Name: in vivo intracellular recording of type-identified rat spinal motoneurons during trans-spinal direct current stimulation
Uploaded: 2020-05-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Science Center subsidie Nr. 2017/25/B/NZ7/00373. De auteurs willen het werk erkennen van Hanna Drzymała-Celichowska en Włodzimierz Mrówczyński, die beide hebben bijgedragen aan het verzamelen van gegevens en de analyse van de resultaten die in dit document worden gepresenteerd.

Alle procedures die verband houden met dit protocol zijn aanvaard door de bevoegde autoriteiten (bijvoorbeeld de lokale ethische commissie) en volgen de nationale en internationale regels inzake dierenwelzijn en beheer.
LET OP: Elke deelnemer die betrokken is bij de procedure moet goed worden opgeleid in elementaire chirurgische ingrepen en moet beschikken over een geldige vergunning voor het uitvoeren van dierproeven.
1. Anesthesie en premedicatie
<ol><li>Verdove...

<ol>
	<li>Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ergogenic+Effects+of+Transcranial+Direct+Current+Stimulation+on+Exercise+Performance.">The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance.</a> Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).</li><li>Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+induces+lasting+fatigue+resistance+and+enhances+explosive+vertical+jump+performance.">Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance.</a> PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).</li><li>Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+(tsDCS)+selectively+inhibits+the+synaptic+efficacy+of+nociceptive+transmission+at+spinal+cord+level.">Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level.</a> Neuroscience. 393, 150-163 (2018).</li><li>Parazzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+current+density+generated+by+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+(tsDCS).">Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS).</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).</li><li>Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+study+of+feasibility+and+effect+of+anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+on+chronic+neuropathic+pain+after+spinal+cord+injury.">Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury.</a> Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).</li><li>G&#243;mez-Soriano, J., Meg&#237;a-Garc&#237;a, A., Serrano-Mu&#241;oz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+spinal+direct+current+simulation+for+spasticity+therapy+following+spinal+cord+injury:+mechanistic+insights+contributing+to+long-term+treatment+effects.">Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects.</a> The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).</li><li>de Ara&#250;jo, A. V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+anodal+transcranial+direct+current+stimulation+to+improve+muscle+strength+and+motor+functionality+after+incomplete+spinal+cord+injury:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis.</a> Spinal Cord. , (2020).</li><li>de Paz, R. H., Serrano-Mu&#241;oz, D., P&#233;rez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avenda&#241;o-Coy, J., G&#243;mez-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+transcranial+direct-current+stimulation+with+gait+training+in+patients+with+neurological+disorders:+a+systematic+review.">Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review.</a> Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gamma+and+alpha+spinal+motor+neurons+activity+by+trans-spinal+direct+current+stimulation:+effects+on+reflexive+actions+and+locomotor+activity.">Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity.</a> Physiological Reports. 4 (3), (2016).</li><li>Bolzoni, F., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+and+postsynaptic+effects+of+local+cathodal+DC+polarization+within+the+spinal+cord+in+anaesthetized+animal+preparations.">Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations.</a> The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).</li><li>Cogiamanian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+Spinal+Direct+Current+Stimulation.">Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation.</a> Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-spinal+direct+current+stimulation+alters+muscle+tone+in+mice+with+and+without+spinal+cord+injury+with+spasticity.">Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).</li><li>Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+long-lasting+subcortical+facilitation+by+transcranial+direct+current+stimulation+in+the+cat.">Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat.</a> The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).</li><li>Manuel, M., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha,+beta+and+gamma+motoneurons:+functional+diversity+in+the+motor+system's+final+pathway.">Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway.</a> Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).</li><li>Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+unit+recruitment+order+during+voluntary+and+electrically+induced+contractions+in+the+tibialis+anterior.">Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior.</a> Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).</li><li>Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+behaviour+of+motor+units+in+the+tibialis+anterior+during+voluntary+contractions.">Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions.</a> Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).</li><li>Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+properties+of+motoneurons+innervating+different+muscle+unit+types+in+rat+gastrocnemius.">Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius.</a> Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-spinal+direct+current+stimulation+modifies+spinal+cord+excitability+through+synaptic+and+axonal+mechanisms.">Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms.</a> Physiological Reports. 2 (9), (2014).</li><li>Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics,+high-frequency+oscillations,+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons.">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li><li>Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., K&#246;nig, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+limits+of+cathodal+transcranial+direct+current+stimulation+in+rats.">Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).</li><li>B&#261;czyk, M., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+direct+current+are+reproduced+by+intermittent+depolarization+of+myelinated+nerve+fibers.">Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).</li><li>B&#261;czyk, M., Drzyma&#322;a-Celichowska, H., Mr&#243;wczy&#324;ski, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motoneuron+firing+properties+are+modified+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats.">Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> Journal of Applied Physiology. 126 (5), 1232-1241 (2019).</li><li>B&#261;czyk, M., Drzyma&#322;a-Celichowska, H., Mr&#243;wczy&#324;ski, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+modifications+of+motoneuron+firing+properties+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats.">Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> European Journal of Neuroscience. , (2019).</li><li>Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+the+ratio+of+injected+current+to+electrode+area+tell+us+about+current+density+in+the+brain+during+tDCS.">What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).</li><li>Rahman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+effects+of+acute+direct+current+stimulation:+somatic+and+synaptic+terminal+effects.">Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects.</a> The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).</li><li>Bikson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+uniform+extracellular+DC+electric+fields+on+excitability+in+rat+hippocampal+slices+in+vitro.">Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro.</a> The Journal of Physiology. 557, 175-190 (2004).</li><li>Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+control+of+motor+outputs+by+intrinsic+and+externally+induced+electric+field+potentials.">Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).</li><li>Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-current+relationships+of+rat+hindlimb+alpha-motoneurones.">Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones.</a> The Journal of Physiology. 573, 663-677 (2006).</li></ol>

Indien correct uitgevoerd, moet het chirurgische deel van het beschreven protocol binnen ongeveer drie uur worden voltooid. Men moet bijzondere zorg in het handhaven van stabiele fysiologische omstandigheden van een dier tijdens de operatie, met name lichaamstemperatuur en diepte van anesthesie. Afgezien van duidelijke ethische overwegingen, een gebrek aan de juiste anesthesie kan leiden tot overmatige bewegingen van ledematen tijdens zenuwdissectie of laminectomie en leiden tot schade aan de voorbereiding of een voortij...

Trans-spinale directe stroomstimulatie (tsDCS) krijgt erkenning als een krachtige methode om spinale circuit excitability in gezondheid en ziekte1,2,3te wijzigen . In deze techniek wordt een constante stroom doorgegeven tussen een actieve elektrode boven geselecteerde spinale segmenten, met een referentieelektrode die ventrally of meer rostrally4bevindt. Verschillende studies hebben al bevestigd dat tsDCS kan worden gebruikt bij het beheer van bepaalde pathologische aandoeningen, zoals neuropathische pijn5,spasticiteit6,dwarslaesie7 of om revalidatie te vergemakkelijken8. Onderzoekers suggereren dat tsDCS veranderingen oproept in de ionenverdeling tussen de intracellulaire en de extracellulaire ruimte over het celmembraan, en dit kan de neuronale activiteit vergemakkelijken of remmen, afhankelijk van de huidige oriëntatie9,10,11. Tot voor kort ontbrak echter een directe bevestiging van deze invloed op motoneurons.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om in vivo intracellulaire registratie van elektrische potentialen van lumbale spinale motoneurons in de verdoofde rat uit te voeren met gelijktijdige toepassing van tsDCS, om veranderingen in motoneuronmembraan en afvurende eigenschappen in reactie op anodale of kathodale polarisatie van het spinale neuronale netwerk waar te nemen. Intracellulaire opnamen openen verschillende onderzoeksgebieden van neuroneigenschappen, niet beschikbaar voor eerder gebruikte extracellulaire technieken9,12. Het is bijvoorbeeld mogelijk om de reactie van motoneuronmembraanspanning op gelijkstroomstroom veroorzaakt door tsDCS nauwkeurig te meten, om de spanningsdrempel voor piekgeneratie aan te geven of om actiepotentieelparameters te analyseren. Bovendien stelt deze techniek ons in staat om de passieve membraaneigenschappen van motoneuron te bepalen, zoals invoerweerstand, en om de relatie tussen intracellulaire stimulatiestroom en frequentie van ritmisch afvuren van motoneurons te observeren. Antidromische identificatie van geregistreerde motoneuron, gebaseerd op de stimulatie van functioneel geïdentificeerde zenuwen (d.w.z. zenuwen die efferents leveren aan flexoren of extensoren) stelt ons in staat om bovendien soorten innervated motoreenheden te identificeren (snel versus langzaam), wat een kans geeft om te testen of polarisatie op verschillende manieren individuele elementen van het volwassen spinale neuronale systeem beïnvloedt. Vanwege een uitgebreide operatie voorafgaand aan de opname en hoge eisen aan stabiliteit en betrouwbaarheid van opnames, is deze techniek zeer uitdagend, maar maakt een directe en langdurige beoordeling van elektrofysiologische kenmerken van één motoneuron mogelijk: voor, tijdens en na toepassing van tsDCS, wat cruciaal is om zowel de acute acties als de aanhoudende effecten te bepalen13. Als een motoneuron activeert direct extrafusale spiervezels14 en neemt deel aan feedback controle van een spiercontractie en ontwikkelde kracht15,16 elke waargenomen invloed van tsDCS op de motorische eenheid of spier contractiele eigenschappen kunnen worden gekoppeld aan modulaties van motoneuron excitability of vuren kenmerken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Durgs and solutions</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropinum sulfuricum</td>
			<td>Polfa Warszawa</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>346351</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106329</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium Jelfa</td>
			<td>PharmaSwiss/Valeant</td>
			<td>-</td>
			<td>Neuromuscular blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Biowet Pu&#322;awy Sp. z o.o</td>
			<td>-</td>
			<td>Main anesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium citrate</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>6100-05-06</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraspan</td>
			<td>Braun</td>
			<td>-</td>
			<td>HES solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical equipment</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 Blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>10021-00</td>
			<td>Scalpel blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cauterizer</td>
			<td>FST</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chest Tubes</td>
			<td>Mila</td>
			<td>CT1215</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11241-30</td>
			<td>Muscle forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Dura forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5F Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11255-20</td>
			<td>Nerve forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Pia forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11008-13</td>
			<td>Blunt forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11053-10</td>
			<td>Skin forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>FST</td>
			<td>13013-14</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeur</td>
			<td>FST</td>
			<td>16021-14</td>
			<td>For laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>Vein scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15002-08</td>
			<td>Dura scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14184-09</td>
			<td>For trachea cut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>104075-11</td>
			<td>Muscle scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-13</td>
			<td>Skin scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracheal tube</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vein catheter</td>
			<td>Vygon</td>
			<td>1261.201</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel cannulation forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>18403-11</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18320-11</td>
			<td>For vein clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Dilating Probe</td>
			<td>FST</td>
			<td>10160-13</td>
			<td>For vein dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugrgical materials</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel foam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>GTIN 00300090315085</td>
			<td>Hemostatic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4.0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-40</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 6.0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-60</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axoclamp 2B</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor</td>
			<td>CWE</td>
			<td>11-10000</td>
			<td>Gas analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grass S-88</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Constant current stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>507222F</td>
			<td>Heating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-DAM8A</td>
			<td>WPI</td>
			<td>74020</td>
			<td>Extracellular amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdrive</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement IVM/Scientifica</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Microelectrode puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAR-830/AP Small Animal Ventilator</td>
			<td>CWE</td>
			<td>12-02100</td>
			<td>Respirator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support frame</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinal clamps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TP-1 DC stimulator</td>
			<td>WiNUE</td>
			<td>-</td>
			<td>tsDCS stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B150-4 glass capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150-4</td>
			<td>For microelectrodes production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible tubing</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For respirator and CO2 analyzer connection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td>For filling micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For nerve electrodes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo intracellular recording of type-identified rat spinal motoneurons during trans-spinal direct current stimulation

Intracellulaire opname van spinale motoneurons in vivo biedt een "gouden standaard" voor het bepalen van de elektrofysiologische kenmerken van de cellen in het intacte spinale netwerk en heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van klassieke in vitro of extracellulaire opnametechnieken. Een voordeel van in vivo intracellulaire opnames is dat deze methode kan worden uitgevoerd op volwassen dieren met een volledig volwassen zenuwstelsel, en daarom kunnen veel waargenomen fysiologische mechanismen worden vertaald naar praktische toepassingen. In dit methodologisch papier beschrijven we deze procedure in combinatie met extern toegepaste constante stroomstimulatie, die polarisatieprocessen in spinale neuronale netwerken nabootst. Trans-spinale directe stroomstimulatie (tsDCS) is een innovatieve methode die steeds vaker wordt gebruikt als een neuromodulatory interventie in revalidatie na verschillende neurologische verwondingen en in de sport. De invloed van tsDCS op het zenuwstelsel blijft slecht begrepen en de fysiologische mechanismen achter zijn acties zijn grotendeels onbekend. De toepassing van de tsDCS gelijktijdig met intracellulaire opnames stelt ons in staat om veranderingen van motoneuron membraaneigenschappen en kenmerken van ritmisch vuren direct waar te nemen in reactie op de polarisatie van het spinale neuronale netwerk, wat cruciaal is voor het begrijpen van tsDCS-acties. Bovendien, wanneer het gepresenteerde protocol de identificatie van de motoneuron met betrekking tot een innervated spier en zijn functie (flexor versus extensor) evenals het fysiologische type (snel versus langzaam) omvat, biedt het een kans om selectief de invloed van tsDCS op geïdentificeerde componenten van spinale circuits te onderzoeken, die anders lijken te worden beïnvloed door polarisatie. De gepresenteerde procedure richt zich op chirurgische voorbereiding voor intracellulaire opnames en stimulatie met de nadruk op de stappen die nodig zijn om voorbereidingsstabiliteit en reproduceerbaarheid van de resultaten te bereiken. De details van de methodologie van de anodale of kathodale tsDCS applicatie worden besproken met aandacht voor praktische en veiligheidskwesties.

Parameters van het werkingspotentieel en verschillende membraaneigenschappen kunnen worden berekend op basis van intracellulaire opnamen wanneer stabiele omstandigheden van celpenetratie zijn gewaarborgd. Figuur 1A presenteert een typisch orthodromisch werkingspotentieel dat wordt opgeroepen door intracellulaire stimulatie, die voldoet aan alle criteria voor gegevensopname (het rustmembraanpotentieel van ten minste -50 mV en spike amplitude hoger dan 50 mV, met een positieve overschrijding)....

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation at JoVE.com

In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

Dit protocol beschrijft in vivo intracellulaire opname van rat lumbale motoneurons met gelijktijdige trans-spinale directe stroom stimulatie. De methode stelt ons in staat om membraaneigenschappen te meten en ritmisch afvuren van motoneurons op te nemen voor, tijdens en na anodale of kathodale polarisatie van het ruggenmerg.

In Vivo intracellulaire opname van type-geïdentificeerde Rat Spinal Motoneurons tijdens trans-spinale directe stroomstimulatie

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological ...

Dit protocol maakt gebruik van intracellulaire opnames van spinale motoneurons, om direct de invloed van trans-spinale directe stroom stimulatie op de functie van spinale netwerken te onderzoeken. Het grote voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt intracellulaire opnames worden uitgevoerd op volledig volwassen zenuwstelsel. Het vergemakkelijken van de vertaling van de experimentele waarnemingen naar praktische toepassingen.Na bevestiging van een gebrek aan reactie op pedaalreflex, een verdoofde zes maanden oude mannelijke Wistar rat, gebruik maken van een ontleden microscoop en een nummer 21 mes, om een longitudinale huid incisie van het borstbeen naar de kin te maken. En gebruik stompe dissectie om de rechter halsader bloot te leggen. Plaats twee, 4-0 ligaturen onder het gedeelte van de ader zonder vertakkingspunten.En maak een losse knoop op het proximale uiteinde van het adersegment. En een losse knoop aan het distale einde van het segment. Klem de ader proximale naar het hart, en ligate het distale uiteinde van de ader.Gebruik een irisschaar om een incisie te maken tussen de klem en de distale ligatuur. En, met een flap van de ader, introduceren een voorgevulde katheter op het punt waar de ader wordt geblokkeerd door de klem. Verwijder vervolgens de klem en duw de katheter enkele millimeters in de ader.Voor een tracheale buis plaatsing, gebruik botte tangen om de twee mandibulaire klieren die de sternohyoid spieren te scheiden. En scheid de sternohyoid spieren op de middellijn, om de luchtpijp bloot te leggen. Plaats drie, 4-0 ligaturen onder de luchtpijp, en maak twee knopen onder de tracheale buis invoegpunt en een knoop boven.Steek vervolgens een tracheale buis in de luchtpijp onder het derde tracheale kraakbeen. En zet de buis op zijn plaats met de vooraf voorbereide ligaturen. Om de achterste ledematen zenuwen te ontleden, gebruik maken van een nummer 21 mes om een longitudinale snede te maken op de achterste kant van de linker achterste ledemaat, van de achillespees naar de heup.En gebruik een schaar om een snede te maken tussen de voorste en achterste gebieden van de popliteal fossa, aan de achterkant van het kniegewricht. Snijd twee hoofden van de biceps femoris, om de heupzenuw bloot te leggen. En scheid het zijhoofd van het mediale hoofd van de gastrocnemiusspier, om de scheenzenuw en zijn takken bloot te leggen.Gebruik dan nummer 55 tangen, om de mediale gastrocnemius en de laterale gastrocnemius en soleus zenuwen zorgvuldig te ontleden. Loskoppelen van de omliggende weefsels met behoud van hun verbinding met de respectieve van de spieren. Om de laminectomie uit te voeren, gebruikt u een nummer 21-mes om een longitudinale incisie te maken van het heiligbeen tot aan de borstwervels.En identificeer de Th13 wervel, als een laagste thoracale segment met een rib inbrengen. Gebruik vervolgens fijne rongeurs om de spineuze processen en laminae van de Th13 naar de L2-wervels te verwijderen, om de lendensegmenten van het ruggenmerg bloot te leggen. Om de wervelkolom vast te stellen, plaats de rat in een op maat gemaakt frame op een 37 graden Celsius verwarmingskussen, aangesloten op een gesloten lus verwarmingssysteem.En gebruik de huidflappen om een diep zwembad over het blootgestelde ruggenmerg te vormen. Plaats metalen klemmen onder de Th12 dwarsprocessen, en op de L3 spinous processen, en vul het zwembad met 37 graden Celsius minerale olie. Gebruik de huidflappen om een diepe poel van minerale olie te maken over de blootgestelde scheenbeen, mediale gastrocnemius en laterale gastrocnemius en soleus zenuwen.En plaats de zenuwen op bipolaire zilverdraad stimulerende elektroden. Sluit vervolgens de elektroden aan op een vierkante pulsstimulator met behulp van afzonderlijke stimulatiekanalen voor elke zenuw. Voor een oppervlakteelektrode plaatsing, onder de ontledende microscoop, plaats een zilveren bal elektrode aan de linkerkant caudal kant van het blootgestelde ruggenmerg.Met een referentieelektrode in de rugspieren. En sluit beide elektroden aan op de differentiële DC-versterker. Gebruik een constante stroomstimulator om de mediale gastrocnemius en laterale gastrocnemius en soleus zenuwen te stimuleren, met vierkante pulsen van een duur van 0,1 milliseconde herhaald op een frequentie van drie hertz en observeer de afferentevolley's.Aan het einde van de simulatie, beweeg het oppervlak elektrode rostrally, en herhaal de stimulatie om de spinale segmenten waarop de amplitudes van de volleys zijn de hoogste voor elke zenuw te identificeren. Na het bepalen van de locatie van de maximale volley, leveren een neuromusculaire blokker intraveneus om de rat te verlammen. Terwijl een assistent de tracheale buis verbindt met een externe ventilator in lijn met een knaagdier compatibele cap nominator.Om de dura en pia mater te openen, gebruik nummer 55 tangen om de dura mater voorzichtig op te tillen en het weefsel caudally uit het L5-segment te snijden, rostrally tot aan het L4-segment. Gebruik vervolgens een paar ultradunne 5SF tangen, om een kleine patch in de pia te maken, die de rugkolom tussen de bloedvaten bedekt. Precies op het niveau van de maximale afferente volley van de mediale gastrocnemius en laterale gastrocnemius en soleus zenuw.Om de trans spinale directe stroom stimulatie elektroden te plaatsen, plaats een zoutoplossing gedrenkt spons op de rugzijde van de Th12 wervels. En gebruik fijne manipulatie om de spons te drukken met een actieve trans-spinale directe stroom stimulatie elektrode. Monteer vervolgens een aangepaste gepoolde micro-elektroneder, op de micro manipulator, waardoor een één tot twee micron stepping beweging en stereotaxic kalibratie.En rijden een micropipette tip in een geselecteerde patch in de pia, op een 15 tot 20 graden mediale laterale hoek. Om de motoneuron membraan en afvuren eigenschappen vast te leggen, in de brug modus van de intracellulaire versterker, stimuleren de respectieve zenuwtakken om de motoneuron te identificeren op basis van de alles of niets verschijning, van de antidriemische actie potentieel. In de discontinu huidige klemmodus van de intracellulaire versterker met een huidige schakelmodus van vier tot acht kilohertz, gebruikt u een intracellulaire depolariserende huidige pulsen van 0,5 milliseconde om een orthodontisch actiepotentieel op te roepen in de motoneuron.Om de celinvoerweerstand te berekenen, stimuleert u een motoneuron, met 40 korte pulsen van 100 milliseconden die een nanogramstroom hyperpolariseren. Om de werkelijke basiswaarde te bepalen als de minimale amplitude van de depolariserende stroom die nodig is om een enkele piek uit te lokken, stimuleert u een motoneuron met 50 milliseconde vierkante golfpulsen bij toenemende amplitudes. Injecteer vervolgens 500 milliseconde vierkante golfpulsen van depolariserende stroom, bij toenemende amplitudes.In 0,1 tot twee nanoversterkerstappen, om ritmische ontladingen van motoneurons op te roepen. Voor een trans-spinale directe stroom stimulatie, start de polarisatie procedures door trans-spinale toepassing van gelijkstroom, met behoud van een stabiele penetratie van de motoneuron. Hier wordt een typisch orthotropisch actiepotentieel getoond, opgeroepen door intracellulaire stimulatie die voldoet aan alle criteria voor het opnemen van gegevens.In deze analyse, een celreactie op een 100 milliseconde hyperpolariserende stroompuls van een nanogram. Van waaruit zowel de piek- als plateauinvoerweerstand van een motoneuron kan worden bepaald aan de hand van de spanningsafbuiging. Deze uitgebreide spanning spoor van een echte basispiek, vertoont een duidelijk gemarkeerde spanningsdrempel van de piek.Het niveau van membraandepolarisatie aangeven waarbij spanningsgated natriumkanalen worden geactiveerd om het actiepotentieel te starten. Deze grafieken geven voorbeelden van intracellulaire spanningssporen. Van twee motoneurons, gestimuleerd intracellulair met 500 milliseconde vierkante pulsen van depolariserende stroom.Voor, tijdens en na een trans-spinale directe stroom stimulatie toepassing. Anodale trans-spinale directe stroom stimulatie bleek te werken in de richting van een verhoogde motoneuron excitability en hogere frequenties van ritmisch vuren. Terwijl kathode trans-spinale directe stroom stimulatie, gehandeld om in de richting van het afvuren remming.Bovendien, de effecten van beide soorten trans-spinale directe stroom stimulatie, overleefde de periode van polarisatie. Onnauwkeurige gegevens kunnen worden verkregen, als de criteria voor gegevensopname worden gecompromitteerd als gevolg van onvolmaakte celpenetratie. Het niet compenseren van de micro-elektrodenweerstand en capaciteit of een instabiliteit van het ruggenmerg.Het is absoluut noodzakelijk dat er geen schade wordt aangericht aan het ruggenmerg tijdens de dissectie, omdat letsel kan leiden tot een spinale shock, waardoor verdere opnames onmogelijk zijn. Het is mogelijk om weefselmonsters te oogsten voor verdere histologische of immunocyto chemische analyse. Bijvoorbeeld, de meting van c-fos expressie kan worden gebruikt als een proxy van neuronale activiteit.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrode Positioning and Montage in Transcranial Direct Current Stimulation

Elektrode positionering en Montage in Transcranial Direct Current Stimulatie

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a technique that has been intensively investigated in the past decade as this method offers a ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Meten Spinal Presynaptische Remming in muizen door dorsale wortel Potentiële Recording<em&gt; In Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Direct-current stimulatie en multi-elektrode Array Registratie van Inbeslagneming-achtige activiteit in de muizen Brain Slice Voorbereiding

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...

Remotely Supervised Transcranial Direct Current Stimulation: An Update on Safety and Tolerability

Op afstand gecontroleerde Transcranial Direct huidige stimulatie: Een Update voor de veiligheid en verdraagbaarheid

The remotely supervised tDCS (RS-tDCS) protocol enables participation from home through guided and monitored self-administration of tDCS treatment while ...

The Combined Use of Transcranial Direct Current Stimulation and Robotic Therapy for the Upper Limb

Het gecombineerd gebruik van de huidige Stimulatie Transcranial Direct en robotachtige therapie voor de bovenste extremiteit

Neurologic disorders such as stroke and cerebral palsy are leading causes of long-term disability and can lead to severe incapacity and restriction of ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Transcraniële gelijkstroom stimulatie (TDC's) in muizen

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Directe inspuiting van een lentivirale Vector hoogtepunten meerdere Motor trajecten in het ruggenmerg Rat

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Stimulation Location Determination using a 3D Digitizer with High-Definition Transcranial Direct Current Stimulation

Bepaling van de stimulatie locatie met behulp van een 3D-digitizer met high-definition Transcraniële directe stroom stimulatie

The abundance of neuroimaging data and rapid development of machine learning has made it possible to investigate brain activation patterns. However, ...

Simultaneous Application of Transcranial Direct Current Stimulation during Virtual Reality Exposure

Gelijktijdige toepassing van transcraniële gelijkstroomstimulatie tijdens blootstelling aan virtual reality

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a form of non-invasive brain stimulation that changes the likelihood of neuronal firing through ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) for Memory Enhancement

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS for Memory Enhancement

Transcraniële gelijkstroomstimulatie (tDCS) voor geheugenverbetering

Memory enhancement is one of the great challenges in cognitive neuroscience and neurorehabilitation. Among various techniques used for memory enhancement, ...