Name: obtaining human microglia from adult human brain tissue
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue at JoVE.com

SJs laboratorium inrättades med institutionella bidrag från IITJ och finansieras genom bidrag från Institutionen för bioteknik (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) och Ministry of Electronics and Information Technology Government of India (No.4(16)/2019-ITEA). Den mänskliga hjärnvävnad avsnitten erhölls från All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur efter institutionella etik kommitté godkännande. Vi tackar Mayank Rathor, B.Tech Student medlem av Design och Konst Samhälle IIT Jodhpur, för videography stöd.

Alla vävnader förvärvades efter etiska godkännande från institutet etik kommittéer indiska Institute of Technology Jodhpur och Alla Indien Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.
1.Tissue förvärv och bearbetning (Dag 0)
<ol><li>Samla upp vävnaden i ett 50 mL-rör innehållande 10 mL iskall konstgjord cerebrospinalvätska (aCSF) (2 mM CaCl2∙2H2O, 10 mM glukos, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2...

<ol>
	<li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+-+more+than+just+brain+glue.">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li><li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+Beyond:+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function.">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li><li>Gordon, S., Pl&#252;ddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+heterogeneity+in+tissues:+phenotypic+diversity+and+functions.">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease:+A+microglial+conundrum.">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li><li>Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+phagocytic+clearance+in+Parkinson's+disease.">Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).</li><li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functions+of+Microglia+in+Ischemic+Stroke.">Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).</li><li>Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Central+Nervous+System+Inflammation+and+Multiple+Sclerosis+Pathology.">Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology.</a> Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).</li><li>Loane, D. J., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+TBI+brain:+The+good,+the+bad,+and+the+dysregulated.">Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated.</a> Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).</li><li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neuropathic+pain:+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential.">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).</li><li>Bellver-Landete, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+are+an+essential+component+of+the+neuroprotective+scar+that+forms+after+spinal+cord+injury.">Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury.</a> Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).</li><li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/Brain+Macrophages+as+Central+Drivers+of+Brain+Tumor+Pathobiology.">Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li><li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+side+of+microglia.">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Brain+Myeloid+Expression+Profiles+Reveal+Distinct+Microglial+Activation+States+and+Aspects+of+Alzheimer's+Disease+Not+Evident+in+Mouse+Models.">Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+Alzheimer's+disease-associated+genes+in+primary+human+microglia.">PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).</li><li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile.">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55 (4), 412-424 (2007).</li><li>Mizee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+microglia+from+the+human+post-mortem+brain:+effects+of+ante-+and+post-mortem+variables.">Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+enriched+primary+human+microglia+for+functional+studies.">Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies.</a> Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).</li><li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics.">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li><li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples.">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inflammasome+Sensor,+NLRP3,+Regulates+CNS+Inflammation+and+Demyelination+via+Caspase-1+and+Interleukin-18.">The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).</li><li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes.">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li><li>Plant, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphotoxin+beta+receptor+(Lt+betaR):+dual+roles+in+demyelination+and+remyelination+and+successful+therapeutic+intervention+using+Lt+betaR-Ig+protein.">Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model.">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination.">TNF&#945; promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li><li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+macrophage+production.">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).</li><li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant.">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li><li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells.">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li></ol>

Microglia säkerställa homeostas i den normala hjärnan och spela centrala roller i patofysiologi av olika neurologiska sjukdomar4. Microglia är centrala för neuroutveckling och bildande av synapser2. Mikroglialstudier har visat sig vara avgörande för att förstå utvecklingen och utvecklingen av olika neurologiska sjukdomar4. Gnagare microglia är den förhärskande modellen av val för primära mikroglialstudier, även om, gnagare microglia sk...

Det centrala nervsystemet (CNS) är konstruerad av ett komplext nätverk av nervceller och gliaceller1. Bland de gliaceller, microglia funktion som de medfödda immuncellerna i CNS2,3. Microglia ansvarar för att upprätthålla homeostas i den friska CNS4. Microglia spelar också en viktig roll i neuroutveckling, genom beskärning synapser2. Microglia är centrala för patofysiologi av flera neurologiska sjukdomar inklusive men inte begränsat till; Alzheimers sjukdom5, Parkinsons sjukdom6, stroke7, multipel skleros8, traumatisk hjärnskada9, neuropatisk smärta10, ryggmärgsskada11 och hjärntumörer som gliomas12.
Studier relaterade till CNS homeostas och sjukdomar utnyttja gnagare microglia på grund av en brist på kostnadseffektiva och tidseffektiva mänskliga primära microglia isolering protokoll13. Gnagare mikroglia likna primära mänskliga mikroglia i uttryck av gener som Iba-1, PU.1, DAP12 och M-CSF receptorn och har varit effektiva i att förstå normala samt sjuka hjärnan13. Intressant nog varierar uttrycket av flera immun relaterade gener såsom TLR4, MHC II, Siglec-11 och Siglec-3 mellan människa och gnagare microglia13. Uttrycket av flera gener varierar också i temporala uttryck och i neurodegenerativa sjukdomar hos bådaarterna 14,15. Dessa betydande skillnader gör mänskliga microglia en viktig modell för att studera microglia funktion i homeostas och sjukdom. Primär människa microglia kan också vara ett effektivt verktyg för preklinisk screening av potentiella läkemedelskandidater16. De ovan nämnda orsakerna understryker det växande behovet av kostnadseffektiva protokoll för isolering av primära mänskliga mikroglia.
Vi har utvecklat ett protokoll för isolering av primära mänskliga microglia från vuxna mänskliga hjärnvävnad som samlats in som ett resultat av kirurgiska fönster skapas för tumör samband eller andra kirurgiska samband. Metoden här skiljer sig avsevärt från befintliga metoder. Vi kunde isolera och odla mikroglia efter en transittid på ca 75 minuter från vävnadsinsamlingsplatsen för att starta isoleringsprotokollet i laboratoriet. Vi har använt supernatanten av L929 fibroblastceller för att främja tillväxten av isolerad mikroglia. Denna metod fokuserar specifikt på kulturen och utvecklingen av endast primära microglia. Den resulterande kulturen beredd är ca 80% mikroglia. Medan andra protokoll ger en berikad kultur av mikroglia genom densitet gradient centrifugering, flödescytometri och magnetiska pärlor, är protokollet en snabb, enkel, robust och kostnadseffektivt sätt att kultur primära mänskliga mikroglia17,18,19,20. Förmågan att utnyttja kirurgiskt bort levande vuxna hjärnvävnad i stället för fasta hjärnvävnader från kadaver visar en extra fördel av denna metod i motsats till befintliga förfaranden18,21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>A002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (4 &#176;C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>146532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>New Brunswik</td>
			<td>Galaxy 170 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium with glutamine</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>AL007S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM9955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flacon tube (50 ml)</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>50CD1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1</td>
			<td>Vector</td>
			<td>FL-1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>GA5</td>
			<td>3670S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswik Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC&#160;CCL-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar air flow</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monosodium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Mixture F-12 Ham Medium</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Al106S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td>237554805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>ML023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Labware</td>
			<td>LW-SP1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.2&#956;, 25 mm diameter)</td>
			<td>Axiva</td>
			<td>SFPV25R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture.</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TCG4-20X10NO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining human microglia from adult human brain tissue

Microglia är bosatta medfödda immunceller i centrala nervsystemet (CNS). Microglia spela en avgörande roll under utveckling, för att upprätthålla homeostas, och under infektion eller skada. Flera oberoende forskargrupper har belyst den centrala roll som mikroglia spelar i autoimmuna sjukdomar, autoinflammatory syndrom och cancer. Aktiveringen av mikroglia i vissa neurologiska sjukdomar kan direkt delta i patogena processer. Primär mikroglia är ett kraftfullt verktyg för att förstå immunsvaren i hjärnan, cell-cell interaktioner och dysregulated microglia fenotyper i sjukdom. Primär microglia härma in vivo mikroglial egenskaper bättre än förevigade mikroglial cellinjer. Mänskliga vuxna microglia uppvisar distinkta egenskaper jämfört med mänskliga fetala och gnagare microglia. Detta protokoll ger en effektiv metod för isolering av primär mikroglia från vuxna mänskliga hjärnan. Studera dessa microglia kan ge kritiska insikter i cell-cell interaktioner mellan microglia och andra bosatta cellulära populationer i CNS inklusive, oligodenadrocytes, nervceller och astrocyter. Dessutom kan mikroglia från olika mänskliga hjärnor odlas för karakterisering av unika immunsvar för personlig medicin och en myriad av terapeutiska tillämpningar.

Genom att använda ovan nämnda protokollet (Figur 1), kunde vi isolera primära mänskliga microglia från levande kirurgiskt resected hjärnvävnader. Odlade celler var färgas med Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) lectin för microglia (grön) och med Glial fibrillary acidic protein (GFAP) för astrocyter (röd) (Figur 2) som tidigarebeskrivits 22,23,...

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue at JoVE.com

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Detta protokoll är en effektiv, kostnadseffektiv och robust metod för att isolera primär mikroglia från levande, vuxen, mänsklig hjärnvävnad. Isolerade primära mänskliga mikroglia kan fungera som ett verktyg för att studera cellulära processer i homeostas och sjukdom.

Erhålla mänskliga Microglia från Vuxna mänskliga hjärnvävnaden

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Det övergripande målet med protokollet är att isolera primära mikrogliaceller från levande vuxna mänskliga hjärnvävnader. I vårt fall samlades detta som kirurgiskt fönster under operation. Detta åstadkoms genom att initialt samla in hjärnvävnaderna i iskalla PBS, vävnaden tärnas sedan till 1 mm kub småbitar, och jag gjorde bara med hjälp av trypsin EDTA.Efter detta skördas cellerna genom centrifugering och pläteras i en kolv som lämpar sig för androgencellodling i 48 timmar. Celler skördas en gång till från kolven och odlas tills vidare används. Primära mänskliga mikroglia celler kan nu karakteriseras genom att använda immunocytokemi och användas för ytterligare experiment.Den största fördelen med vårt protokoll för att isolera mikrogliaceller från vuxna mänskliga hjärnvävnader är att det effektivt ger primära vuxna mänskliga mikrogliaceller på ett mycket kostnadseffektivt sätt. Protokollet är robust och det minskar förlusten av celler genom att minska antalet steg som används i befintliga protokoll. Samla upp vävnaden i ett 50-mL Falcon-rör som innehåller 10 mL iskallt aCSF.Torka uppsamlingsröret försiktigt med 70%alkohol och överför till en aseptisk laminär luftflödeskammare. Kassera aCSF försiktigt och väg vävnaden i Falcon-röret. Beräkna den ca vikten av vävnad genom att härleda vikten av tomma Falcon röret.Varm färsk aCSF till 37 grader celsius. Håll vävnaden i varmt aCSF i fem minuter. Detta steg är avgörande för att undvika celldöd.Kassera aCSF försiktigt. Och tvätta vävnad en gång med 1X PBS värms till 37 grader celsius. Se till att allt blod tvättas bort med upprepade PBS tvättar efter behov.Inkubera vävnaden i varmt PBS i 5 minuter. Kassera hälften av PBS försiktigt. Överför vävnad tillsammans med återstående PBS till en steriliserad Petriskål.Ta bort kvarvarande PBS försiktigt med 1-mL pipett. Detta kommer att förhindra förlust av vävnad. Tärningar som utfärdar i minst 1 mm kub små bitar med hjälp av en steril skalpell.Tillsätt 2 mL på 0,25%trypsin EDTA till Petri-skålen och tvätta plattan noggrant med hjälp av pipett. Överför den tärnade vävnaden till ett 50-mL Falcon-rör som innehåller 10 mL per gramvävnad på 0,25%trypsin EDTA. Blanda genom pipettering genom en 10-mL serologisk pipett.Inkubera röret på en skakmaskin i 30 minuter vid 37 graders celsius och hastigheten på 250 rpm. Lägg till 10 mL neutraliserande medium för att neutralisera trypsin. Blanda noggrant med en 10-mL serologisk pipett.Centrifugera röret vid 2000G vid 4 grader celsius i 10 minuter. Kassera supernatanten och resuspend pelleten i 1 mL av odlingsmedium. Lägg cellerna i en T25-kolv som lämpar sig för androgenceller och tillsätt 4 ml ytterligare odlingsmedium.Odlingsmedium kommer att innehålla 20%L929 supernatant och 1%streptomycin. Det rekommenderas att lägga till L929 supernatant separat i kolvar i stället för att lägga till lagerkulturmediet. Vi är färdiga med kolven för att homogent avyttra vävnaden.Undvik att föra media till kolvens hals medan du skakar eftersom detta kan öka risken för kontaminering. Inkubera kolven vid 37 grader celsius med 5%CO2 i 48 timmar. Samla in media från T25-odlingskolven som bereds dag 0 i centrifugrör.Centrifugera de insamlade medierna vid 1, 466G vid 4 grader celsius i 4 minuter. Medan det insamlade mediet centrifugeras, tvätta dag 0 kolven en gång med 1X PBS. Skaka kolven försiktigt för att avlägsna eventuella kvarleva vävnadsfragment som lämnas kvar.Undvik hårda skakningar av kolven eftersom eventuella restfragment inte kommer att påverka kulturen negativt. Tillsätt 5 mL färskt odlingsmedier i kolven. Kassera supernatanten från centrifugerade rör.Tillsätt 1 mL odlingsmedium till ett av rören och blanda ordentligt med pipett. Följetong lägga till det blandade mediet med celler i andra rör och blanda noggrant. Lägg cellerna i en separat T25-kolv som lämpar sig för androgenceller.Tillsätt 4 mL färskt odlingsmedier i kolven. Inkubera båda kolvarna vid 37 grader celsius med 5%CO2 i 48 timmar. Kassera media från båda kolvarna och tillsätt färskt 5 mL-odlingsmedier.Inkubera kolvarna vid 37 grader celsius vid 5%CO2 i 48 timmar. På sjätte dagen kommer cellerna att vara redo för ytterligare experiment. I bilderna representerade här.Första panelen av avsnittet A astrocyter färgas med GFAP, grön i färg. I den andra panelen, av avsnitt A microglia fläck med RCA, grön i färg. I avsnittet B microglia färgas med RCA, som är grön i färg, och astrocyter färgas med GFAP, röd i färg.Överlagring av bilderna visar mikroglia och astrocyter tillsammans. Det framgår av bilderna att majoriteten av cellerna i den kultur som utarbetats är mikroglia. Bilderna kvantifierades genom förblindad kontroll och resultatet är representerat i avsnitt C.Resultaten visade att cirka 80%av cellerna i den odlade kulturen är mikrogliaceller.Denna teknik kan utföras på ungefär en och en halv timme. Efter detta förfarande bör ha en god förståelse för hur väljer jag priming microglia från vuxna mänskliga hjärnvävnader, som kan användas ytterligare för nedströms experiment.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

Kombinera Datorspel-Based beteendevetenskap experiment med High-Density EEG och Infraröd Gaze spårning

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

En snabb metod för högupplöst fluorescens avbildning i semi-Tjock hjärnan skivor

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Progenitor-härledda oligodendrocyt Kultur System från human fetal hjärna

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Fiberoptisk Implantation för kronisk optogenetic Stimulering av hjärnvävnad

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering av Pericyte-härledda celler i den vuxna mänskliga hjärnan i inducerade Nervceller

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Enkla Generation av en hög avkastning kultur av inducerade nervceller från mänsklig vuxen hud fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolering av Cerebral kapillärerna från färska mänsklig hjärnvävnad

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolering och RNA-extraktion av nervceller, makrofager och mikroglia från Larval zebrafiskar hjärnor

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Kortsiktiga fritt flytande segment kulturer från den vuxna mänskliga hjärnan

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Cochlears ytbehandling i den vuxna musen

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...