Name: obtaining human microglia from adult human brain tissue
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00
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O laboratório da SJ foi criado com subvenções institucionais da IITJ e é financiado por subvenções do Departamento de Biotecnologia (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) e do Ministério de Eletrônica e Tecnologia da Informação do Governo da Índia (nº 4(16)/2019-ITEA). As seções de tecido cerebral humano foram obtidas do All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur após a liberação do Comitê de Ética Institucional. Agradecemos a Mayank Rathor, membro do B.Tech Student da Design and Arts Society IIT Jodhpur, pelo apoio à videografia.

Todos os tecidos foram adquiridos após liberação ética dos comitês de ética do Instituto Indiano de Tecnologia Jodhpur e do All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.
1.Aquisição e processamento de tecidos (Dia 0)
<ol><li>Colete o tecido em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de líquido cerebrospinal artificial gelado (aCSF) (2 mM CaCl2∙2H2O, 10 mM de glicose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2</...

<ol>
	<li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+-+more+than+just+brain+glue.">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li><li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+Beyond:+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function.">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li><li>Gordon, S., Pl&#252;ddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+heterogeneity+in+tissues:+phenotypic+diversity+and+functions.">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease:+A+microglial+conundrum.">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li><li>Tremblay, M. -. E., Cookson, M. 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H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/Brain+Macrophages+as+Central+Drivers+of+Brain+Tumor+Pathobiology.">Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li><li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+side+of+microglia.">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Brain+Myeloid+Expression+Profiles+Reveal+Distinct+Microglial+Activation+States+and+Aspects+of+Alzheimer's+Disease+Not+Evident+in+Mouse+Models.">Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+Alzheimer's+disease-associated+genes+in+primary+human+microglia.">PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).</li><li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile.">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55 (4), 412-424 (2007).</li><li>Mizee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+microglia+from+the+human+post-mortem+brain:+effects+of+ante-+and+post-mortem+variables.">Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+enriched+primary+human+microglia+for+functional+studies.">Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies.</a> Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).</li><li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics.">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li><li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples.">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inflammasome+Sensor,+NLRP3,+Regulates+CNS+Inflammation+and+Demyelination+via+Caspase-1+and+Interleukin-18.">The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).</li><li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes.">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li><li>Plant, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphotoxin+beta+receptor+(Lt+betaR):+dual+roles+in+demyelination+and+remyelination+and+successful+therapeutic+intervention+using+Lt+betaR-Ig+protein.">Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model.">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination.">TNF&#945; promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li><li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+macrophage+production.">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).</li><li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant.">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li><li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells.">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li></ol>

Microglia garante homeostase no cérebro normal e desempenha papéis centrais na fisiopatologia de várias doenças neurológicas4. Microglia são centrais para o neurodesenvolvimento e formação de sinapses2. Estudos microgliais têm se mostrado fundamentais na compreensão do desenvolvimento e progressão de diversas doenças neurológicas4. A microglia de roedores é o modelo predominante de escolha para estudos microgliais primários, embora, a ...

O sistema nervoso central (SNC) é construído de uma complexa rede de neurônios e células gliais1. Entre as células gliais, a microglia funciona como as células imunes inatas do CNS2,3. A Microglia é responsável pela manutenção da homeostase no CNS4saudável . A microglia também desempenha um papel importante no neurodesenvolvimento, podando as sinapses2. A microglia é central para a fisiopatologia de várias doenças neurológicas, incluindo, mas não restritas; Doença de Alzheimer5, Doença de Parkinson6, derrame7, esclerose múltipla8,lesão cerebral traumática9,dor neuropática10,lesão medular11 e tumores cerebrais como gliomas12.
Estudos relacionados à homeostase e doenças do CNS utilizam microglia de roedores devido à escassez de protocolos de isolamento primário primário humano13. A microglia de roedores se assemelha à microglia humana primária na expressão de genes como Iba-1, PU.1, DAP12 e receptor M-CSF e tem sido eficaz na compreensão do cérebro normal e doente13. Curiosamente, a expressão de vários genes relacionados imunológicos como TLR4, MHC II, Siglec-11 e Siglec-3 varia entre microglia humana eroedora 13. A expressão de vários genes também varia na expressão temporal e em doenças neurodegenerativas em ambas as espécies14,15. Essas diferenças significativas fazem da microglia humana um modelo essencial para estudar a função da microglia na homeostase e na doença. A microglia humana primária também pode ser uma ferramenta eficaz para a triagem pré-clínica de potenciais candidatos a medicamentos16. As razões acima mencionadas sublinham a crescente necessidade de protocolos econômicos para o isolamento da microglia humana primária.
Desenvolvemos um protocolo para isolamento da microglia humana primária do tecido cerebral humano adulto coletado como resultado de uma janela cirúrgica criada para ressecções tumorais ou outras ressecções cirúrgicas. O método aqui é consideravelmente diferente dos métodos existentes. Conseguimos isolar e cultivar microglia após um tempo de trânsito de cerca de 75 minutos do local de coleta de tecidos para iniciar o protocolo de isolamento em laboratório. Usamos o supernascer de células fibroblastos L929 para promover o crescimento de microglia isolada. Este método foca especificamente na cultura e desenvolvimento apenas de microglia primária. A cultura resultante preparada é de cerca de 80% de microglia. Enquanto outros protocolos fornecem uma cultura enriquecida de microglia por centrífuga de gradiente de densidade, citometria de fluxo e contas magnéticas, o protocolo é uma maneira rápida, simples, robusta e econômica de cultivar microglia humana primária17,,18,,19,,20. A capacidade de utilizar tecido cerebral adulto vivo removido cirurgicamente em vez de tecidos cerebrais fixos de cadáveres prova uma vantagem adicional deste método em contraste com os procedimentos existentes18,,21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>A002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (4 &#176;C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>146532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>New Brunswik</td>
			<td>Galaxy 170 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium with glutamine</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>AL007S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM9955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flacon tube (50 ml)</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>50CD1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1</td>
			<td>Vector</td>
			<td>FL-1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>GA5</td>
			<td>3670S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswik Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC&#160;CCL-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar air flow</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monosodium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Mixture F-12 Ham Medium</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Al106S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td>237554805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>ML023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Labware</td>
			<td>LW-SP1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.2&#956;, 25 mm diameter)</td>
			<td>Axiva</td>
			<td>SFPV25R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture.</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TCG4-20X10NO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining human microglia from adult human brain tissue

Microglia são células imunes inatas residentes do sistema nervoso central (SNC). A microglia desempenha um papel crítico durante o desenvolvimento, na manutenção da homeostase, e durante a infecção ou lesão. Vários grupos de pesquisa independentes têm destacado o papel central que a microglia desempenha em doenças autoimunes, síndromes autoinflamatórias e cânceres. A ativação da microglia em algumas doenças neurológicas pode participar diretamente de processos patogênicos. A microglia primária é uma ferramenta poderosa para entender as respostas imunes no cérebro, interações células-células e fenótipos de microglia desregulados na doença. Microglia primária imita propriedades microgliais in vivo melhor do que linhas de células microgliais imortalizadas. Microglia adulta humana apresenta propriedades distintas em comparação com microglia fetal e roedora humana. Este protocolo fornece um método eficiente para o isolamento da microglia primária do cérebro humano adulto. Estudar essas microglias pode fornecer insights críticos sobre as interações célula-células entre microglia e outras populações celulares residentes no CNS, incluindo oligodenrócitos, neurônios e astrócitos. Além disso, a microglia de diferentes cérebros humanos pode ser cultivada para caracterização de respostas imunes únicas para medicina personalizada e uma miríade de aplicações terapêuticas.

Usando o protocolo acima mencionado (Figura 1), conseguimos isolar microglia humana primária de tecidos cerebrais ressecados cirurgicamente vivos. As células cultivadas foram manchadas com Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) lectina para microglia (verde) e com proteína ácida fibrilar glia (GFAP) para astrócitos (vermelho) (Figura 2) como descrito anteriormente22,<sup class="xref...

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Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Este protocolo é um método eficiente, econômico e robusto de isolar microglia primária de tecido cerebral vivo, adulto e humano. A microglia humana primária isolada pode servir como ferramenta para estudar processos celulares em homeostase e doenças.

Obtenção de Microglia Humana de Tecido Cerebral Humano Adulto

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

O objetivo geral do protocolo é isolar as células primárias de microglia de tecidos cerebrais humanos adultos vivos. No nosso caso, isso foi coletado como janela cirúrgica durante a cirurgia. Isso é feito coletando inicialmente os tecidos cerebrais em PBS gelado, o tecido é então cortado em pequenos pedaços cubos de 1 mm, e eu só fiz com a ajuda da trippsina EDTA.Depois disso, as células são colhidas por centrifugação e banhadas em um frasco adequado para a cultura das células andrógenas por 48 horas. As células são colhidas mais uma vez do frasco e cultivadas até o uso posterior. As células primárias de microglia humanas podem agora ser caracterizadas pelo uso de imunocytoquímica e usadas para mais experimentos.A principal vantagem do nosso protocolo para isolar células de microglia de tecidos cerebrais humanos adultos é que ela fornece efetivamente células de microglia humanas adultas primárias de uma maneira muito econômica. O protocolo é robusto e reduz a perda de células reduzindo o número de etapas que estão sendo utilizadas nos protocolos existentes. Colete o tecido em um tubo Falcon de 50 mL contendo 10 mL de gelo frio aCSF.Limpe o tubo de coleta cuidadosamente com 70% de álcool e transfira para uma câmara de fluxo de ar asséptico laminar. Descarte o aCSF cuidadosamente e pese tecido no tubo Falcão. Calcule o peso aproximado do tecido deduzindo o peso do tubo falcão vazio.ACSF fresco quente a 37 graus centígrados. Mantenha o tecido aquecido aCSF por cinco minutos. Este passo é fundamental para evitar a morte celular.Descarte aCSF cuidadosamente. E lave o tecido uma vez com 1X PBS aquecido a 37 graus centígrados. Certifique-se de que todo o sangue seja lavado com lavagens repetidas da PBS, conforme necessário.Incubar o tecido em PBS quente por 5 minutos. Descarte metade do PBS cuidadosamente. Transfira tecido junto com o PBS restante para uma placa de Petri esterilizada.Remova cuidadosamente o PBS restante com pipeta de 1 mL. Isso evitará a perda de tecido. Dados que emitem em pelo menos 1 mm cubo pequenos pedaços usando um bisturi estéril.Adicione 2 mL de 0,25% de trippsina EDTA à placa de Petri e lave bem a placa com a ajuda da pipeta. Transfira o tecido picado para um tubo Falcon de 50 mL contendo 10 mL por grama de tecido de 0,25% de trippsina EDTA. Misture por pipetação através de uma pipeta sorológica de 10 mL.Incubar o tubo em um agitador por 30 minutos a 37 graus centígrados e a velocidade de 250 rpm. Adicione 10 mL de meio neutralizador para neutralizar a trippsina. Misture bem com uma pipeta sorológica de 10 mL.Centrifugar o tubo a 2000G a 4 graus centígrados por 10 minutos. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 1 mL de meio de cultura. Coloque as células em um frasco T25 adequado para células andrógenas e adicione 4 mL de meio de cultura adicional.O meio cultural conterá 20%L929 sobrenante e 1%estreptomicina. Recomenda-se adicionar L929 supernacido separadamente em frascos em vez de adicionar ao meio de cultura de estoque. Terminamos com o frasco para descartar o tecido de forma homogênea.Evite trazer a mídia para o pescoço do frasco enquanto treme, pois isso pode aumentar as chances de contaminação. Incubar o frasco a 37 graus centígrados com 5% de CO2 por 48 horas. Colete a mídia do frasco de cultura T25 preparado no dia 0 em tubos de centrífuga.Centrifugar a mídia coletada a 1.466G a 4 graus centígrados por 4 minutos. Enquanto a mídia coletada está sendo centrifugada, lave o frasco do dia 0 uma vez com 1X PBS. Agite o frasco suavemente para remover quaisquer fragmentos de tecido remanescentes deixados.Evite o tremor severo do frasco, pois qualquer fragmento remanescente não afetará negativamente a cultura. Adicione 5 mL de mídia de cultura fresca ao frasco. Descarte o supernatante de tubos centrifugados.Adicione 1 mL de cultura média a um dos tubos e misture bem com pipeta. Adicione a mídia mista com células a outros tubos e misture bem. Coloque as células em um frasco T25 separado adequado para células andrógenas.Adicione 4 mL de mídia de cultura fresca ao frasco. Incubar os frascos a 37 graus centígrados com 5% de CO2 por 48 horas. Descarte a mídia de ambos os frascos e adicione mídia de cultura fresca de 5 mL.Incubar os frascos a 37 graus centígrados a 5% de CO2 por 48 horas. No sexto dia, as células estarão prontas para mais experimentos. Nas imagens aqui representadas.Primeiro painel da seção A astrócitos manchados com GFAP, de cor verde. No segundo painel, da seção A mancha de microglia com RCA, de cor verde. Na seção B microglia manchada com RCA, que é de cor verde, e os astrócitos são manchados com GFAP, de cor vermelha.A sobreposição das imagens mostra microglia e astrócitos juntos. Fica claro pelas imagens que a maioria das células da cultura preparadas são microglia. As imagens foram quantificadas por controle cego e o resultado é representado na seção C.Os resultados mostraram que cerca de 80% das células da cultura preparada são células de microglia.Esta técnica pode ser realizada em cerca de uma hora e meia. Após este procedimento deve ter uma boa compreensão de como eu seleciono microglia de tecidos cerebrais humanos adultos, que podem ser usados para experimentos a jusante.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

Jogo computador baseado combinando experimentos comportamentais com alta densidade de rastreamento Gaze EEG e Infravermelho

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

Neurociência

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Uma abordagem rápida para alta resolução de imagem de fluorescência em fatias grossas Semi-Cérebro

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Progenitor derivado Sistema de Cultura oligodendroglial Cérebro Fetal Humano

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Implantação de fibra óptica para Estimulação Crônica optogenética do Tecido Cerebral

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-reprogramação de células pericyte derivados do Adulto Cérebro Humano em neurônios induzidos

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Simples geração de uma cultura de alto rendimento de neurônios induzidas de fibroblastos de pele humana adulta

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolamento dos capilares cerebrais do tecido do cérebro humano fresco

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Culturas de fatias flutuantes de curto prazo do cérebro humano adulto

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Preparação da superfície coclear no mouse adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...