H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/Brain+Macrophages+as+Central+Drivers+of+Brain+Tumor+Pathobiology.">Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li><li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+side+of+microglia.">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Brain+Myeloid+Expression+Profiles+Reveal+Distinct+Microglial+Activation+States+and+Aspects+of+Alzheimer's+Disease+Not+Evident+in+Mouse+Models.">Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+Alzheimer's+disease-associated+genes+in+primary+human+microglia.">PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).</li><li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile.">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55 (4), 412-424 (2007).</li><li>Mizee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+microglia+from+the+human+post-mortem+brain:+effects+of+ante-+and+post-mortem+variables.">Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+enriched+primary+human+microglia+for+functional+studies.">Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies.</a> Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).</li><li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics.">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li><li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples.">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inflammasome+Sensor,+NLRP3,+Regulates+CNS+Inflammation+and+Demyelination+via+Caspase-1+and+Interleukin-18.">The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).</li><li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes.">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li><li>Plant, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphotoxin+beta+receptor+(Lt+betaR):+dual+roles+in+demyelination+and+remyelination+and+successful+therapeutic+intervention+using+Lt+betaR-Ig+protein.">Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model.">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination.">TNF&#945; promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li><li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+macrophage+production.">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).</li><li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant.">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li><li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells.">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li></ol>

ミクログリアは、正常な脳における恒常性を確保し、様々な神経疾患の病態生理学において中心的な役割を果たす4.ミクログリアは、シナプス2の神経発達と形成の中心である。ミクログリア研究は、多様な神経疾患の発症と進行を理解する上で極めて重要であることが証明されている 4.げっ歯類ミクログリアは、一次ミクログリア研究の?...

中枢神経系(CNS)は、ニューロンとグリア細胞の複雑なネットワーク1で構成されている。グリア細胞の中でも、ミクログリアはCNS2,3,3の自然免疫細胞として機能する。ミクログリアは健康なCNS4で恒常性を維持する責任があります。ミクログリアはまた、シナプス2を剪定することによって、神経発達において重要な役割を果たす。ミクログリアは、含むが、制限されていないいくつかの神経疾患の病態生理学の中心です。アルツハイマー病5、パーキンソン病6、脳卒中7、多発性硬化症8、外傷性脳損傷9、神経因性疼痛10、脊髄損傷11および神経膠腫などの脳腫瘍12。
CNS恒常性および疾患に関する研究は、コスト効率が良く、時間効率の高いヒト原発性ミクログリア分離プロトコル13の枯渇に起因するげっ歯類ミクログリアを利用する。げっ歯類ミクログリアは、イバ-1、PU.1、DAP12およびM-CSF受容体などの遺伝子の発現において原発性ヒトミクログリアに類似しており、疾患を有する脳13と同様に正常な理解に有効であった。興味深いことに、TLR4、MHC II、Siglec-11およびSiglec-3などのいくつかの免疫関連遺伝子の発現は、ヒトおよびげっ歯類ミクログリア13との間で変化する。いくつかの遺伝子の発現は、両方の種14,15,15の経時的発現および神経変性疾患においても変化する。これらの有意な違いは、ヒトミクログリアを恒常性および疾患におけるミクログリア機能を研究するために不可欠なモデルにする。原発性ヒトミクログリアはまた、潜在的な薬物候補16の前臨床スクリーニングのための効果的なツールであり得る。上記の理由は、一次ヒトミクログリアの分離のための費用対効果の高いプロトコルの必要性の高まりを強調しています。
我々は、腫瘍切除または他の外科的切除のために作成された外科的窓の結果として収集された成人ヒト脳組織から原発ヒトミクログリアを単離するためのプロトコルを開発した。この方法は既存の方法とは大きく異なります。組織採取部位から約75分後にミクログリアを単離培養し、実験室で隔離プロトコルを開始することができた。我々は、単離ミクログリアの増殖を促進するためにL929線維芽細胞の上清を使用している。この方法は、特に、一次ミクログリアのみの培養と開発に焦点を当てています。得られた培養物は約80%ミクログリアである。他のプロトコルは、密度勾配遠心分離、フローサイトメトリーおよび磁気ビーズによってミクログリアの豊かな培養を提供する一方で、プロトコルは、一次ヒトミクログリア17、18、19、2018,19,を培養するための迅速でシンプルで堅牢で費用対効果の高い方法である。1720死体から固定された脳組織の代わりに外科的に除去された生きた成人の脳組織を利用する能力は、既存の手順18,21とは対照的に、21この方法の付加的な利点を証明する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>A002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (4 &#176;C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>146532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>New Brunswik</td>
			<td>Galaxy 170 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium with glutamine</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>AL007S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM9955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flacon tube (50 ml)</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>50CD1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1</td>
			<td>Vector</td>
			<td>FL-1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>GA5</td>
			<td>3670S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswik Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC&#160;CCL-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar air flow</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monosodium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Mixture F-12 Ham Medium</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Al106S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td>237554805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>ML023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Labware</td>
			<td>LW-SP1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.2&#956;, 25 mm diameter)</td>
			<td>Axiva</td>
			<td>SFPV25R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture.</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TCG4-20X10NO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining human microglia from adult human brain tissue

ミクログリアは中枢神経系の自然免疫細胞(CNS)に居住している。ミクログリアは、発達中、恒常性維持、感染または傷害の間に重要な役割を果たす。いくつかの独立した研究グループは、ミクログリアが自己免疫疾患、自己炎症性症候群および癌において果たす中心的な役割を強調している。いくつかの神経疾患におけるミクログリアの活性化は、病原性プロセスに直接関与する可能性があります。原発性ミクログリアは、脳内の免疫応答、細胞と細胞の相互作用、疾患における調節不全ミクログリア型を理解するための強力なツールです。一次ミクログリアは、不死化ミクログリア細胞株よりもビボミクログリア特性を模倣する。ヒト成人ミクログリアは、ヒト胎児およびげっ歯類ミクログリアと比較して、異なる特性を示す。このプロトコルは、成人の人間の脳から原発性ミクログリアを分離するための効率的な方法を提供する。これらのミクログリアを研究することは、オリゴデンドロサイト、ニューロンおよびアストロサイトを含むCNSにおけるミクログリアと他の居住細胞集団との間の細胞細胞相互作用に関する重要な洞察を提供することができる。さらに、異なる人間の脳からのミクログリアは、個別化された医療のためのユニークな免疫応答の特徴付けと無数の治療用途のために培養することができる。

上記のプロトコル(図1)を用いることで、生きた外科的に切除された脳組織から原発ヒトミクログリアを分離することができた。培養細胞は、ミクログリア(緑色)のリシヌスコミュニス凝集剤-1(RCA-1)レクチン(緑色)と、前述の22、23、24、25、26,23,24,25</...

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Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

このプロトコルは、生きている、大人、人間の脳組織から原発ミクログリアを単離する効率的で費用対効果が高く、堅牢な方法です。孤立した原発性ヒトミクログリアは、恒常性および疾患における細胞プロセスを研究するためのツールとして役立つ。

成人ヒト脳組織からのヒトミクログリアの取得

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

プロトコルの全体的な目標は、生きている成人の人間の脳組織から原発性ミクログリア細胞を分離することです。我々の場合、これは手術中に外科用窓として収集された。これは、最初に氷冷PBSで脳組織を収集することによって達成され、組織は1mmキューブの小片にダイシングされ、私はちょうどトリプシンEDTAの助けを借りて行った。これに続いて、細胞は遠心分離によって収穫され、アンドロゲン細胞培養に適したフラスコで48時間メッキされる。細胞はフラスコからもう一度収穫され、さらに使用されるまで培養される。原発性ヒトミクログリア細胞は、免疫細胞化学を用いて特徴付けることができ、さらなる実験に使用することができる。成人のヒト脳組織からミクログリア細胞を単離するためのプロトコルの主な利点は、非常に費用対効果の高い方法で原発性成人ヒトミクログリア細胞を効果的に提供することです。このプロトコルは堅牢であり、既存のプロトコルで使用されるステップ数を減らすことでセルの損失を減らします。10 mLの氷冷aCSFを含む50mLファルコンチューブに組織を集める。70%アルコールで回収管を丁寧に拭き取り、無菌層空気流室に移します。aCSFを慎重に廃棄し、ファルコンチューブ内の組織を計量します。空のファルコンチューブの重量を推定することによって、組織のおよその重量を計算します。37度摂氏に新鮮なaCSFを温めます。組織を暖かいaCSFに5分間保管してください。このステップは細胞死を避けるために重要です。aCSF を慎重に破棄してください。そして、1X PBSで一度組織を37度に温めます。必要に応じて、PBSを繰り返し洗浄して、すべての血液を洗い流してください。組織を温かいPBSで5分間インキュベートする。PBS の半分を慎重に破棄します。残りのPBSと一緒に組織を殺菌されたペトリ皿に移す。残りのPBSを1-mLピペットで慎重に取り除いてください。これは、組織の損失を防ぐことができます.滅菌メスを使用して少なくとも1ミリメートルキューブの小片に出すダイス。ペトリ皿に0.25%トリプシンEDTAの2 mLを加え、ピペットの助けを借りてプレートを十分に洗います。0.25%トリプシンEDTAのグラム組織あたり10 mLを含む50 mLファルコンチューブにダイシングされた組織を移す。10 mL血清ピペットを通してピペットで混ぜます。37°Cで30分間、250rpmの速度でシェーカーにチューブをインキュベートします。トリプシンを中和するために中和媒体の10 mLを追加します。10 mL血清ピペットと十分に混ぜます。チューブを摂氏4度で2000Gで10分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを培地1mLで再懸濁する。アンドロゲン細胞に適したT25フラスコに細胞を置き、4 mLの培地を追加します。培養培地は、20%L929上清および1%ストレプトマイシンを含有する。L929上清をストック培地に添加するのではなく、フラスコに別途添加することをお勧めします。我々は、均質に組織を処分するフラスコで終了しています。これは、汚染の可能性を高める可能性があるため、揺れながらフラスコの首にメディアを持ち込まないようにしてください。フラスコを摂氏37度で5%CO2で48時間インキュベートします。遠心チューブで0日目に作製したT25培養フラスコから培地を収集します。摂氏4度で1,466Gで収集した培地を4分間遠心分離する。収集した培地が遠心分離されている間、1日0フラスコを1X PBSで1回洗います。フラスコを軽く振って残った組織の断片を取り除きます。残骸は培養に悪影響を及ぼさないため、フラスコの過酷な揺れを避けてください。フラスコに5mLの新鮮な培養培地を加えます。遠心チューブから上清を捨てます。1 mLの培養液をチューブの1つに加え、ピペットと十分に混ぜます。他のチューブに細胞と混合メディアを連続して追加し、十分に混合します。アンドロゲン細胞に適した別のT25フラスコに細胞を置きます。フラスコに4mLの新鮮な培養培地を加えます。5%CO2で37度でフラスコを48時間インキュベートします。フラスコから培地を捨て、新鮮な5mL培養培地を追加します。5%CO2で37度でフラスコを48時間インキュベートします。6日目には、細胞はさらなる実験の準備ができています。ここに表される画像で。セクションの第1パネル GFAPで染色されたアストロサイト、緑色。第2のパネルでは、セクションAのRCAを有するミクログリア染色、緑色。セクションBミクログリアは、色が緑色であるRCAで染色され、アストロサイトはGFAP、赤色の色で染色されています。画像のオーバーレイは、ミクログリアとアストロサイトを一緒に示しています。画像からは、調製した培養中の細胞の大部分がミクログリアであることは明らかである。画像をブラインドコントロールによって定量化し、その結果がC節で表され、その結果、調製した培養中の細胞の約80%がミクログリア細胞であることを示した。この技術は約1時間半で行うことができる。この手順に従って、私は下流の実験にさらに使用することができる成人の人間の脳組織からプライミングミクログリアを選択する方法をよく理解する必要があります。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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