Name: obtaining human microglia from adult human brain tissue
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue at JoVE.com

El laboratorio de SJ se estableció con subvenciones institucionales del IITJ y está financiado por subvenciones del Departamento de Biotecnología (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) y del Ministerio de Electrónica y Tecnología de la Información del Gobierno de la India (No 4(16)/2019-ITEA). Las secciones de tejido cerebral humano se obtuvieron del Instituto de Ciencias Médicas de All India (AIIMS) Jodhpur después de la autorización del comité de ética institucional. Agradecemos a Mayank Rathor, estudiante de B.Tech Student miembro de la Sociedad de Diseño y Artes IIT Jodhpur, por el apoyo a la videografía.

Todos los tejidos fueron adquiridos después de la autorización ética de los comités de ética del Instituto Indio de Tecnología Jodhpur y el Instituto de Ciencias Médicas de all India (AIIMS) Jodhpur.
1.Adquisición y procesamiento de tejidos (Día 0)
<ol><li>Recoger el tejido en un tubo de 50 ml que contenga 10 ml de líquido cefalorraquídeo artificial helado (aCSF) (2 mM CaCl2a 2H2O, 10 mM de glucosa, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO<...

<ol>
	<li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+-+more+than+just+brain+glue.">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li><li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+Beyond:+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function.">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li><li>Gordon, S., Pl&#252;ddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+heterogeneity+in+tissues:+phenotypic+diversity+and+functions.">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease:+A+microglial+conundrum.">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li><li>Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+phagocytic+clearance+in+Parkinson's+disease.">Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).</li><li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functions+of+Microglia+in+Ischemic+Stroke.">Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).</li><li>Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Central+Nervous+System+Inflammation+and+Multiple+Sclerosis+Pathology.">Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology.</a> Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).</li><li>Loane, D. J., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+TBI+brain:+The+good,+the+bad,+and+the+dysregulated.">Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated.</a> Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).</li><li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neuropathic+pain:+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential.">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).</li><li>Bellver-Landete, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+are+an+essential+component+of+the+neuroprotective+scar+that+forms+after+spinal+cord+injury.">Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury.</a> Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).</li><li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/Brain+Macrophages+as+Central+Drivers+of+Brain+Tumor+Pathobiology.">Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li><li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+side+of+microglia.">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Brain+Myeloid+Expression+Profiles+Reveal+Distinct+Microglial+Activation+States+and+Aspects+of+Alzheimer's+Disease+Not+Evident+in+Mouse+Models.">Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+Alzheimer's+disease-associated+genes+in+primary+human+microglia.">PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).</li><li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile.">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55 (4), 412-424 (2007).</li><li>Mizee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+microglia+from+the+human+post-mortem+brain:+effects+of+ante-+and+post-mortem+variables.">Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+enriched+primary+human+microglia+for+functional+studies.">Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies.</a> Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).</li><li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics.">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li><li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples.">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inflammasome+Sensor,+NLRP3,+Regulates+CNS+Inflammation+and+Demyelination+via+Caspase-1+and+Interleukin-18.">The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).</li><li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes.">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li><li>Plant, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphotoxin+beta+receptor+(Lt+betaR):+dual+roles+in+demyelination+and+remyelination+and+successful+therapeutic+intervention+using+Lt+betaR-Ig+protein.">Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model.">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination.">TNF&#945; promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li><li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+macrophage+production.">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).</li><li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant.">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li><li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells.">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li></ol>

Microglia asegurar la homeostasis en el cerebro normal y desempeñar un papel central en la fisiopatología de diversas enfermedades neurológicas4. Las microglia son fundamentales para el neurodesarrollo y la formación de sinapsis2. Los estudios microgliales han demostrado ser fundamentales para comprender el desarrollo y la progresión de diversas enfermedades neurológicas4. La microglia de roedores es el modelo predominante de elección para los...

El sistema nervioso central (SNC) está construido de una compleja red de neuronas y células gliales1. Entre las células gliales, la microglia funciona como las células inmunitarias innatas del SNC2,3. Microglia es responsable de mantener la homeostasis en el SNC sano4. Microglia también juega un papel importante en el neurodesarrollo, mediante la poda de sinapsis2. Las microglia son fundamentales para la fisiopatología de varias enfermedades neurológicas, incluyendo pero no limitado a; Enfermedad de Alzheimer5, Enfermedad de Parkinson6, accidente cerebrovascular7, esclerosis múltiple8, lesión cerebral traumática9, dolor neuropático10, lesión de la médula espinal11 y tumores cerebrales como gliomas12.
Los estudios relacionados con la homeostasis y las enfermedades del SNC utilizan microglia de roedores debido a una escasez de protocolos de aislamiento de microglia primaria humana rentables y eficientes en el tiempo13. La microglia de roedores se asemeja a la microglia humana primaria en la expresión de genes como iba-1, PU.1, DAP12 y receptor M-CSF y han sido eficaces en la comprensión de cerebros normales y enfermos13. Curiosamente, la expresión de varios genes inmunes relacionados como TLR4, MHC II, Siglec-11 y Siglec-3 varía entre la microglia humana y la microglia de roedores13. La expresión de varios genes también varía en la expresión temporal y en las enfermedades neurodegenerativas en ambas especies14,,15. Estas diferencias significativas hacen de la microglia humana un modelo esencial para estudiar la función de la microglia en la homeostasis y la enfermedad. La microglia humana primaria también puede ser una herramienta eficaz para el cribado preclínico de posibles candidatos a medicamentos16. Las razones antes mencionadas subrayan la creciente necesidad de protocolos rentables para el aislamiento de la microglia humana primaria.
Hemos desarrollado un protocolo para el aislamiento de la microglia humana primaria a partir del tejido cerebral humano adulto recogido como resultado de la ventana quirúrgica creada para resección de tumores u otras resecciones quirúrgicas. El método aquí es considerablemente diferente de los métodos existentes. Pudimos aislar y cultivar microglia después de un tiempo de tránsito de unos 75 minutos desde el sitio de recolección de tejidos hasta iniciar el protocolo de aislamiento en el laboratorio. Hemos utilizado el sobrenadante de células de fibroblastos L929 para promover el crecimiento de microglia aislada. Este método se centra específicamente en la cultura y el desarrollo de sólo la microglia primaria. El cultivo resultante preparado es de aproximadamente 80% microglia. Mientras que otros protocolos proporcionan un cultivo enriquecido de microglia por centrifugación de gradiente de densidad, citometría de flujo y cuentas magnéticas, el protocolo es una forma rápida, simple, robusta y rentable de cultivar microglia humana primaria17,18,19,20. La capacidad de utilizar el tejido cerebral adulto vivo extirpado quirúrgicamente en lugar de los tejidos cerebrales fijos de los cadáveres demuestra una ventaja adicional de este método en contraste con los procedimientos existentes18,,21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>A002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (4 &#176;C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>146532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>New Brunswik</td>
			<td>Galaxy 170 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium with glutamine</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>AL007S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM9955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flacon tube (50 ml)</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>50CD1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1</td>
			<td>Vector</td>
			<td>FL-1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>GA5</td>
			<td>3670S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswik Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC&#160;CCL-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar air flow</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monosodium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Mixture F-12 Ham Medium</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Al106S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td>237554805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>ML023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Labware</td>
			<td>LW-SP1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.2&#956;, 25 mm diameter)</td>
			<td>Axiva</td>
			<td>SFPV25R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture.</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TCG4-20X10NO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining human microglia from adult human brain tissue

Las microglia son células inmunitarias innatas residentes del sistema nervioso central (SNC). La microglia desempeña un papel fundamental durante el desarrollo, en el mantenimiento de la homeostasis y durante la infección o lesión. Varios grupos de investigación independientes han puesto de relieve el papel central que desempeñan las microglia en las enfermedades autoinmunes, los síndromes autoinflamatorios y los cánceres. La activación de la microglia en algunas enfermedades neurológicas puede participar directamente en procesos patógenos. La microglia primaria es una herramienta poderosa para entender las respuestas inmunitarias en el cerebro, las interacciones celulares y celulares y los fenotipos de microglia desregulados en la enfermedad. La microglia primaria imita las propiedades microgliaales in vivo mejor que las líneas celulares microgliaales inmortalizadas. La microglia adulta humana exhibe propiedades distintas en comparación con la microglia fetal y de roedores humanos. Este protocolo proporciona un método eficiente para el aislamiento de la microglia primaria del cerebro humano adulto. El estudio de estas microglias puede proporcionar información crítica sobre las interacciones entre células celulares entre la microglia y otras poblaciones celulares residentes en el SNC, incluidos los oligodendrocitos, las neuronas y los astrocitos. Además, la microglia de diferentes cerebros humanos puede ser cultivada para la caracterización de respuestas inmunitarias únicas para la medicina personalizada y una miríada de aplicaciones terapéuticas.

Mediante el uso del protocolo antes mencionado (Figura 1), pudimos aislar la microglia humana primaria de los tejidos cerebrales resecados quirúrgicamente en vivo. Las células cultivadas se tiñeron con Ricinus communis agglutinina-1 (RCA-1) lectina para microglia (verde) y con proteína ácida fibrillaria Glial (GFAP) para astrocitos (rojo) (Figura 2) como se describió anteriormente22,</s...

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue at JoVE.com

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Este protocolo es un método eficiente, rentable y robusto para aislar la microglia primaria del tejido cerebral humano vivo, adulto. La microglia humana primaria aislada puede servir como una herramienta para estudiar los procesos celulares en la homeostasis y la enfermedad.

Obtención de Microglia Humana del Tejido Cerebral Humano Adulto

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

El objetivo general del protocolo es aislar las células primarias de microglia de los tejidos cerebrales humanos adultos vivos. En nuestro caso, esto se recogió como ventana quirúrgica durante la cirugía. Esto se logra mediante la recolección inicial de los tejidos cerebrales en pbS frío hielo, el tejido se corta en cubos de 1 mm piezas pequeñas, y acabo de hacerlo con la ayuda de la trippsina EDTA.Después de esto, las células se cosechan por centrifugación y se vajilla en un matraz adecuado para el cultivo de células de andrógenos durante 48 horas. Las células se cosechan una vez más del matraz y se cultivan hasta su uso posterior. Las células primarias de microglia humana ahora se pueden caracterizar mediante el uso de inmunocitoquímica y utilizarse para experimentos adicionales.La principal ventaja de nuestro protocolo para aislar las células de microglia de los tejidos cerebrales humanos adultos es que proporciona eficazmente células de microglia humanas adultas primarias de una manera muy rentable. El protocolo es robusto y reduce la pérdida de células al reducir el número de pasos que se utilizan en los protocolos existentes. Recoger el tejido en un tubo Falcon de 50 ml que contenga 10 ml de aCSF helado.Limpie el tubo de recogida cuidadosamente con 70% de alcohol y transfiera a una cámara de flujo de aire laminar aséptica. Deseche el aCSF cuidadosamente y pese el tejido en el tubo Falcon. Calcular el peso aproximado del tejido deduciendo el peso del tubo Falcon vacío.Caliente fresco aCSF a 37 grados centígrados. Mantenga el tejido en aCSF caliente durante cinco minutos. Este paso es fundamental para evitar la muerte celular.Deseche aCSF cuidadosamente. Y lave el tejido una vez con 1X PBS calentado a 37 grados centígrados. Asegúrese de que toda la sangre se lave con lavados repetidos de PBS según sea necesario.Incubar el tejido en PBS caliente durante 5 minutos. Deseche la mitad del PBS cuidadosamente. Transfiera el tejido junto con el PBS restante a un plato de Petri esterilizado.Retire el PBS restante cuidadosamente con una pipeta de 1 ml. Esto evitará la pérdida de tejido. Dados que se emiten en al menos 1 mm cubo trozos pequeños utilizando un bisturí estéril.Añadir 2 ml de 0.25%trypsin EDTA a la placa Petri y lavar la placa a fondo con la ayuda de la pipeta. Transfiera el tejido cortado en cubos a un tubo Falcon de 50 ml que contenga 10 ml por gramo de tejido de 0,25% de trippsina EDTA. Mezclar pipeteando a través de una pipeta serológica de 10 ml.Incubar el tubo en una coctelera durante 30 minutos a 37 grados centígrados y la velocidad de 250 rpm. Añadir 10 ml de medio neutralizante para neutralizar la trippsina. Mezclar bien con una pipeta serológica de 10 ml.Centrifugar el tubo a 2000G a 4 grados centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet en 1 ml de medio de cultivo. Poner las células en un matraz T25 adecuado para células de andrógenos y añadir 4 ml de medio de cultivo adicional.Medio de cultivo contendrá 20%L929 sobrenadante y 1%estreptomicina. Se recomienda añadir L929 sobrenadante por separado en matraces en lugar de añadir al medio de cultivo de stock. Hemos terminado con el matraz para desechar homogéneamente el tejido.Evite llevar el soporte al cuello del matraz mientras agita, ya que esto puede aumentar las posibilidades de contaminación. Incubar el matraz a 37 grados centígrados con 5% de CO2 durante 48 horas. Recoger los medios del matraz de cultivo T25 preparado el día 0 en tubos centrífugos.Centrifugar los medios recogidos a 1.466G a 4 grados centígrados durante 4 minutos. Mientras se centrifuga el medio recogido, lave el matraz del día 0 una vez con 1X PBS. Agitar el matraz suavemente para eliminar los fragmentos de tejido remanente que queden.Evite el temblor brusca del matraz, ya que los fragmentos remanentes no afectarán negativamente al cultivo. Añadir 5 ml de medios de cultivo frescos al matraz. Deseche el sobrenadante de los tubos centrifugados.Añadir 1 ml de medio de cultivo a uno de los tubos y mezclar bien con pipeta. Agregue en serie los medios mixtos con las células a otros tubos y mezcle bien. Poner las células en un matraz T25 separado adecuado para células de andrógenos.Añadir 4 ml de medios de cultivo frescos al matraz. Incubar ambos matraces a 37 grados centígrados con 5% de CO2 durante 48 horas. Deseche el soporte de ambos matraces y añada medios de cultivo frescos de 5 ml.Incubar los matraces a 37 grados centígrados al 5% de CO2 durante 48 horas. En el sexto día, las células estarán listas para más experimentos. En las imágenes representadas aquí.Primer panel de la sección A astrocitos manchados con GFAP, de color verde. En el segundo panel, de la sección Una mancha de microglia con RCA, de color verde. En la sección B microglia teñida con RCA, que es de color verde, y los astrocitos se tiñen con GFAP, de color rojo.La superposición de las imágenes muestra microglia y astrocitos juntos. De las imágenes se desprende claramente que la mayoría de las células del cultivo preparados son microglia. Las imágenes fueron cuantificadas por control cegado y el resultado se representa en la sección C.Los resultados mostraron que alrededor del 80% de las células en el cultivo preparados son células de microglia.Esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora y media. Después de este procedimiento debe tener una buena comprensión de cómo selecciono la microglia de cebado de los tejidos cerebrales humanos adultos, que se puede utilizar más adelante para experimentos posteriores.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

La combinación de PC del juego basado en experimentos del comportamiento de alta densidad de seguimiento de mirada EEG e infrarrojo

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

Investigación

Neurociencias

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Un enfoque rápido para imágenes de fluorescencia de alta resolución en rodajas de cerebro semi-gruesa

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Progenitor derivado de sistema de cultivo de oligodendrocitos de cerebro fetal humano

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

La implantación de fibra óptica para la estimulación optogenético crónica en el tejido cerebral

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-reprogramación de células derivadas de pericitos del cerebro humano adulto en neuronas inducidas

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Derivación de las leptomeninges de explantes de culturas postmortem Humanos Los donantes de cerebro

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Sencilla generación de una cultura de alto rendimiento de las neuronas inducidas de fibroblastos de piel humana adulta

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Aislamiento de los capilares cerebrales del cerebro humano fresco tejido

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Aislamiento y extracción de ARN de las neuronas, macrófagos y Microglia de cerebros de larvas de pez cebra

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Cultivos de rebanadas flotantes a corto plazo del cerebro humano adulto

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...