Name: obtaining human microglia from adult human brain tissue
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue at JoVE.com

Лаборатория SJ была создана на институциональных грантах от IITJ и финансируется за счет грантов Департамента биотехнологии (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) и Министерства электроники и информационных технологий Правительства Индии (No 4 (16)/2019-ITEA). Участки ткани мозга человека были получены из Всеиндийского института медицинских наук (AIIMS) Jodhpur после институционального разрешения комитета по этике. Мы благодарим Майанк Ратор, B.Tech Студент член дизайна и искусства общества IIT Jodhpur, за поддержку видеосъемки.

Все ткани были приобретены после этического разрешения от комитетов по этике института Индийского технологического института Джодхпура и Всеиндийского института медицинских наук (AIIMS) Джодхпура.
1.Tissue приобретения и обработки (День 0)
<ol><li>Соберите ткань в трубке 50 мл, с?...

<ol>
	<li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+-+more+than+just+brain+glue.">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li><li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+Beyond:+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function.">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li><li>Gordon, S., Pl&#252;ddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+heterogeneity+in+tissues:+phenotypic+diversity+and+functions.">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease:+A+microglial+conundrum.">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li><li>Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+phagocytic+clearance+in+Parkinson's+disease.">Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).</li><li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functions+of+Microglia+in+Ischemic+Stroke.">Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).</li><li>Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Central+Nervous+System+Inflammation+and+Multiple+Sclerosis+Pathology.">Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology.</a> Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).</li><li>Loane, D. J., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+TBI+brain:+The+good,+the+bad,+and+the+dysregulated.">Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated.</a> Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).</li><li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neuropathic+pain:+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential.">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).</li><li>Bellver-Landete, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+are+an+essential+component+of+the+neuroprotective+scar+that+forms+after+spinal+cord+injury.">Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury.</a> Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).</li><li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/Brain+Macrophages+as+Central+Drivers+of+Brain+Tumor+Pathobiology.">Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li><li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+side+of+microglia.">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Brain+Myeloid+Expression+Profiles+Reveal+Distinct+Microglial+Activation+States+and+Aspects+of+Alzheimer's+Disease+Not+Evident+in+Mouse+Models.">Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+Alzheimer's+disease-associated+genes+in+primary+human+microglia.">PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).</li><li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile.">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55 (4), 412-424 (2007).</li><li>Mizee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+microglia+from+the+human+post-mortem+brain:+effects+of+ante-+and+post-mortem+variables.">Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+enriched+primary+human+microglia+for+functional+studies.">Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies.</a> Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).</li><li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics.">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li><li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples.">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inflammasome+Sensor,+NLRP3,+Regulates+CNS+Inflammation+and+Demyelination+via+Caspase-1+and+Interleukin-18.">The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).</li><li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes.">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li><li>Plant, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphotoxin+beta+receptor+(Lt+betaR):+dual+roles+in+demyelination+and+remyelination+and+successful+therapeutic+intervention+using+Lt+betaR-Ig+protein.">Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model.">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination.">TNF&#945; promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li><li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+macrophage+production.">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).</li><li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant.">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li><li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells.">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li></ol>

Микроглии обеспечивают гомеостаз в нормальном мозге и играют центральную роль в патофизиологии различных неврологических заболеваний4. Микроглии имеют центральное значение для нейроразвития и формирования синапсов2. Микроглиальные исследования оказались ?...

Центральная нервная система (ЦНС) построена из сложной сети нейронов и глиальных клеток1. Среди глиальных клеток, микроглии функции врожденных иммунных клеток ЦНС2,3. Microglia отвечают за поддержание гомеостаза в здоровом ЦНС4. Microglia также играют важную роль в нейроразвитии, путем обрезки синапсов2. Микроглии занимают центральное место в патофизиологии нескольких неврологических заболеваний, включая, но не ограничиваясь; Болезнь Альцгеймера5, болезнь Паркинсона6, инсульт7, рассеянный склероз8, черепно-мозговая травма9, невропатические боли10, повреждение спинного мозга11 и опухоли головного мозга, такие как глиомы12.
Исследования, связанные с ГОМеостазом ЦНС и заболеваний использовать грызунов микроглии из-за нехватки экономически эффективным и время эффективного человека первичной микроглии изоляции протоколов13. Грызун микроглии напоминают первичной микроглии человека в экспрессии генов, таких как Iba-1, PU.1, DAP12 и M-CSF рецепторов и были эффективными в понимании нормального, а также больной мозг13. Интересно, что экспрессия нескольких ген, связанных с иммунитетом, таких как TLR4, MHC II, Siglec-11 и Siglec-3 варьируется между человеком и грызунами микроглии13. Выражение нескольких генов также варьируется в височной экспрессии и в нейродегенеративных заболеваний у обоих видов14,15. Эти значительные различия делают микроглию человека важной моделью для изучения функции микроглии при гомеостазе и болезни. Первичная человеческая микроглия также может быть эффективным инструментом для доклинического скрининга потенциальных кандидатов наркотиков16. Вышеупомянутые причины подчеркивают растущую потребность в экономически эффективных протоколах для изоляции первичной микроглии человека.
Мы разработали протокол изоляции первичной микроглии человека от тканей мозга взрослого человека, собранного в результате хирургического окна, созданного для резекции опухоли или других хирургических резекций. Метод здесь значительно отличается от существующих методов. Мы смогли изолировать и культуры микроглии после транзита время около 75 минут от места сбора тканей, чтобы начать изоляционный протокол в лаборатории. Мы использовали супернатант клеток фибробластов L929 для содействия росту изолированной микроглии. Этот метод конкретно фокусируется на культуре и развитии только первичной микроглии. Подготовленная в результате культура составляет около 80% микроглии. В то время как другие протоколы обеспечивают обогащенную культуру микроглии по плотности градиента центрифугации, потока цитометрии и магнитных бусин, протокол является быстрым, простым, надежным и экономически эффективным способом культуры первичной человеческой микроглии17,18,19,20. Способность использовать хирургически удалены живой ткани мозга взрослого вместо фиксированных тканей мозга из трупов доказывает дополнительное преимущество этого метода в отличие от существующих процедур18,21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>A002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (4 &#176;C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>146532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>New Brunswik</td>
			<td>Galaxy 170 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium with glutamine</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>AL007S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM9955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flacon tube (50 ml)</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>50CD1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1</td>
			<td>Vector</td>
			<td>FL-1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>GA5</td>
			<td>3670S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswik Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC&#160;CCL-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar air flow</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monosodium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Mixture F-12 Ham Medium</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Al106S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td>237554805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>ML023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Labware</td>
			<td>LW-SP1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.2&#956;, 25 mm diameter)</td>
			<td>Axiva</td>
			<td>SFPV25R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture.</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TCG4-20X10NO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining human microglia from adult human brain tissue

Микроглии являются резидентами врожденных иммунных клеток центральной нервной системы (ЦНС). Микроглии играют важную роль во время развития, в поддержании гомеостаза, а также во время инфекции или травмы. Несколько независимых исследовательских групп подчеркнули центральную роль, которую микроглии играют в аутоиммунных заболеваниях, аутовоспалительных синдромах и раковых заболеваниях. Активация микроглии при некоторых неврологических заболеваниях может непосредственно участвовать в патогенных процессах. Первичная микроглия является мощным инструментом для понимания иммунных реакций в головном мозге, клеточных клеточных взаимодействий и дисрегулируемых фенотипов микроглии при болезни. Первичная микроглия имитирует микроглиальные свойства vivo лучше, чем увековеченные линии микроглиальных клеток. Человеческая взрослая микроглия обладают различными свойствами по сравнению с человеческими микроглией плода и грызунов. Этот протокол обеспечивает эффективный метод изоляции первичной микроглии от взрослого человеческого мозга. Изучение этих микроглии может обеспечить критическое понимание клеточного взаимодействия между микроглией и другими резидентами клеток в ЦНС, включая олигодендроциты, нейроны и астроциты. Кроме того, микроглии из разных человеческих мозгов могут быть культуры для характеристики уникальных иммунных реакций для персонализированной медицины и множество терапевтических приложений.

Используя вышеупомянутый протокол(Рисунок 1),мы смогли изолировать первичную микроглию человека от живых хирургически резекированных тканей мозга. Культурные клетки были окрашены Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) лектин для микроглии (зеленый) и с Глиальным ?...

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue at JoVE.com

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Этот протокол является эффективным, экономически эффективным и надежным методом изоляции первичной микроглии от живой, взрослой, человеческой ткани мозга. Изолированная первичная микроглия человека может служить инструментом для изучения клеточных процессов при гомеостазе и болезнях.

Получение человеческой микроглии от взрослых тканей мозга человека

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Общая цель протокола состоит в том, чтобы изолировать первичные клетки микроглии от живых тканей мозга взрослого человека. В нашем случае, это было собрано как хирургическое окно во время операции. Это достигается путем первоначального сбора тканей мозга в ледяной PBS, ткани затем кубиками на 1 мм куб мелкие кусочки, и я только что сделал с помощью трипсина EDTA.После этого клетки собирают центрифугацию и помыли в колбе, пригодной для культуры клеток андрогенов в течение 48 часов. Клетки собирают еще раз из колбы и культивированы до дальнейшего использования. Первичные клетки микроглии человека теперь можно охарактеризовать с помощью иммуноцитохимии и использовать для дальнейших экспериментов.Основным преимуществом нашего протокола для изоляции клеток микроглии из тканей мозга взрослого человека является то, что он эффективно обеспечивает первичные клетки микроглии взрослого человека очень рентабельным способом. Протокол является надежным и уменьшает потерю ячеек за счет сокращения количества шагов, используемых в существующих протоколах. Соберите ткань в 50-мл Сокол трубки, содержащей 10 мл ледяного aCSF.Протрите трубку сбора тщательно с 70% алкоголя и передачи в асептический ламинарный поток воздуха камеры. Откажитесь от aCSF тщательно и взвесить ткани в трубке Сокола. Рассчитайте приблизительно вес ткани, вытемив вес пустой трубки Falcon.Теплый свежий aCSF до 37 градусов по Цельсию. Держите ткань в тепле aCSF в течение пяти минут. Этот шаг имеет решающее значение, чтобы избежать смерти клеток.Отбросьте aCSF тщательно. И мыть ткани один раз с 1X PBS нагревается до 37 градусов по Цельсию. Убедитесь, что вся кровь смывается с повторными PBS моет по мере необходимости.Инкубировать ткань в теплом PBS в течение 5 минут. Отбросьте половину PBS тщательно. Передача ткани вместе с оставшимися PBS в стерилизованную чашку Петри.Удалите оставшиеся PBS тщательно с 1-мл пипетки. Это предотвратит потерю тканей. Нарезать кубиками, что вопрос, по крайней мере 1-мм куб мелкие кусочки с помощью стерильного скальпеля.Добавьте 2 мл 0,25% трипсина EDTA в чашку Петри и тщательно вымойте тарелку с помощью пипетки. Перенесите нарезанную кубиками ткань в 50-метровую трубку Falcon, содержащую 10 мл на грамм ткани 0,25% трипсина EDTA. Смешайте с помощью пипетки через 10-мл серологических пипетки.Инкубировать трубку на шейкере в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию и скорости 250 об/мин. Добавьте 10 мл нейтрализующих средств для нейтрализации трипсина. Тщательно перемешать с серологическим пипеткой 10 мл.Центрифуга трубки при 2000G при 4 градусах по Цельсию в течение 10 минут. Отбросьте супернатант и повторно посовелайте гранулы в 1 мл среды культуры. Положите клетки в колбу T25 подходит для клеток андрогенов и добавить 4 мл дополнительной среды культуры.Культура среды будет содержать 20%L929 супернатант и 1%streptomycin. Рекомендуется добавлять супернатант L929 отдельно в колбы вместо добавления в среду фондовой культуры. Мы закончили с колбой, чтобы однородно распоряжаться ткани.Избегайте привлечения средств массовой информации на шею колбы во время встряхивания, как это может увеличить шансы на загрязнение. Инкубировать колбу при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2 в течение 48 часов. Соберите средства массовой информации из колбы культуры T25, подготовленной в день 0 в центрифуге труб.Центрифуга собранных средств массовой информации на 1, 466G при 4 градусах по Цельсию в течение 4 минут. В то время как собранные средства массовой информации в настоящее время центрифугированы, мыть день 0 колбу один раз с 1X PBS. Встряхните колбу осторожно, чтобы удалить любые остатки фрагментов ткани слева.Избегайте резких встряхивания колбы, как и любые остатки фрагментов не будет негативно влиять на культуру. Добавьте 5 мл свежих культурных медиа в колбу. Откажитесь от супернатанта из центрифугированных трубок.Добавьте 1 мл среды культуры в одну из трубок и тщательно перемешайте с пипеткой. Серийно добавляйте смешанные средства массовой информации с клетками в другие трубки и тщательно перемешивайте. Положите клетки в отдельную колбу T25, подходящую для клеток андрогенов.Добавьте 4 мл свежих культурных медиа в колбу. Инкубировать обе колбы при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2 в течение 48 часов. Откажитесь от мультимедиа как из колб, так и добавьте свежие средства массовой информации культуры 5 мл.Инкубировать колбы при 37 градусах по Цельсию при 5%CO2 в течение 48 часов. На шестой день клетки будут готовы к дальнейшим экспериментам. На изображениях, представленных здесь.Первая панель секции А астроциты окрашены GFAP, зеленого цвета. Во второй панели, раздела микроглии пятно с RCA, зеленый цвет. В разделе B микроглии окрашены RCA, который зеленого цвета, и астроциты окрашены в GFAP, красный цвет.Наложение изображений показывает микроглии и астроцитов вместе. Из изображений ясно, что большинство клеток в культуре подготовлены микроглии. Изображения были количественно ослепленный контроль и результат представлен в разделе C.Результаты показали, что около 80% клеток в культуре подготовлены клетки микроглии.Этот метод может быть выполнен примерно за полтора часа. После этой процедуры должно быть хорошее понимание того, как я могу выбрать грунтовки микроглии из взрослых тканей человеческого мозга, которые могут быть дополнительно использованы для вниз по течению экспериментов.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

Сочетание компьютерных игр основе поведенческих экспериментов с высокой плотностью ЭЭГ и инфракрасного слежения Gaze

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Быстрое подход к высоким разрешением флуоресценции в Semi-ломтики толщиной мозга

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Прародитель полученные из олигодендроцитов системе культуры человека от мозга плода

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Волоконно-оптические имплантации для хронической стимуляции Optogenetic ткани головного мозга

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-перепрограммирование перицитов клеток, полученных из взрослых мозга человека в индуцированные нейронов

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Простая генерация высокой урожайности культуры искусственных нейронов из фибробластов кожи взрослого человека

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Изоляция мозгового капилляров из ткани свежий человеческого мозга

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Изоляция и извлечение RNA нейронов, макрофаги и микроглии от личинок данио рерио мозги

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Краткосрочные свободно плавающие культуры фрагмента от взрослого человеческого мозга

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Кохлеарная поверхность Подготовка в взрослой мыши

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...