Name: obtaining human microglia from adult human brain tissue
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue at JoVE.com

SJs laboratorium ble etablert med institusjonelle tilskudd fra IITJ og er finansiert av tilskudd fra Institutt for bioteknologi (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) og Ministry of Electronics and Information Technology Government of India (Nr. 4(16)/2019-ITEA). De menneskelige hjernevevsseksjonene ble hentet fra All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur etter institusjonell etikkkomitéklarering. Vi takker Mayank Rathor, B.Tech Student medlem av Design and Arts Society IIT Jodhpur, for videografi støtte.

Alle vev ble kjøpt etter etisk klarering fra instituttets etiske komiteer ved Indian Institute of Technology Jodhpur og All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.
1.Tissue oppkjøp og behandling (Dag 0)
<ol><li>Samle vevet i et 50 ml rør som inneholder 10 ml iskald kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) (2 mM CaCl2∙2H2O, 10 mM glukose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3,2,5 mM NaH2PO4,1 mM MgCl2∙6H2O, 202 mM suk...

<ol>
	<li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+-+more+than+just+brain+glue.">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li><li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+Beyond:+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function.">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li><li>Gordon, S., Pl&#252;ddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+heterogeneity+in+tissues:+phenotypic+diversity+and+functions.">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease:+A+microglial+conundrum.">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li><li>Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+phagocytic+clearance+in+Parkinson's+disease.">Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).</li><li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functions+of+Microglia+in+Ischemic+Stroke.">Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).</li><li>Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Central+Nervous+System+Inflammation+and+Multiple+Sclerosis+Pathology.">Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology.</a> Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).</li><li>Loane, D. J., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+TBI+brain:+The+good,+the+bad,+and+the+dysregulated.">Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated.</a> Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).</li><li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neuropathic+pain:+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential.">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).</li><li>Bellver-Landete, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+are+an+essential+component+of+the+neuroprotective+scar+that+forms+after+spinal+cord+injury.">Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury.</a> Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).</li><li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/Brain+Macrophages+as+Central+Drivers+of+Brain+Tumor+Pathobiology.">Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li><li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+side+of+microglia.">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Brain+Myeloid+Expression+Profiles+Reveal+Distinct+Microglial+Activation+States+and+Aspects+of+Alzheimer's+Disease+Not+Evident+in+Mouse+Models.">Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+Alzheimer's+disease-associated+genes+in+primary+human+microglia.">PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).</li><li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile.">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55 (4), 412-424 (2007).</li><li>Mizee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+microglia+from+the+human+post-mortem+brain:+effects+of+ante-+and+post-mortem+variables.">Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+enriched+primary+human+microglia+for+functional+studies.">Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies.</a> Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).</li><li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics.">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li><li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples.">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inflammasome+Sensor,+NLRP3,+Regulates+CNS+Inflammation+and+Demyelination+via+Caspase-1+and+Interleukin-18.">The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).</li><li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes.">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li><li>Plant, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphotoxin+beta+receptor+(Lt+betaR):+dual+roles+in+demyelination+and+remyelination+and+successful+therapeutic+intervention+using+Lt+betaR-Ig+protein.">Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model.">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination.">TNF&#945; promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li><li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+macrophage+production.">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).</li><li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant.">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li><li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells.">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li></ol>

Microglia sikre homeostase i normal hjerne og spille sentrale roller i patofysiologien til ulike nevrologiske sykdommer4. Microglia er sentrale for nevroutvikling og dannelse av synapser2. Mikrogliale studier har vist seg avgjørende for å forstå utviklingen og utviklingen av ulike nevrologiske sykdommer4. Rodent microglia er den utbredte modellen for primære mikrogliale studier, selv om gnagermikroglia er forskjellig fra primær menneskelig mikro...

Sentralnervesystemet (CNS) er konstruert av et komplekst nettverk av nevroner og glialceller1. Blant glialcellene fungerer microglia som de medfødte immuncellene i CNS2,3. Microglia er ansvarlig for å opprettholde homeostase i den sunne CNS4. Microglia spiller også en viktig rolle i nevroutvikling, ved beskjæring synapser2. Microglia er sentrale i patofysiologien til flere nevrologiske sykdommer, inkludert, men ikke begrenset til; Alzheimers sykdom5, Parkinsons sykdom6, hjerneslag7, multippel sklerose8, traumatisk hjerneskade9, nevropatisk smerte10, ryggmargsskade11 og hjernesvulster som gliomer12.
Studier relatert til CNS homeostase og sykdommer benytter gnagermikroglia på grunn av en mangel på kostnadseffektive og tidseffektive menneskelige primære mikrogliaiisolasjonsprotokoller13. Rodent microglia ligner primær human mikroglia i uttrykk for gener som Iba-1, PU.1, DAP12 og M-CSF reseptor og har vært effektive i å forstå normal samt syk hjerne13. Interessant, uttrykket av flere immunrelaterte gener som TLR4, MHC II, Siglec-11 og Siglec-3 varierer mellom menneskelig og gnager microglia13. Uttrykket av flere gener varierer også i timelig uttrykk og i nevrodegenerative sykdommer i beggeartene 14,15. Disse signifikante forskjellene gjør menneskelig mikroglia til en viktig modell for å studere mikrogliafunksjon i homeostase og sykdom. Primær menneskelig microglia kan også være et effektivt verktøy for preklinisk screening av potensielle legemiddelkandidater16. De ovennevnte årsakene understreker det økende behovet for kostnadseffektive protokoller for isolering av primær menneskelig mikroglia.
Vi har utviklet en protokoll for isolering av primær menneskelig mikroglia fra voksent menneskelig hjernevev samlet som følge av kirurgisk vindu opprettet for tumorreseksjoner eller andre kirurgiske reseksjoner. Metoden her er betydelig forskjellig fra eksisterende metoder. Vi var i stand til å isolere og kultur microglia etter en transitttid på ca 75 minutter fra vevsamlingsstedet for å starte isolasjonsprotokollen i laboratoriet. Vi har brukt supernatant av L929 fibroblast celler for å fremme veksten av isolertmikroglia. Denne metoden fokuserer spesielt på kultur og utvikling av bare primære microglia. Den resulterende kulturen utarbeidet er ca 80% microglia. Mens andre protokoller gir en beriket kultur av mikroglia ved tetthet gradient sentrifugering, strømningscytometri og magnetiske perler, er protokollen en rask, enkel, robust og kostnadseffektiv måte å kultur primære menneskelige microglia17,18,19,20. Evnen til å utnytte kirurgisk fjernet levende voksen hjernevev i stedet for fast hjernevev fra beviser en ekstra fordel med denne metoden i motsetning til eksisterende prosedyrer18,21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>A002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (4 &#176;C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>146532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>New Brunswik</td>
			<td>Galaxy 170 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium with glutamine</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>AL007S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM9955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flacon tube (50 ml)</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>50CD1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1</td>
			<td>Vector</td>
			<td>FL-1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>GA5</td>
			<td>3670S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswik Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC&#160;CCL-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar air flow</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monosodium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Mixture F-12 Ham Medium</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Al106S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td>237554805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>ML023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Labware</td>
			<td>LW-SP1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.2&#956;, 25 mm diameter)</td>
			<td>Axiva</td>
			<td>SFPV25R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture.</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TCG4-20X10NO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining human microglia from adult human brain tissue

Microglia er bosatt medfødte immunceller i sentralnervesystemet (CNS). Microglia spiller en kritisk rolle under utviklingen, i å opprettholde homeostase, og under infeksjon eller skade. Flere uavhengige forskningsgrupper har fremhevet den sentrale rollen som microglia spiller i autoimmune sykdommer, autoinflammatoriske syndromer og kreft. Aktiveringen av microglia i noen nevrologiske sykdommer kan direkte delta i patogene prosesser. Primær mikroglia er et kraftig verktøy for å forstå immunresponsene i hjernen, cellecelleinteraksjoner og dysregulerte mikrogliafenotyper i sykdom. Primær microglia etterligne in vivo mikrogliale egenskaper bedre enn udødeliggjort mikroglial cellelinjer. Human voksen microglia viser forskjellige egenskaper sammenlignet med humant foster og gnagermikroglia. Denne protokollen gir en effektiv metode for isolering av primær mikroglia fra voksen menneskelig hjerne. Å studere disse mikroglia kan gi kritisk innsikt i cellecelleinteraksjoner mellom microglia og andre fastboende cellulære populasjoner i CNS, inkludert oligodendrocytter, nevroner og astrocytter. I tillegg kan microglia fra forskjellige menneskelige hjerner dyrkes for karakterisering av unike immunresponser for personlig medisin og et mylder av terapeutiske applikasjoner.

Ved å bruke ovennevnte protokoll (figur 1) var vi i stand til å isolere primære menneskelige mikroglia fra levende kirurgisk resected hjernevev. Kultiverte celler ble farget med Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) lectin for microglia (grønn) og med Glial fibrillær surt protein (GFAP) for astrocytter (rød) (Figur 2) som tidligere beskrevet22,23,</sup...

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue at JoVE.com

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Denne protokollen er en effektiv, kostnadseffektiv og robust metode for å isolere primærmikroglia fra levende, voksent, menneskelig hjernevev. Isolert primær human mikroglia kan tjene som et verktøy for å studere cellulære prosesser i homeostase og sykdom.

Få humanmikroglia fra voksent menneskelig hjernevev

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Det overordnede målet med protokollen er å isolere primære mikrogliaceller fra levende voksne menneskelige hjernevev. I vårt tilfelle ble dette samlet inn som kirurgisk vindu under operasjonen. Dette oppnås ved først å samle hjernevevet i iskald PBS, vevet blir deretter terninger i 1 mm kube små biter, og jeg gjorde bare ved hjelp av trypsin EDTA.Etter dette høstes cellene ved sentrifugering og belagt i en kolbe egnet for androgencellekultur i 48 timer. Celler høstes igjen fra kolben og dyrkes til videre bruk. Primære humane mikrogliaceller kan nå karakteriseres ved hjelp av immunocytokjemi og brukes til videre eksperiment.Den største fordelen med vår protokoll for å isolere mikrogliaceller fra voksne menneskelige hjernevev er at det effektivt gir primære voksne menneskelige mikrogliaceller på en svært kostnadseffektiv måte. Protokollen er robust og reduserer tapet av celler ved å redusere antall trinn som brukes i eksisterende protokoller. Samle vevet i en 50 ml Falcon rør som inneholder 10 ml iskald aCSF.Tørk oppsamlingsrøret forsiktig med 70% alkohol og overfør til et aseptisk laminær luftstrømningskammer. Kast aCSF nøye og vei vev i Falcon-røret. Beregn den ca vekten av vev ved å utlede vekten av tomt Falcon-rør.Varm fersk aCSF til 37 grader celsius. Hold vevet i varm aCSF i fem minutter. Dette trinnet er avgjørende for å unngå celledød.Kast aCSF nøye. Og vaske vev en gang med 1X PBS varmet til 37 grader celsius. Sørg for at alt blod vaskes bort med gjentatte PBS-vasker etter behov.Inkuber vevet i varmt PBS i 5 minutter. Kast halvparten av PBS nøye. Overfør vev sammen med gjenværende PBS til en sterilisert petriskål.Fjern gjenværende PBS forsiktig med 1 ml pipette. Dette vil forhindre tap av vev. Terninger som utsteder i minst 1 mm kube små stykker ved hjelp av en steril skalpell.Tilsett 2 ml 0,25 % trypsin EDTA i petriskålen og vask platen grundig ved hjelp av pipette. Overfør terninger vev til en 50 ml Falcon rør som inneholder 10 ml per gram vev på 0,25% trypsin EDTA. Bland ved å pipetter gjennom en 10 ml serologisk pipette.Inkuber røret på en shaker i 30 minutter ved 37 grader celsius og hastigheten på 250 rpm. Tilsett 10 ml nøytraliserende medium for å nøytralisere trypsin. Bland godt med en 10 ml serologisk pipette.Sentrifuger røret ved 2000G ved 4 grader celsius i 10 minutter. Kast den overnaturlige og resuspend pellet i 1 ml kultur medium. Legg cellene i en T25 kolbe egnet for androgen celler og legge til 4 ml ekstra kultur medium.Kulturmedium vil inneholde 20% L929 supernatant og 1% streptomycin. Det anbefales å legge til L929 supernatant separat i flasker i stedet for å legge til lagerkulturmediet. Vi er ferdige med kolben for å homogent kaste vevet.Unngå å bringe media til halsen på kolben mens du rister, da dette kan øke sjansene for forurensning. Inkuber kolben ved 37 grader celsius med 5% CO2 i 48 timer. Samle media fra T25 kultur kolbe utarbeidet på dag 0 i sentrifuge rør.Sentrifuge de innsamlede mediene på 1, 466G ved 4 grader sentrifugering i 4 minutter. Mens det innsamlede mediet sentrifugeres, vasker du dagen 0 kolbe en gang med 1X PBS. Rist kolben forsiktig for å fjerne eventuelle restvevfragmenter igjen.Unngå hard risting av kolben som noen restfragmenter vil ikke påvirke kulturen negativt. Legg til 5 ml friske kulturmedier i kolben. Kast supernatanten fra sentrifugerte rør.Tilsett 1 ml kulturmedium til et av rørene og bland godt med pipette. Føljetong legge blandet media med celler til andre rør og bland grundig. Legg cellene i en egen T25 kolbe egnet for androgenceller.Legg til 4 ml friske kulturmedier i kolben. Inkuber begge kolben ved 37 grader celsius med 5% CO2 i 48 timer. Kast mediene fra begge kolben og legg til friske 5 ml kulturmedier.Inkuber kolben ved 37 grader celsius ved 5% CO2 i 48 timer. På sjette dag vil cellene være klare for ytterligere eksperimenter. På bildene som er representert her.Første panel av seksjonen A astrocytter farget med GFAP, grønn i fargen. I det andre panelet, av seksjon En microglia flekk med RCA, grønn i fargen. I avsnittet B microglia farget med RCA, som er grønn i fargen, og astrocytter er farget med GFAP, rød i fargen.Overlegg av bildene viser microglia og astrocytter sammen. Det er klart fra bildene at flertallet av cellene i kulturen forberedt er microglia. Bildene ble kvantifisert av blindet kontroll og resultatet er representert i seksjon C.Resultatene viste at ca 80% av cellene i kulturen forberedt er microglia celler.Denne teknikken kan utføres om omtrent en og en halv time. Etter denne prosedyren bør ha en god forståelse av hvordan velger jeg priming microglia fra voksne menneskelige hjernevev, som kan brukes videre for nedstrøms eksperimenter.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Stamfar-avledet Oligodendrocyte Kultur System fra Human fosterets hjerne

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Fiberoptisk Implantasjon for kronisk Optogenetic Stimulering av hjernevev

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering av Pericyte-deriverte celler av den voksne Human Brain inn Utførte Nerveceller

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Enkel generasjon av en høy avkastning kultur indusert neurons fra menneskelige voksne huden fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolering av Cerebral kapillærer fra friske menneskelige hjernevev

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolasjon og RNA utvinning av Neurons, makrofager og Microglia fra larver sebrafisk hjerner

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Kortsiktige fritt flytende Slice kulturer fra Adult Human Brain

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Cochlear forbehandling i voksen mus

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...