Name: obtaining human microglia from adult human brain tissue
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue at JoVE.com

SJ'nin laboratuvarı IITJ'nin kurumsal hibeleri ile kurulmuş olup, Biyoteknoloji Bakanlığı (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) ve Hindistan Elektronik ve Bilgi Teknolojileri Bakanlığı (No.4(16)/2019-ITEA) tarafından finanse edilmektedir. İnsan beyin dokusu bölümleri Kurumsal Etik Komitesi izni sonra All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur elde edildi. Biz Mayank Rathor, Tasarım ve Sanat Derneği IIT Jodhpur B.Tech Öğrenci üyesi, videografi desteği için teşekkür ederiz.

Tüm dokular, Indian Institute of Technology Jodhpur ve All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur'un etik komitelerinden etik izin aldıktan sonra edinilmiştir.
1.Doku edinimi ve işlenmesi (Gün 0)
<ol><li>10 mL buz gibi suni beyin omurilik sıvısı (aCSF) (2 mM CaCl2,2H2O, 10 mM glikoz, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3,2,5 mM NaH2PO4,1 mM MgCl2°6H2O, 202 mM sucrose)içeren 50mL tüpt...

<ol>
	<li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+-+more+than+just+brain+glue.">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li><li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+Beyond:+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function.">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li><li>Gordon, S., Pl&#252;ddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+heterogeneity+in+tissues:+phenotypic+diversity+and+functions.">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease:+A+microglial+conundrum.">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li><li>Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+phagocytic+clearance+in+Parkinson's+disease.">Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).</li><li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functions+of+Microglia+in+Ischemic+Stroke.">Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).</li><li>Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Central+Nervous+System+Inflammation+and+Multiple+Sclerosis+Pathology.">Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology.</a> Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).</li><li>Loane, D. J., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+TBI+brain:+The+good,+the+bad,+and+the+dysregulated.">Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated.</a> Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).</li><li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neuropathic+pain:+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential.">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).</li><li>Bellver-Landete, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+are+an+essential+component+of+the+neuroprotective+scar+that+forms+after+spinal+cord+injury.">Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury.</a> Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).</li><li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/Brain+Macrophages+as+Central+Drivers+of+Brain+Tumor+Pathobiology.">Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li><li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+side+of+microglia.">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Brain+Myeloid+Expression+Profiles+Reveal+Distinct+Microglial+Activation+States+and+Aspects+of+Alzheimer's+Disease+Not+Evident+in+Mouse+Models.">Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+Alzheimer's+disease-associated+genes+in+primary+human+microglia.">PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).</li><li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile.">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55 (4), 412-424 (2007).</li><li>Mizee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+microglia+from+the+human+post-mortem+brain:+effects+of+ante-+and+post-mortem+variables.">Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).</li><li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+enriched+primary+human+microglia+for+functional+studies.">Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies.</a> Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).</li><li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics.">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li><li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples.">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inflammasome+Sensor,+NLRP3,+Regulates+CNS+Inflammation+and+Demyelination+via+Caspase-1+and+Interleukin-18.">The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).</li><li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes.">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li><li>Plant, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphotoxin+beta+receptor+(Lt+betaR):+dual+roles+in+demyelination+and+remyelination+and+successful+therapeutic+intervention+using+Lt+betaR-Ig+protein.">Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model.">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).</li><li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination.">TNF&#945; promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li><li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+macrophage+production.">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).</li><li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant.">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li><li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells.">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li></ol>

Mikroglia normal beyinde homeostaz sağlamak ve çeşitli nörolojik hastalıkların patofizyolojisi merkezi rol oynamak4. Mikroglia nörogelişim ve sinaps oluşumuiçinmerkezi 2 . Mikroglial çalışmalar, çeşitli nörolojik hastalıkların gelişimi ve ilerlemesini anlamada önemli bir değer kanıtlamıştır4. Kemirgen mikroglia birincil mikroglial çalışmalar için tercih yaygın modeli olsa bile, kemirgen microglia önemli yönleriyle biri...

Merkezi sinir sistemi (CNS) nöronlar ve glial hücrelerden oluşan karmaşık bir ağ inşa edilmiştir1. Glial hücreler arasında, CNS doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olarak mikroglia fonksiyonu2,3. Microglia sağlıklı CNS4homeostaz korumak için sorumludur. Mikroglia da nörogelişim önemli bir rol oynamaktadır, sinaps budama tarafından2. Mikroglia dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli nörolojik hastalıkların patofizyolojisi merkezidir; Alzheimer hastalığı5, Parkinson hastalığı6, inme7, multipl skleroz8, travmatik beyin hasarı9, nöropatik ağrı10, omurilik yaralanması11 ve gliomas gibi beyin tümörleri12.
CNS homeostaz ve hastalıklar ile ilgili çalışmalar maliyet etkin ve zaman etkin insan birincil mikroglia izolasyon protokolleri13bir eksikliği nedeniyle kemirgen microglia kullanır. Kemirgen mikroglia Iba-1, PU.1, DAP12 ve M-CSF reseptörü gibi genlerin ekspresyonunda birincil insan mikroglia benzer ve normal yanı sıra hastalıklı beyin13anlamada etkili olmuştur. İlginçtir, TLR4, MHC II, Siglec-11 ve Siglec-3 gibi birçok bağışıklık ilişkili genlerin ekspresyonu insan ve kemirgen microglia13arasında değişir. Çeşitli genlerin ekspresyonu da zamansal ekspresyon ve her iki türde nörodejeneratif hastalıklarda değişir14,15. Bu önemli farklılıklar insan mikroglia homeostaz ve hastalık mikroglia fonksiyonu çalışma için gerekli bir model olun. Birincil insan mikroglia da potansiyel ilaç adaylarının preklinik tarama için etkili bir araç olabilir16. Yukarıda belirtilen nedenler birincil insan mikroglia izolasyonu için maliyet etkin protokoller için artan ihtiyaç altını çizmektedir.
Tümör rezeksiyonları veya diğer cerrahi rezeksiyonlar için oluşturulan cerrahi pencere sonucunda toplanan erişkin insan beyin dokusundan birincil insan mikrogliasının izolasyonu için bir protokol geliştirdik. Buradaki yöntem mevcut yöntemlerden oldukça farklıdır. Doku toplama alanından laboratuvarda izolasyon protokolüne başlamak için yaklaşık 75 dakikalık bir geçiş süresinden sonra mikrogliayı izole etmeyi ve kültürü kültürü eleyebildik. Biz izole mikroglia büyümesini teşvik etmek için L929 fibroblast hücrelerinin supernatant kullandık. Bu yöntem özellikle sadece birincil mikroglia nın kültürü ve gelişimine odaklanır. Ortaya çıkan kültür yaklaşık% 80 microglia olduğunu. Diğer protokoller yoğunluk gradyan santrifüj, akış sitometri ve manyetik boncuklar tarafından mikroglia zenginleştirilmiş bir kültür sağlarken, protokol kültür birincil insan microglia17,18,,19,20hızlı, basit, sağlam ve maliyet etkin bir yoldur. Kadavralardan sabit beyin dokuları yerine cerrahi olarak çıkarılan canlı beyin dokusunu kullanabilme yeteneği mevcut prosedürlerin aksine bu yöntemin ek bir avantajını kanıtlıyor18,21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>A002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (4 &#176;C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>146532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>New Brunswik</td>
			<td>Galaxy 170 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium with glutamine</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>AL007S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM9955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flacon tube (50 ml)</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>50CD1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1</td>
			<td>Vector</td>
			<td>FL-1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>GA5</td>
			<td>3670S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswik Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC&#160;CCL-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar air flow</td>
			<td>Thermo Fsiher Scientific&#160;</td>
			<td>1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monosodium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Mixture F-12 Ham Medium</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Al106S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td>237554805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>ML023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Labware</td>
			<td>LW-SP1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.2&#956;, 25 mm diameter)</td>
			<td>Axiva</td>
			<td>SFPV25R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture.</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TCG4-20X10NO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining human microglia from adult human brain tissue

Mikroglia merkezi sinir sisteminin yerleşik doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir (CNS). Microglia gelişim sırasında kritik bir rol oynar, homeostaz bakımında, ve enfeksiyon veya yaralanma sırasında. Birçok bağımsız araştırma grupları otoimmün hastalıklarda, otoinflamatuar sendromlarda ve kanserlerde mikroglianın oynadığı merkezi rolü vurgulamıştır. Bazı nörolojik hastalıklarda mikroglia aktivasyonu doğrudan patojenik süreçlere katılabilir. Primer mikroglia beyinde bağışıklık yanıtları anlamak için güçlü bir araçtır, hücre-hücre etkileşimleri ve hastalıkta disregulated mikroglia fenotipler. Primer mikroglia in vivo mikroglial özelliklerini ölümsüzleştirilmiş mikroglial hücre hatlarını daha iyi taklit. İnsan yetişkin mikroglia insan fetal ve kemirgen mikroglia ile karşılaştırıldığında farklı özellikleri sergiler. Bu protokol yetişkin insan beyninden birincil mikroglia izolasyon için etkili bir yöntem sağlar. Bu mikroglia çalışma dahil olmak üzere Mikroglia ve CNS diğer yerleşik hücresel popülasyonlar arasındaki hücre hücre etkileşimleri içine kritik anlayışlar sağlayabilir, oligodendrocytes, nöronlar ve astrositler. Ayrıca, farklı insan beyninden mikroglia kişiselleştirilmiş tıp ve terapötik uygulamalar sayısız için benzersiz bağışıklık yanıtları karakterizasyonu için kültürlü olabilir.

Yukarıda bahsedilen protokolü kullanarak(Şekil 1),birincil insan mikrogliasını cerrahi olarak rezeke edilmiş canlı beyin dokularından izole etmeyi başardık. Kültürlü hücreler ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) mikroglia için lektin ile boyandı (yeşil) ve glial fibrillary asidik protein ile (GFAP) astrositler için (kırmızı) (Şekil 2) daha önce açıklandığı gibi22,...

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue at JoVE.com

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Bu protokol, canlı, yetişkin, insan beyin dokusundan birincil mikroglia izole etkili, uygun maliyetli ve sağlam bir yöntemdir. İzole birincil insan mikroglia homeostaz ve hastalık hücresel süreçleri incelemek için bir araç olarak hizmet verebilir.

Yetişkin İnsan Beyin Dokusundan İnsan Mikroglia elde

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Protokolün genel amacı canlı yetişkin insan beyin dokularından birincil mikroglia hücreleri izole etmektir. Bizim durumumuzda ameliyat sırasında cerrahi pencere olarak toplanmıştır. Bu başlangıçta buz soğuk PBS beyin dokuları toplayarak gerçekleştirilir, doku sonra 1-mm küp küçük parçalar halinde doğranmış, ve ben sadece trippsin EDTA yardımıyla yaptım.Bunu takiben, hücreler santrifüj ile hasat edilir ve 48 saat boyunca androjen hücre kültürüne uygun bir şişe ye kaplanır. Hücreler bir kez daha şişeden hasat edilir ve daha fazla kullanıma kadar kültürlenir. Birincil insan mikroglia hücreleri artık immünositokimya kullanılarak karakterize edilebilir ve daha fazla deney için kullanılabilir.Yetişkin insan beyin dokularından mikroglia hücrelerini izole etmek için protokolümüzün en büyük avantajı, birincil yetişkin insan mikroglia hücrelerini çok uygun maliyetli bir şekilde etkin bir şekilde sağlamasıdır. Protokol sağlamdır ve varolan protokollerde kullanılan adım sayısını azaltarak hücre kaybını azaltır. 10 mL buz gibi aCSF içeren 50 mL'lik falcon tüpünde dokuyu toplayın.Toplama tüpünü %70 alkolle dikkatlice silin ve aseptik laminar hava akış odasına aktarın. ACSF'yi dikkatlice atın ve Falcon tüpündeki dokuyu tartının. Boş Falcon tüpünün ağırlığını hesaplayarak dokunun yaklaşık ağırlığını hesaplayın.37 santigrat derece sıcak taze aCSF. Beş dakika boyunca sıcak aCSF doku tutun. Bu adım hücre ölümü önlemek için önemlidir.aCSF'yi dikkatlice atın. Ve 1X PBS ile bir kez doku yıkayın 37 santigrat dereceye ısıtılır. Tüm kanın gerektiğinde tekrarlanan PBS yıkıntıları ile yıkandığından emin olun.5 dakika sıcak PBS doku kuluçka. PBS'nin yarısını dikkatlice atın. Kalan PBS ile birlikte dokuyu sterilize edilmiş petri kabına aktarın.Kalan PBS'yi 1 mL pipetle dikkatlice çıkarın. Bu doku kaybını önleyecektir. Steril bir neşter kullanarak en az 1 mm küp küçük parçalar halinde bu sorunu zar.Petri kabına %0,25 tripsin EDTA'dan 2 mL ekleyin ve pipet yardımıyla tabağı iyice yıkayın. Doğranmış dokuyu gram başına 10 mL ve %0.25 tripsin EDTA içeren 50 mL'lik falcon tüpüne aktarın. 10 mL serolojik pipet ile pipetleme ile karıştırın.37 santigrat derece ve 250 rpm hızda 30 dakika boyunca bir shaker üzerinde tüp kuluçka. Tripsin nötralize etmek için 10 mL nötralize ortamı ekleyin. 10 mL serolojik pipet ile iyice karıştırın.Tüpü 2000G'de 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve kültür orta 1 mL pelet resuspend. Hücreleri androjen hücreleri için uygun bir T25 şişesine yerleştirin ve 4 mL ek kültür ortamı ekleyin.Kültür ortamı %20 L929 supernatant ve %1 streptomisin içerecektir. Bu stok kültür ortamına ekleyerek yerine şişelerde ayrı ayrı L929 supernatant eklenmesi önerilir. Dokuyu homojen bir şekilde atmak için şişeyi bitirdik.Bu kontaminasyon şansını artırabilir gibi sallayarak şişenin boynuna medya getirerek kaçının. Şişeyi 37 santigrat derecede %5 CO2 ile 48 saat kuluçkaya yatırın. T25 kültür şişesi santrifüj tüpler de gün 0 hazırlanan medya toplamak.Toplanan medyayı 1, 466G'de 4 derece santigrat derecede 4 dakika santrifüj edin. Toplanan ortam santrifüj edilirken, günü 1X PBS ile bir kez 0 şişeyı yıkayın. Sol herhangi bir kalıntı doku parçaları kaldırmak için yavaşça şişe çalkalayın.Herhangi bir kalıntı parçaları kültürü olumsuz etkilemez gibi şişe sert sallayarak kaçının. Şişeye 5 mL taze kültür ortamı ekleyin. Santrifüjlü tüplerden supernatant atın.Tüplerden birine 1 mL kültür ortamı ekleyin ve pipetle iyice karıştırın. Seri diğer tüplere hücreleri ile karışık ortam ekleyin ve iyice karıştırın. Hücreleri androjen hücreler için uygun ayrı bir T25 şişesine yatırın.Şişeye 4 mL taze kültür ortamı ekleyin. Her iki şişeyi de 37 santigrat derecede %5 CO2 ile 48 saat kuluçkaya yatırın. Ortamı her iki şişeden atın ve yeni 5 mL kültür ortamı ekleyin.Şişeleri 37 santigrat derecede %5 CO2'de 48 saat kuluçkaya yatırın. Altıncı gün, hücreler daha fazla deney için hazır olacak. Burada gösterilen görüntülerde.Bölümün ilk paneli A astrositleri GFAP ile boyanmış, yeşil renkli. İkinci panelde, rca ile bölüm A mikroglia leke, renkli yeşil. B mikroglia rca ile boyanmış bölümünde, hangi renk yeşil, ve astrositler GFAP ile boyanmış, renkli kırmızı.Görüntülerin yer kaplaması birlikte microglia ve astrositler gösterir. Resimlerden, kültürdeki hücrelerin çoğunun mikroglia olduğu açıktır. Görüntüler kör kontrol ile ölçüldü ve sonuç bölüm C.The sonuçlar hazırlanan kültür hücrelerinin yaklaşık% 80 mikroglia hücreleri olduğunu gösterdi temsil edilmektedir.Bu teknik yaklaşık bir buçuk saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben yetişkin insan beyin dokularından priming mikroglia nasıl seçebilirim iyi bir anlayışa sahip olmalıdır, hangi daha fazla downstream deneyler için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

Birleştiren Bilgisayar Oyun-Tabanlı Yüksek Yoğunlukta EEG ve Kızılötesi Gaze Takip Davranışsal deneyler

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

Nörobilim

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

İnsan Fetal Beyin gelen Progenitör-türetilmiş Oligodendrosit Kültür Sistemi

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Beyin Dokusu Kronik Optogenetic uyarılması için Fiber-optik İmplantasyon

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Kaynaklı Nöronlar içine Yetişkin İnsan Beyninin perisit türetilmiş Hücreler Lineage yeniden programlama

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

İnsan yetişkin cilt fibroblastlar indüklenen Neurons yüksek verimli kültürünün basit üretimi

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Yalıtım taze insan beyin dokusundan beyin kapiller

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Yetişkin İnsan Beyninden Kısa Süreli Serbest Kayan Dilim Kültürleri

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...