Name: in vivo intracellular recording of type-identified rat spinal motoneurons during trans-spinal direct current stimulation
Uploaded: 2020-05-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Science Center tilskud nr. Forfatterne vil gerne anerkende arbejdet i Hanna Drzymała-Celichowska og Włodzimierz Mrówczyński, der både bidrog til dataindsamling og analyse af resultaterne præsenteres i dette papir.

Alle procedurer i forbindelse med denne protokol er blevet accepteret af de relevante myndigheder (f.eks. den lokale etiske komité) og følger de nationale og internationale regler om dyrevelfærd og -forvaltning.
BEMÆRK: Hver deltager, der er involveret i proceduren, skal være ordentligt uddannet i grundlæggende kirurgiske procedurer og skal have en gyldig licens til at udføre dyreforsøg.
1. Anæstesi og præmedicinering
<ol><li>Bedøve en rotte med intrape...

<ol>
	<li>Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ergogenic+Effects+of+Transcranial+Direct+Current+Stimulation+on+Exercise+Performance.">The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance.</a> Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).</li><li>Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+induces+lasting+fatigue+resistance+and+enhances+explosive+vertical+jump+performance.">Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance.</a> PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).</li><li>Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+(tsDCS)+selectively+inhibits+the+synaptic+efficacy+of+nociceptive+transmission+at+spinal+cord+level.">Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level.</a> Neuroscience. 393, 150-163 (2018).</li><li>Parazzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+current+density+generated+by+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+(tsDCS).">Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS).</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).</li><li>Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+study+of+feasibility+and+effect+of+anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+on+chronic+neuropathic+pain+after+spinal+cord+injury.">Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury.</a> Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).</li><li>G&#243;mez-Soriano, J., Meg&#237;a-Garc&#237;a, A., Serrano-Mu&#241;oz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+spinal+direct+current+simulation+for+spasticity+therapy+following+spinal+cord+injury:+mechanistic+insights+contributing+to+long-term+treatment+effects.">Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects.</a> The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).</li><li>de Ara&#250;jo, A. V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+anodal+transcranial+direct+current+stimulation+to+improve+muscle+strength+and+motor+functionality+after+incomplete+spinal+cord+injury:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis.</a> Spinal Cord. , (2020).</li><li>de Paz, R. H., Serrano-Mu&#241;oz, D., P&#233;rez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avenda&#241;o-Coy, J., G&#243;mez-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+transcranial+direct-current+stimulation+with+gait+training+in+patients+with+neurological+disorders:+a+systematic+review.">Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review.</a> Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gamma+and+alpha+spinal+motor+neurons+activity+by+trans-spinal+direct+current+stimulation:+effects+on+reflexive+actions+and+locomotor+activity.">Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity.</a> Physiological Reports. 4 (3), (2016).</li><li>Bolzoni, F., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+and+postsynaptic+effects+of+local+cathodal+DC+polarization+within+the+spinal+cord+in+anaesthetized+animal+preparations.">Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations.</a> The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).</li><li>Cogiamanian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+Spinal+Direct+Current+Stimulation.">Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation.</a> Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-spinal+direct+current+stimulation+alters+muscle+tone+in+mice+with+and+without+spinal+cord+injury+with+spasticity.">Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).</li><li>Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+long-lasting+subcortical+facilitation+by+transcranial+direct+current+stimulation+in+the+cat.">Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat.</a> The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).</li><li>Manuel, M., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha,+beta+and+gamma+motoneurons:+functional+diversity+in+the+motor+system's+final+pathway.">Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway.</a> Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).</li><li>Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+unit+recruitment+order+during+voluntary+and+electrically+induced+contractions+in+the+tibialis+anterior.">Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior.</a> Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).</li><li>Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+behaviour+of+motor+units+in+the+tibialis+anterior+during+voluntary+contractions.">Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions.</a> Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).</li><li>Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+properties+of+motoneurons+innervating+different+muscle+unit+types+in+rat+gastrocnemius.">Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius.</a> Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-spinal+direct+current+stimulation+modifies+spinal+cord+excitability+through+synaptic+and+axonal+mechanisms.">Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms.</a> Physiological Reports. 2 (9), (2014).</li><li>Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics,+high-frequency+oscillations,+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons.">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li><li>Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., K&#246;nig, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+limits+of+cathodal+transcranial+direct+current+stimulation+in+rats.">Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).</li><li>B&#261;czyk, M., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+direct+current+are+reproduced+by+intermittent+depolarization+of+myelinated+nerve+fibers.">Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).</li><li>B&#261;czyk, M., Drzyma&#322;a-Celichowska, H., Mr&#243;wczy&#324;ski, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motoneuron+firing+properties+are+modified+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats.">Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> Journal of Applied Physiology. 126 (5), 1232-1241 (2019).</li><li>B&#261;czyk, M., Drzyma&#322;a-Celichowska, H., Mr&#243;wczy&#324;ski, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+modifications+of+motoneuron+firing+properties+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats.">Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> European Journal of Neuroscience. , (2019).</li><li>Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+the+ratio+of+injected+current+to+electrode+area+tell+us+about+current+density+in+the+brain+during+tDCS.">What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).</li><li>Rahman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+effects+of+acute+direct+current+stimulation:+somatic+and+synaptic+terminal+effects.">Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects.</a> The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).</li><li>Bikson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+uniform+extracellular+DC+electric+fields+on+excitability+in+rat+hippocampal+slices+in+vitro.">Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro.</a> The Journal of Physiology. 557, 175-190 (2004).</li><li>Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+control+of+motor+outputs+by+intrinsic+and+externally+induced+electric+field+potentials.">Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).</li><li>Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-current+relationships+of+rat+hindlimb+alpha-motoneurones.">Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones.</a> The Journal of Physiology. 573, 663-677 (2006).</li></ol>

Hvis den udføres korrekt, skal den kirurgiske del af den beskrevne protokol være afsluttet inden for ca. tre timer. Man bør være særlig forsigtig med at opretholde stabile fysiologiske forhold for et dyr under operationen, især kropstemperatur og dybde af anæstesi. Bortset fra indlysende etiske overvejelser, en mangel på ordentlig anæstesi kan resultere i overdreven lemmer bevægelser under nervedissektion eller laminectomy og føre til skader på præparatet eller en for tidlig eksperiment opsigelse. Ved lammel...

Trans-spinal jævnstrøm stimulation (tsDCS) vinder anerkendelse som en potent metode til at ændre spinal kredsløb ophidselse i sundhedogsygdom1,2,3. I denne teknik overføres der en konstant strøm mellem en aktiv elektrode placeret over udvalgte spinalsegmenter, med en referenceelektrode placeret enten ventralt eller mere rostrally4. Flere undersøgelser har allerede bekræftet, at tsDCS kan anvendes til at styre visse patologiske tilstande, såsom neuropatiskesmerter 5,spasticitet6, rygmarvsskade7 eller for at lette rehabilitering8. Forskere tyder på, at tsDCS fremkalder ændringer i ionfordelingen mellem det intracellulære og det ekstracellulære rum på tværs af cellemembranen, og dette kan enten lette eller hæmme neuronal aktivitet afhængigt af den aktuelle orientering9,10,11. Indtil for nylig manglede der imidlertid en direkte bekræftelse af denne indflydelse på motoneuroner.
Her beskriver vi en detaljeret protokol til at foretage in vivo intracellulær registrering af elektriske potentialer fra lumbal spinal motoneurons i bedøvet rotte med samtidig anvendelse af tsDCS, med henblik på at observere ændringer i motoneuron membran og fyring egenskaber som reaktion på anodal eller katodal polarisering af spinal neuronal netværk. Intracellulære optagelser åbner flere undersøgelsesområder af neuronegenskaber, som ikke er tilgængelige for tidligere anvendte ekstracellulæreteknikker 9,12. For eksempel er det muligt præcist at måle motoneuronmembranspændingsrespons på jævnstrømsstrøm forårsaget af tsDCS, for at angive spændingstærskel for spike-generering eller at analysere handlingspotentialeparametre. Desuden giver denne teknik os mulighed for at bestemme motoneuron passive membranegenskaber, såsom inputresistens, og observere forholdet mellem intracellulær stimulationsstrøm og hyppigheden af rytmisk affyring af motoneuroner. Antidromic identifikation af indspillet motoneuron, baseret på stimulering af funktionelt identificerede nerver (dvs. nerver giver efferents til flexors eller extensors) giver os mulighed for yderligere at identificere typer af innervated motorenheder (hurtig versus langsom), hvilket giver mulighed for at teste, om polarisering forskelligt påvirker de enkelte elementer i den modne spinal neuronal system. På grund af omfattende kirurgi forud for optagelsen og høje krav til stabilitet og pålidelighed af optagelser, denne teknik er meget udfordrende, men giver mulighed for direkte og langsigtet vurdering af elektrofysiologiske egenskaber af en motoneuron: før, under og efter anvendelse af tsDCS, som er afgørende for at bestemme både dens akutte handlinger og vedvarende virkninger13. Som en motoneuron direkte aktiverer ekstrafusal muskelfibre14 og deltager i feedback kontrol af en muskelsammentrækning og udviklet kraft15,16 enhver observeret indflydelse tsDCS på motorenheden eller muskel kontraktile egenskaber kan være knyttet til modulationer af motoneuron excitability eller fyring egenskaber.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Durgs and solutions</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropinum sulfuricum</td>
			<td>Polfa Warszawa</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>346351</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106329</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium Jelfa</td>
			<td>PharmaSwiss/Valeant</td>
			<td>-</td>
			<td>Neuromuscular blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Biowet Pu&#322;awy Sp. z o.o</td>
			<td>-</td>
			<td>Main anesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium citrate</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>6100-05-06</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraspan</td>
			<td>Braun</td>
			<td>-</td>
			<td>HES solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical equipment</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 Blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>10021-00</td>
			<td>Scalpel blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cauterizer</td>
			<td>FST</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chest Tubes</td>
			<td>Mila</td>
			<td>CT1215</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11241-30</td>
			<td>Muscle forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Dura forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5F Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11255-20</td>
			<td>Nerve forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Pia forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11008-13</td>
			<td>Blunt forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11053-10</td>
			<td>Skin forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>FST</td>
			<td>13013-14</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeur</td>
			<td>FST</td>
			<td>16021-14</td>
			<td>For laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>Vein scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15002-08</td>
			<td>Dura scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14184-09</td>
			<td>For trachea cut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>104075-11</td>
			<td>Muscle scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-13</td>
			<td>Skin scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracheal tube</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vein catheter</td>
			<td>Vygon</td>
			<td>1261.201</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel cannulation forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>18403-11</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18320-11</td>
			<td>For vein clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Dilating Probe</td>
			<td>FST</td>
			<td>10160-13</td>
			<td>For vein dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugrgical materials</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel foam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>GTIN 00300090315085</td>
			<td>Hemostatic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4.0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-40</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 6.0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-60</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axoclamp 2B</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor</td>
			<td>CWE</td>
			<td>11-10000</td>
			<td>Gas analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grass S-88</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Constant current stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>507222F</td>
			<td>Heating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-DAM8A</td>
			<td>WPI</td>
			<td>74020</td>
			<td>Extracellular amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdrive</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement IVM/Scientifica</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Microelectrode puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAR-830/AP Small Animal Ventilator</td>
			<td>CWE</td>
			<td>12-02100</td>
			<td>Respirator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support frame</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinal clamps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TP-1 DC stimulator</td>
			<td>WiNUE</td>
			<td>-</td>
			<td>tsDCS stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B150-4 glass capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150-4</td>
			<td>For microelectrodes production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible tubing</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For respirator and CO2 analyzer connection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td>For filling micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For nerve electrodes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo intracellular recording of type-identified rat spinal motoneurons during trans-spinal direct current stimulation

Intracellulær registrering af spinal motoneurons in vivo giver en "guldstandard" til bestemmelse af cellernes elektrofysiologiske egenskaber i det intakte spinalnetværk og har betydelige fordele i forhold til klassiske in vitro- eller ekstracellulære optagelsesteknikker. En fordel ved in vivo intracellulære optagelser er, at denne metode kan udføres på voksne dyr med et fuldt modent nervesystem, og derfor kan mange observerede fysiologiske mekanismer oversættes til praktiske anvendelser. I dette metodologiske papir beskriver vi denne procedure kombineret med eksternt anvendt konstant strømstimulation, som efterligner polariseringsprocesser, der forekommer inden for spinal neuronal netværk. Trans-spinal jævnstrøm stimulation (tsDCS) er en innovativ metode i stigende grad anvendes som en neuromodulatorisk intervention i rehabilitering efter forskellige neurologiske skader samt i sport. TsDCS' indflydelse på nervesystemet er fortsat dårligt forstået, og de fysiologiske mekanismer bag dets handlinger er stort set ukendte. Anvendelsen af tsDCS samtidig med intracellulære optagelser gør det muligt for os direkte at observere ændringer af motoneuronmembranegenskaber og karakteristika for rytmisk fyring som reaktion på polariseringen af spinalneuronenettet, hvilket er afgørende for forståelsen af tsDCS-handlinger. Desuden, når den præsenterede protokol omfatter identifikation af motoneuron med hensyn til en innervated muskel og dens funktion (flexor versus extensor) samt den fysiologiske type (hurtig versus langsom) det giver mulighed for selektivt at undersøge indflydelse tsDCS på identificerede komponenter af spinal kredsløb, som synes at være forskelligt påvirket af polarisering. Den præsenterede procedure fokuserer på kirurgisk forberedelse til intracellulære optagelser og stimulering med vægt på de trin, der er nødvendige for at opnå forberedelsestabilitet og reproducerbarhed af resultater. Detaljerne i metoden til anodal eller katodal tsDCS ansøgning drøftes, mens der lægges vægt på praktiske og sikkerhedsmæssige spørgsmål.

Parametre for virkningspotentialer og flere membranegenskaber kan beregnes på grundlag af intracellulære optagelser, når stabile forhold for celleindtrængning sikres. Figur 1A præsenterer et typisk ortoromisk virkningspotentiale fremkaldt ved intracellulær stimulation, som opfylder alle kriterier for datainflusion (hvilemembranpotentialet på mindst -50 mV og spike amplitude højere end 50 mV med en positiv overskridelse). Action potentielle parametre, såsom spike amplitude, efterhype...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation at JoVE.com

In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

Denne protokol beskriver in vivo intracellulær registrering af rotte lumbal motoneuroner med samtidig trans-spinal jævnstrøm stimulation. Metoden gør det muligt for os at måle membranegenskaber og registrere rytmisk affyring af motoneuroner før, under og efter anodal eller katodal polarisering af rygmarven.

I Vivo Intracellulær optagelse af type-identificeret Rotte Spinal Motoneurons under Trans-Spinal direkte strøm stimulation

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological ...

Denne protokol bruger intracellulære optagelser af spinal motoneurons, til direkte at undersøge indflydelsen af trans-spinal jævnstrøm stimulation på funktionen af spinal netværk. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for intracellulære optagelser, der skal udføres på fuldt modne nervesystem. Fremme af oversættelsen af forsøgsobservationer til praktiske anvendelser.Efter at have bekræftet en manglende reaktion på pedal refleks, en bedøvet seks måneder gamle mandlige Wistar rotte, bruge en dissekere mikroskop og en række 21 klinge, at gøre en langsgående hud snit fra brystbenet til hagen. Og brug stump dissektion til at afsløre den rigtige halspulsåre. Placer to, 4-0 ligaturer under den del af venen uden forgrening punkter.Og lav en løs knude på den proksimale ende af venesegmentet. Og en løs knude på den distale ende af segmentet. Klem venen proksimale til hjertet, og ligte den distale ende af venen.Brug iris saks til at foretage et snit mellem klemmen og den distale ligatur. Og holde en flap af venen, indføre en fyldt kateter til det punkt, hvor venen er blokeret af klemmen. Fjern derefter klemmen og skub kateteret flere millimeter ind i venen.For en trakeal rør placering, bruge stumpe kraftbefædre til at adskille de to mandibular kirtler, der dækker sternohyoid muskler. Og adskille sternohyoid muskler på midterlinjen, at afsløre luftrøret. Placer tre, 4-0 ligaturer under luftrøret, og lav to knob under luftrørets indføringspunkt og en knude ovenfor.Sæt derefter et trakealrør ind i luftrøret under den tredje trakeal brusk. Og fastgør røret med de forberedte ligaturer. At dissekere baglemleddet nerver, bruge en række 21 klinge til at gøre en langsgående snit på den bageste side af venstre bagben, fra akillessene til hoften.Og brug saks til at lave et snit mellem de forreste og bageste regioner i popliteal fossa, på bagsiden af knæleddet. Skær to hoveder af biceps femoris, at afsløre iskiasnerven. Og adskille det laterale hoved fra den mediale hoved af gastrocnemius musklen, at udsætte tibial nerve og dens grene.Brug derefter nummer 55 forræceser, til omhyggeligt dissekere den mediale gastrocnemius og laterale gastrocnemius og soleus nerver. Afbryde dem fra det omgivende væv og samtidig bevare deres forbindelse til de respektive muskler. For at udføre laminectomy, bruge en nummer 21 klinge til at foretage en langsgående snit fra korsbenet op til brysthvirvler.Og identificere Th13 ryghvirvel, som en laveste thorax segment med en rib indsættelse. Brug derefter fine rongeurs til at fjerne de spinøse processer og laminae fra Th13 til L2 ryghvirvler, at udsætte lændesegmenter af rygmarven. For at fastsætte rygsøjlen, placere rotten i en skræddersyet ramme på en 37 grader Celsius varmepude, forbundet til et lukket kredsløb varmesystem.Og brug huden flapper til at danne en dyb pool over den udsatte rygmarv. Placer metalklemmer under Th12 tværgående processer, og på L3 spinøse processer, og fyld puljen med 37 grader Celsius mineralsk olie. Brug huden flapper til at gøre en dyb pulje af mineralsk olie over den eksponerede tibial, mediale gastrocnemius og lateral gastrocnemius og soleus nerver.Og placere nerverne på bipolar sølv wire stimulere elektroder. Tilslut derefter elektroderne til en firkantet pulsstimulator ved hjælp af separate stimuleringskanaler for hver nerve. For en overflade elektrode placering, under dissekere mikroskop, placere en sølv kugle elektrode på venstre hale side af den eksponerede rygmarv.Med en referenceelektrode indsat i rygmusklerne. Og tilslut begge elektroder til differential-DC forstærkeren. Brug en konstant strøm stimulator til at stimulere den mediale gastrocnemius og laterale gastrocnemius og soleus nerver, med firkantede impulser af en 0,1 millisekund varighed gentages på en tre hertz frekvens og observere afferent salver.I slutningen af simuleringen skal du flytte overfladeelektroden rostrally, og gentag stimuleringen for at identificere de spinalsegmenter, hvor salvernes amplituder er de højeste for hver nerve. Efter bestemmelse af placeringen af den maksimale volley, levere en neuromuskulær blokker intravenøst at lamme rotten. Mens en assistent forbinder luftrøret til en ekstern ventilator i overensstemmelse med en gnaver kompatibel cap nominator.For at åbne dura og pia mater, skal du bruge nummer 55 kraftbesving til forsigtigt at løfte dura mater, og skære vævet caudally fra L5 segmentet, rostrally op til L4 segmentet. Brug derefter et par ultra tynde 5SF-forræcener, til at lave et lille plaster i pia, der dækker rygsøjlen mellem blodkarrene. Præcis på niveau med den maksimale afferent volley fra den mediale gastrocnemius og lateral gastrocnemius og soleus nerve.For at placere trans-spinal jævnstrøm stimulation elektroder, placere en saltvand gennemblødt svamp på rygsiden af Th12 ryghvirvler. Og brug fin manipulation til at trykke på svampen med en aktiv trans-spinal jævnstrøm stimulation elektrode. Derefter monteres en brugerdefineret poolet mikroelektrode på mikromanipulatoren, så en til to mikron stepping-bevægelse og stereoaxisk kalibrering kan monteres.Og køre en mikropipette spids ind i en udvalgt patch i pia, på en 15 til 20 graders mediale lateral vinkel. At registrere motoneuron membran og fyring egenskaber, i broen tilstand af den intracellulære forstærker, stimulere de respektive nervegrene til at identificere motoneuron på grundlag af alt eller intet udseende, af den antidromiske virkning potentiale. I den diskontinuerlige aktuelle klemme tilstand af intracellulære forstærker med en nuværende switch sats mode fire til otte kilohertz, bruge en 0,5 millisekund intracellulære depolarizing nuværende impulser, at fremkalde en ortodontisk handling potentiale, i motoneuron.For at beregne cellens input modstand, stimulere en motoneuron, med 40 korte 100 millisekund impulser af hyperpolarizing en nanogram strøm. For at bestemme den reelle basisværdi som den mindste amplitude af depolariseringsstrømen, der kræves for at fremkalde en enkelt spids, stimulere en motoneuron med 50 millisekund kvadratiske bølgeimpulser ved stigende amplituder. Derefter injicere 500 millisekund firkantede bølge impulser af depolarizing strøm, ved at øge amplituder.I 0,1 til to nano amp trin, at fremkalde rytmiske udledninger af motoneuroner. For en trans-spinal jævnstrøm stimulation, starte polarisering procedurer ved trans-spinal anvendelse af jævnstrøm, samtidig med at en stabil penetration af motoneuron. Her vises et typisk ortopædisk virkningspotentiale, fremkaldt af intracellulær stimulation, der opfylder alle kriterierne for dataindføjelse.I denne analyse, en celle respons på en 100 millisekund hyperpolarizing nuværende puls på et nanogram. Hvorfra både toppen og plateau input modstand af en motoneuron, kan bestemmes fra spændingen afbøjning, kan observeres. Denne udvidede spænding spor af en reel grundlæggende spike, udviser en klart markeret spænding tærskel af spike.Angivelse af niveauet af membranafpolarisering, hvor spænding gated natrium kanaler aktiveres for at indlede aktionspotentialet. Disse grafer giver eksempler på intracellulære spændingsspor. Fra to motoneuroner, stimuleret intracellularly med 500 millisekund firkantede pulser af depolarizing strøm.Før, under og efter en trans-spinal jævnstrøm stimulation ansøgning. Anodal trans-spinal jævnstrøm stimulation viste sig at handle mod en øget motoneuron ophidselse og højere frekvenser af rytmisk fyring. Mens cathodal trans-spinal jævnstrøm stimulation, handlet til mod fyring hæmning.Desuden, virkningerne af begge typer af trans-spinal jævnstrøm stimulation, overlevede perioden med polarisering. Unøjagtige data kan erhverves, hvis kriterierne for dataind integration er kompromitteret på grund af ufuldkommen celleindtrængning. Manglende kompensation for mikroelektrode modstand og kapacitans eller en rygmarv ustabilitet.Det er bydende nødvendigt, at der ikke sker skade på rygmarven under dissektionen, da skade kan resultere i spinal chok, hvilket gør yderligere optagelser umuligt. Det er muligt at høste vævsprøver til yderligere histologisk eller immuncyto kemisk analyse. For eksempel kan måling af c-fos udtryk bruges som en proxy for neuronal aktivitet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrode Positioning and Montage in Transcranial Direct Current Stimulation

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a technique that has been intensively investigated in the past decade as this method offers a ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Måling Spinal Præsynaptiske Hæmning i mus ved dorsale Potentiel optagelse<em&gt; In Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Direkte aktuelle Stimulation og Multi-elektrode Array Registrering af beslaglæggelse-lignende aktivitet i mus Brain Slice Forberedelse

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...

Remotely Supervised Transcranial Direct Current Stimulation: An Update on Safety and Tolerability

Fjernt overvåget transkranial direkte nuværende Stimulation: En opdatering på sikkerheden og tolerabiliteten

The remotely supervised tDCS (RS-tDCS) protocol enables participation from home through guided and monitored self-administration of tDCS treatment while ...

The Combined Use of Transcranial Direct Current Stimulation and Robotic Therapy for the Upper Limb

Den kombinerede brug af transkranial direkte nuværende Stimulation og robot terapi for overekstremiteterne

Neurologic disorders such as stroke and cerebral palsy are leading causes of long-term disability and can lead to severe incapacity and restriction of ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Transkranial jævnstrøm Stimulation (TDC'er) i mus

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Direkte indsprøjtning af en Lentiviral vektor fremhæver flere Motor veje i rygmarven rotte

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Stimulation Location Determination using a 3D Digitizer with High-Definition Transcranial Direct Current Stimulation

Stimulering placering bestemmelse ved hjælp af en 3D digitizer med high-definition Transcranial direkte strøm stimulering

The abundance of neuroimaging data and rapid development of machine learning has made it possible to investigate brain activation patterns. However, ...

Simultaneous Application of Transcranial Direct Current Stimulation during Virtual Reality Exposure

Samtidig anvendelse af transkranial jævnstrømstimulering under Virtual Reality-eksponering

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a form of non-invasive brain stimulation that changes the likelihood of neuronal firing through ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) for Memory Enhancement

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS for Memory Enhancement

Transkranial jævnstrømstimulering (tDCS) til hukommelsesforbedring

Memory enhancement is one of the great challenges in cognitive neuroscience and neurorehabilitation. Among various techniques used for memory enhancement, ...