Name: in vivo intracellular recording of type-identified rat spinal motoneurons during trans-spinal direct current stimulation
Uploaded: 2020-05-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del National Science Center n. 2017/25/B/N/7/00373. Gli autori vorrebbero riconoscere il lavoro di Hanna Drzymaa-Celichowska e W'odzimierz Mr'cwczy'ski, che hanno entrambi contribuito alla raccolta e all'analisi dei risultati presentati in questo documento.

Tutte le procedure connesse al presente protocollo sono state accettate dalle autorità competenti (ad esempio, comitato etico locale) e seguono le norme nazionali e internazionali in materia di benessere e gestione degli animali.
NOTA: Ogni partecipante coinvolto nella procedura deve essere adeguatamente addestrato nelle procedure chirurgiche di base e deve avere una licenza valida per l'esecuzione di esperimenti sugli animali.
1. Anestesia e premedicazione
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<ol>
	<li>Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ergogenic+Effects+of+Transcranial+Direct+Current+Stimulation+on+Exercise+Performance.">The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance.</a> Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).</li><li>Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+induces+lasting+fatigue+resistance+and+enhances+explosive+vertical+jump+performance.">Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance.</a> PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).</li><li>Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+(tsDCS)+selectively+inhibits+the+synaptic+efficacy+of+nociceptive+transmission+at+spinal+cord+level.">Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level.</a> Neuroscience. 393, 150-163 (2018).</li><li>Parazzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+current+density+generated+by+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+(tsDCS).">Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS).</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).</li><li>Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+study+of+feasibility+and+effect+of+anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+on+chronic+neuropathic+pain+after+spinal+cord+injury.">Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury.</a> Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).</li><li>G&#243;mez-Soriano, J., Meg&#237;a-Garc&#237;a, A., Serrano-Mu&#241;oz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+spinal+direct+current+simulation+for+spasticity+therapy+following+spinal+cord+injury:+mechanistic+insights+contributing+to+long-term+treatment+effects.">Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects.</a> The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).</li><li>de Ara&#250;jo, A. V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+anodal+transcranial+direct+current+stimulation+to+improve+muscle+strength+and+motor+functionality+after+incomplete+spinal+cord+injury:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis.</a> Spinal Cord. , (2020).</li><li>de Paz, R. H., Serrano-Mu&#241;oz, D., P&#233;rez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avenda&#241;o-Coy, J., G&#243;mez-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+transcranial+direct-current+stimulation+with+gait+training+in+patients+with+neurological+disorders:+a+systematic+review.">Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review.</a> Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gamma+and+alpha+spinal+motor+neurons+activity+by+trans-spinal+direct+current+stimulation:+effects+on+reflexive+actions+and+locomotor+activity.">Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity.</a> Physiological Reports. 4 (3), (2016).</li><li>Bolzoni, F., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+and+postsynaptic+effects+of+local+cathodal+DC+polarization+within+the+spinal+cord+in+anaesthetized+animal+preparations.">Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations.</a> The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).</li><li>Cogiamanian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+Spinal+Direct+Current+Stimulation.">Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation.</a> Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-spinal+direct+current+stimulation+alters+muscle+tone+in+mice+with+and+without+spinal+cord+injury+with+spasticity.">Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).</li><li>Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+long-lasting+subcortical+facilitation+by+transcranial+direct+current+stimulation+in+the+cat.">Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat.</a> The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).</li><li>Manuel, M., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha,+beta+and+gamma+motoneurons:+functional+diversity+in+the+motor+system's+final+pathway.">Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway.</a> Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).</li><li>Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+unit+recruitment+order+during+voluntary+and+electrically+induced+contractions+in+the+tibialis+anterior.">Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior.</a> Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).</li><li>Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+behaviour+of+motor+units+in+the+tibialis+anterior+during+voluntary+contractions.">Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions.</a> Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).</li><li>Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+properties+of+motoneurons+innervating+different+muscle+unit+types+in+rat+gastrocnemius.">Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius.</a> Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-spinal+direct+current+stimulation+modifies+spinal+cord+excitability+through+synaptic+and+axonal+mechanisms.">Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms.</a> Physiological Reports. 2 (9), (2014).</li><li>Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics,+high-frequency+oscillations,+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons.">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li><li>Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., K&#246;nig, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+limits+of+cathodal+transcranial+direct+current+stimulation+in+rats.">Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).</li><li>B&#261;czyk, M., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+direct+current+are+reproduced+by+intermittent+depolarization+of+myelinated+nerve+fibers.">Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).</li><li>B&#261;czyk, M., Drzyma&#322;a-Celichowska, H., Mr&#243;wczy&#324;ski, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motoneuron+firing+properties+are+modified+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats.">Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> Journal of Applied Physiology. 126 (5), 1232-1241 (2019).</li><li>B&#261;czyk, M., Drzyma&#322;a-Celichowska, H., Mr&#243;wczy&#324;ski, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+modifications+of+motoneuron+firing+properties+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats.">Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> European Journal of Neuroscience. , (2019).</li><li>Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+the+ratio+of+injected+current+to+electrode+area+tell+us+about+current+density+in+the+brain+during+tDCS.">What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).</li><li>Rahman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+effects+of+acute+direct+current+stimulation:+somatic+and+synaptic+terminal+effects.">Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects.</a> The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).</li><li>Bikson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+uniform+extracellular+DC+electric+fields+on+excitability+in+rat+hippocampal+slices+in+vitro.">Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro.</a> The Journal of Physiology. 557, 175-190 (2004).</li><li>Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+control+of+motor+outputs+by+intrinsic+and+externally+induced+electric+field+potentials.">Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).</li><li>Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-current+relationships+of+rat+hindlimb+alpha-motoneurones.">Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones.</a> The Journal of Physiology. 573, 663-677 (2006).</li></ol>

Se eseguita correttamente, la parte chirurgica del protocollo descritto deve essere completata entro circa tre ore. Si dovrebbe fare particolare attenzione nel mantenere condizioni fisiologiche stabili di un animale durante l'intervento chirurgico, in particolare la temperatura corporea e la profondità dell'anestesia. A parte ovvie considerazioni etiche, la mancanza di un'anestesia adeguata può provocare eccessivi movimenti degli arti durante la dissezione nervosa o la laminectomia e portare a danni alla preparazione o...

La stimolazione a corrente diretta trans spinale (tsDCS) sta guadagnando riconoscimento come metodo potente per modificare l'eccitabilità del circuito spinale in salute emalattia 1,2,3. In questa tecnica, una corrente costante viene passata tra un elettrodo attivo situato sopra i segmenti spinali selezionati, con un elettrodo di riferimento situato sia ventralemente che più rostralmente4. Diversi studi hanno già confermato che il tsDCS può essere utilizzato nella gestione di determinate condizioni patologiche, come il doloreneuropatico 5, la spasticità6, la lesione del midollospinale 7 o per facilitare la riabilitazione8. I ricercatori suggeriscono che il tsDCS evoca alterazioni nella distribuzione degli ioni tra lo spazio intracellulare e lo spazio extracellulare attraverso la membrana cellulare, e questo può facilitare o inibire l'attività neuronale a secondadell'orientamento corrente 9,10,11. Tuttavia, fino a poco tempo fa, mancava una conferma diretta di questa influenza sui motoneuroni.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per condurre in vivo la registrazione intracellulare dei potenziali elettrici dai motoneuroni lombari spinali nel ratto anethetizzato con applicazione simultanea di tsDCS, al fine di osservare i cambiamenti nella membrana motoneurone e le proprietà di cottura in risposta alla polarizzazione anodale o cathodale della rete neuronale spinale. Le registrazioni intracellulari aprono diverse aree di indagine delle proprietà dei neuroni, non disponibili per le tecniche extracellulari utilizzate inprecedenza 9,12. Ad esempio, è possibile misurare con precisione la risposta di tensione della membrana del motoneurone al flusso di corrente diretta indotto da tsDCS, indicare la soglia di tensione per la generazione di picchi o analizzare i potenziali parametri di azione. Inoltre, questa tecnica ci permette di determinare le proprietà della membrana passiva del motoneurone, come la resistenza all'ingresso, e di osservare la relazione tra la corrente di stimolazione intracellulare e la frequenza di cottura ritmica dei motoneuroni. L'identificazione antidromica del motoneurone registrato, basata sulla stimolazione dei nervi identificati dal punto di vista funzionale (cioè i nervi che forniscono efferenti ai flessori o agli estensori) ci permette di identificare inoltre i tipi di unità motorie innervate (veloce o lento), il che offre l'opportunità di verificare se la polarizzazione influenza in modo diverso i singoli elementi del sistema neuronale spinale maturo. A causa di un'estesa chirurgia che precede la registrazione e di elevati requisiti di stabilità e affidabilità delle registrazioni, questa tecnica è altamente impegnativa ma consente una valutazione diretta e a lungo termine delle caratteristiche elettrofisiologiche di un motoneurone: prima, durante e dopo l'applicazione di tsDCS, che è fondamentale per determinare sia le sue azioni acute che gli effetti persistenti13. Come un motoneuron attiva direttamente le fibre muscolari extrafuso14 e prende parte al controllo di feedback di una contrazione muscolare e sviluppato forza15,16 qualsiasi influenza osservata di tsDCS sull'unità motoria o le proprietà contraili muscolari possono essere collegati a modulazioni di motoneurone eccitabilità o caratteristiche di cottura.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Durgs and solutions</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropinum sulfuricum</td>
			<td>Polfa Warszawa</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>346351</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106329</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium Jelfa</td>
			<td>PharmaSwiss/Valeant</td>
			<td>-</td>
			<td>Neuromuscular blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Biowet Pu&#322;awy Sp. z o.o</td>
			<td>-</td>
			<td>Main anesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium citrate</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>6100-05-06</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraspan</td>
			<td>Braun</td>
			<td>-</td>
			<td>HES solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical equipment</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 Blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>10021-00</td>
			<td>Scalpel blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cauterizer</td>
			<td>FST</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chest Tubes</td>
			<td>Mila</td>
			<td>CT1215</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11241-30</td>
			<td>Muscle forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Dura forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5F Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11255-20</td>
			<td>Nerve forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Pia forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11008-13</td>
			<td>Blunt forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11053-10</td>
			<td>Skin forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>FST</td>
			<td>13013-14</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeur</td>
			<td>FST</td>
			<td>16021-14</td>
			<td>For laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>Vein scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15002-08</td>
			<td>Dura scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14184-09</td>
			<td>For trachea cut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>104075-11</td>
			<td>Muscle scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-13</td>
			<td>Skin scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracheal tube</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vein catheter</td>
			<td>Vygon</td>
			<td>1261.201</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel cannulation forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>18403-11</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18320-11</td>
			<td>For vein clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Dilating Probe</td>
			<td>FST</td>
			<td>10160-13</td>
			<td>For vein dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugrgical materials</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel foam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>GTIN 00300090315085</td>
			<td>Hemostatic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4.0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-40</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 6.0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-60</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axoclamp 2B</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor</td>
			<td>CWE</td>
			<td>11-10000</td>
			<td>Gas analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grass S-88</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Constant current stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>507222F</td>
			<td>Heating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-DAM8A</td>
			<td>WPI</td>
			<td>74020</td>
			<td>Extracellular amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdrive</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement IVM/Scientifica</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Microelectrode puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAR-830/AP Small Animal Ventilator</td>
			<td>CWE</td>
			<td>12-02100</td>
			<td>Respirator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support frame</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinal clamps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TP-1 DC stimulator</td>
			<td>WiNUE</td>
			<td>-</td>
			<td>tsDCS stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B150-4 glass capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150-4</td>
			<td>For microelectrodes production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible tubing</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For respirator and CO2 analyzer connection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td>For filling micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For nerve electrodes</td>
		</tr>
	</tbody>
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in vivo intracellular recording of type-identified rat spinal motoneurons during trans-spinal direct current stimulation

La registrazione intracellulare dei motoneuroni spinali in vivo fornisce uno "standard d'oro" per determinare le caratteristiche elettrofisiologiche delle cellule nella rete spinale intatta e contiene vantaggi significativi rispetto alle tecniche classiche di registrazione in vitro o extracellulare. Un vantaggio delle registrazioni intracellulari in vivo è che questo metodo può essere eseguito su animali adulti con un sistema nervoso completamente maturo, e quindi molti meccanismi fisiologici osservati possono essere tradotti in applicazioni pratiche. In questo documento metodologico, descriviamo questa procedura combinata con la stimolazione a corrente costante applicata esternamente, che imita i processi di polarizzazione che si verificano all'interno delle reti neuronali spinali. La stimolazione trans-spinale a corrente diretta (tsDCS) è un metodo innovativo sempre più utilizzato come intervento neuromodulatore nella riabilitazione dopo varie lesioni neurologiche e nello sport. L'influenza di tsDCS sul sistema nervoso rimane poco compresa e i meccanismi fisiologici dietro le sue azioni sono in gran parte sconosciuti. L'applicazione del tsDCS contemporaneamente alle registrazioni intracellulari ci permette di osservare direttamente i cambiamenti delle proprietà della membrana del motoneurone e le caratteristiche della cottura ritmica in risposta alla polarizzazione della rete neuronale spinale, che è fondamentale per la comprensione delle azioni tsDCS. Inoltre, quando il protocollo presentato include l'identificazione del motoneurone rispetto a un muscolo innervato e la sua funzione (flessore contro estensore) così come il tipo fisiologico (veloce contro lento) offre l'opportunità di indagare selettivamente l'influenza del tsDCS sui componenti identificati dei circuiti spinali, che sembrano essere influenzati in modo diverso dalla polarizzazione. La procedura presentata si concentra sulla preparazione chirurgica per le registrazioni intracellulari e la stimolazione con un'enfasi sui passi necessari per ottenere la stabilità di preparazione e la riproducibilità dei risultati. I dettagli della metodologia dell'applicazione tsDCS anodale o catodale sono discussi prestando attenzione alle questioni pratiche e di sicurezza.

I parametri dei potenziali di azione e diverse proprietà della membrana possono essere calcolati sulla base di registrazioni intracellulari quando sono garantite condizioni stabili di penetrazione cellulare. La figura 1A presenta un tipico potenziale di azione ortodromica evocato dalla stimolazione intracellulare, che soddisfa tutti i criteri per l'inclusione dei dati (il potenziale di membrana a riposo di almeno -50 mV e un'ampiezza di picco superiore a 50 mV, con un superamento positivo)....

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In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

Questo protocollo descrive la registrazione intracellulare in vivo dei motoneuroni lombari con stimolazione simultanea della corrente diretta trans-spinale. Il metodo ci permette di misurare le proprietà della membrana e di registrare la cottura ritmica dei motoneuroni prima, durante e dopo la polarizzazione anodale o tadale del midollo spinale.

In Vivo Registrazione intracellulare di Motoneuroni Spinali Ratti Identificati dal Tipo durante la stimolazione a corrente diretta trans-spinale

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological ...

Questo protocollo utilizza registrazioni intracellulari di motoneuroni spinali, per indagare direttamente l'influenza della stimolazione della corrente continua trans-spinale sulla funzione delle reti spinali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di eseguire registrazioni intracellulari su un sistema nervoso completamente maturo. Facilitare la traduzione delle osservazioni sperimentali in applicazioni pratiche.Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale, un ratto Wistar maschio anestetizzato di sei mesi, usa un microscopio sezionante e una lama numero 21, per fare un'incisione longitudinale della pelle dallo sterno al mento. E usa la dissezione smussata per esporre la vena giugulare destra. Posizionare due legature 4-0 sotto la sezione della vena senza punti ramificati.E fare un nodo sciolto sull'estremità prossimale del segmento delle vene. E un nodo sciolto sull'estremità distale del segmento. Fissare la vena prossimale al cuore e ligarare l'estremità distale della vena.Utilizzare le forbici dell'iride per fare un'incisione tra il morsetto e la legatura distale. E, tenendo un lembo della vena, introdurre un catetere pre-riempito nel punto in cui la vena è bloccata dal morsetto. Quindi rimuovere il morsetto e spingere il catetere di diversi millimetri nella vena.Per un posizionamento del tubo tracheale, utilizzare forcep smussate per separare le due ghiandole mandibolari che coprono i muscoli sternoioidi. E separare i muscoli sternoioidi alla linea mediana, per esporre la trachea. Posizionare tre legature 4-0 sotto la trachea e fare due nodi sotto il punto di inserimento del tubo tracheale e un nodo sopra.Quindi inserire un tubo tracheale nella trachea sotto la terza cartilagine tracheale. E fissare il tubo in posizione con le legature pre-preparate. Per sezionare i nervi degli arti posteriori, utilizzare una lama numero 21 per fare un taglio longitudinale sul lato posteriore dell'arto posteriore sinistro, dal tendine d'Achille all'anca.E usa le forbici per fare un taglio tra le regioni anteriore e posteriore della fossa poplitea, nella parte posteriore dell'articolazione del ginocchio. Tagliare due teste del bicipite femoris, per esporre il nervo sciatico. E separare la testa laterale dalla testa mediale del muscolo gastrocnemio, per esporre il nervo tibiale e i suoi rami.Quindi utilizzare le forcep numero 55, per sezionare attentamente il gastrocnemio mediale e i nervi gastrocnemio laterale e soleo. Disconnettendoli dai tessuti circostanti mantenendo la loro connessione con i rispettivi muscoli. Per eseguire la laminectomia, utilizzare una lama numero 21 per fare un'incisione longitudinale dall'osso sacro fino alle vertebre toraciche.E identificare la vertebra Th13, come un segmento toracico più basso con un inserimento toracico. Quindi utilizzare rongeurs fini per rimuovere i processi spinosi e le laminae dal Th13 alle vertebre L2, per esporre i segmenti lombari del midollo spinale. Per fissare la colonna vertebrale, posizionare il topo in un telaio su misura su una pastiglia riscaldante a 37 gradi Celsius, collegata a un sistema di riscaldamento a circuito chiuso.E usare i lembi della pelle per formare una piscina profonda sul midollo spinale esposto. Posizionare i morsetti metallici al di sotto dei processi trasversali Th12 e ai processi spinosi L3 e riempire la piscina con olio minerale di 37 gradi Celsius. Utilizzare i lembi della pelle per creare una profonda pozza di olio minerale sui nervi tibiali, mediali e gastrocnemio laterale e soleus esposti.E posizionare i nervi sugli elettrodi stimolanti bipolari del filo d'argento. Quindi collegare gli elettrodi a uno stimolatore a impulsi quadrati utilizzando canali di stimolazione separati per ogni nervo. Per il posizionamento di un elettrodo di superficie, al microscopio sezionato, posizionare un elettrodo a sfera d'argento sul lato caudale sinistro del midollo spinale esposto.Con un elettrodo di riferimento inserito nei muscoli della schiena. E collegare entrambi gli elettrodi all'amplificatore CC differenziale. Usa uno stimolatore di corrente costante per stimolare il gastrocnemio mediale e i nervi gastrocnemio laterale e soleo, con impulsi quadrati della durata di 0,1 millisecondi ripetuti con una frequenza di tre hertz e osservare le raffiche afferenti.Alla fine della simulazione, spostare l'elettrodo di superficie rostralmente e ripetere la stimolazione per identificare i segmenti spinali in cui le ampiezze delle raffiche sono le più alte per ogni nervo. Dopo aver determinato la posizione della massima raffica, fornire un bloccante neuromuscolare per via endovenosa per paralizzare il topo. Mentre un assistente collega il tubo tracheale a un ventilatore esterno in linea con un cap nominatore compatibile con i roditori.Per aprire la dura e la pia mater, utilizzare le forcelle numero 55 per sollevare delicatamente la dura mater e tagliare il tessuto caudally dal segmento L5, rostralmente fino al segmento L4. Quindi usa un paio di forcep 5SF ultra sottili, per fare un piccolo cerotto nella pia, coprendo la colonna dorsale tra i vasi sanguigni. Esattamente al livello della massima raffica afferente dal gastrocnomio mediale e dal gastrocnomio laterale e dal nervo soleo.Per posizionare gli elettrodi di stimolazione a corrente continua trans-spinale, posizionare una spugna salina imbevuta sul lato dorsale delle vertebre Th12. E utilizzare una manipolazione fine per premere la spugna con un elettrodo di stimolazione a corrente continua trans-spinale attivo. Quindi montare un microelettrodo in pool personalizzato, sul micro manipolatore, consentendo un movimento di passo da uno a due micron e calibrazione stereotassica.E guidare una punta di micropipetta in un cerotto selezionato nella pia, con un angolo laterale mediale da 15 a 20 gradi. Per registrare la membrana motoneurone e le proprietà di cottura, nella modalità ponte dell'amplificatore intracellulare, stimolare i rispettivi rami nervosi a identificare il motoneurone sulla base dell'aspetto tutto o nulla, del potenziale di azione antidromica. Nella modalità di bloccaggio di corrente discontinua dell'amplificatore intracellulare con una modalità di commutazione di corrente da quattro a otto kilohertz, utilizzare un impulso di corrente depolarizzante intracellulare di 0,5 millisecondi, per evocare un potenziale di azione ortodontica, nel motoneurone.Per calcolare la resistenza all'input cellulare, stimolare un motoneurone, con 40 brevi impulsi di 100 millisecondi di corrente iperpolarizzante di un nanogrammo. Per determinare il valore di base reale come ampiezza minima della corrente depolarizzante necessaria per ottenere un singolo picco, stimolare un motoneurone con impulsi d'onda quadrati di 50 millisecondi ad ampiezze crescenti. Quindi iniettare impulsi d'onda quadrati di 500 millisecondi di corrente depolarizzante, ad ampiezze crescenti.In 0,1 a due nano ampere, per evocare scariche ritmiche di motoneuroni. Per una stimolazione della corrente continua trans-spinale, avviare le procedure di polarizzazione mediante applicazione trans-spinale della corrente continua, pur mantenendo una penetrazione stabile del motoneurone. Qui viene mostrato un tipico potenziale di azione ortotropica, evocato dalla stimolazione intracellulare che soddisfa tutti i criteri per l'inclusione dei dati.In questa analisi, una risposta cellulare ad un impulso di corrente iperpolarizzante di 100 millisecondi di un nanogrammo. Da cui si può osservare sia la resistenza di ingresso del picco che dell'altopiano di un motoneurone, può essere determinata dalla deflessione della tensione. Questa traccia di tensione espansa di un vero picco di base, mostra una soglia di tensione chiaramente marcata del picco.Indicando il livello di depolarizzazione della membrana a cui vengono attivati i canali del sodio gated di tensione per avviare il potenziale d'azione. Questi grafici forniscono esempi di tracce di tensione intracellulare. Da due motoneuroni, stimolati intracellularmente con impulsi quadrati di 500 millisecondi di corrente depolarizzante.Prima, durante e dopo un'applicazione di stimolazione della corrente continua trans-spinale. Si è scoperto che la stimolazione della corrente continua trans-spinale anodale agisce verso una maggiore eccitabilità del motoneurone e frequenze più elevate di cottura ritmica. Mentre la stimolazione della corrente continua trans-spinale catodale, ha agito verso l'inibizione del fuoco.Inoltre, gli effetti di entrambi i tipi di stimolazione della corrente continua trans-spinale, hanno superato il periodo di polarizzazione. I dati imprecisi possono essere acquisiti, se i criteri di inclusione dei dati sono compromessi a causa della penetrazione imperfetta delle cellule. Un fallimento nel compensare la resistenza e la capacità del microelettrodo o l'instabilità del midollo spinale.È imperativo che non si danneggi il midollo spinale durante la dissezione in quanto la lesione può causare shock spinale, rendendo impossibili ulteriori registrazioni. È possibile raccogliere campioni di tessuto per ulteriori analisi istologiche o immuno citochimicologiche. Ad esempio, la misurazione dell'espressione c-fos può essere usata come proxy dell'attività neuronale.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrode Positioning and Montage in Transcranial Direct Current Stimulation

Posizionamento elettrodo e Montage stimolazione transcranica diretta in corrente

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a technique that has been intensively investigated in the past decade as this method offers a ...

Ricerca

Neuroscienze

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

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Misurare spinale Presinaptiche inibizione nei topi radice dorsale Recording potenziale<em&gt; In Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Stimolazione diretta correnti e multi-elettrodo Array registrazione di sequestro simile attività nei topi cervello fetta di preparazione

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...

Remotely Supervised Transcranial Direct Current Stimulation: An Update on Safety and Tolerability

Supervisione da remoto Transcranial diretta stimolazione corrente: Un aggiornamento sulla sicurezza e la tollerabilità

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The Combined Use of Transcranial Direct Current Stimulation and Robotic Therapy for the Upper Limb

L'uso combinato di corrente stimolazione transcranica diretta e terapia robotica per l'arto superiore

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Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Stimolazione transcranica corrente continua (tDCS) in topi

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

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Stimulation Location Determination using a 3D Digitizer with High-Definition Transcranial Direct Current Stimulation

Stimolazione della posizione Determinazione utilizzando un digitalizzatore 3D con stimolazione a corrente diretta transcranica ad alta definizione

The abundance of neuroimaging data and rapid development of machine learning has made it possible to investigate brain activation patterns. However, ...

Simultaneous Application of Transcranial Direct Current Stimulation during Virtual Reality Exposure

Applicazione simultanea della stimolazione transcranica a corrente continua durante l'esposizione alla realtà virtuale

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Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) for Memory Enhancement

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS for Memory Enhancement

Stimolazione transcranica a corrente continua (tDCS) per il miglioramento della memoria

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