Name: in vivo intracellular recording of type-identified rat spinal motoneurons during trans-spinal direct current stimulation
Uploaded: 2020-05-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Science Center grant No. 2017/25/B/NZ7/00373. Forfattere ønsker å gjenkjenne arbeidet til Hanna Drzymała-Celichowska og Włodzimierz Mrówczyński, som begge bidro til datainnsamling og analyse av resultatene som presenteres i denne artikkelen.

Alle prosedyrer knyttet til denne protokollen er akseptert av de aktuelle myndighetene (f.eks. lokal etikkkomité) og følger de nasjonale og internasjonale reglene for dyrevelferd og ledelse.
MERK: Hver deltaker som er involvert i prosedyren må være riktig opplært i grunnleggende kirurgiske prosedyrer og må ha en gyldig lisens for å utføre dyreforsøk.
1. Anestesi og overmedisinering
<ol><li>Bedøve en rotte med intraperitoneale injeksjoner av natriumpentob...

<ol>
	<li>Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ergogenic+Effects+of+Transcranial+Direct+Current+Stimulation+on+Exercise+Performance.">The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance.</a> Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).</li><li>Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+induces+lasting+fatigue+resistance+and+enhances+explosive+vertical+jump+performance.">Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance.</a> PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).</li><li>Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+(tsDCS)+selectively+inhibits+the+synaptic+efficacy+of+nociceptive+transmission+at+spinal+cord+level.">Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level.</a> Neuroscience. 393, 150-163 (2018).</li><li>Parazzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+current+density+generated+by+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+(tsDCS).">Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS).</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).</li><li>Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+study+of+feasibility+and+effect+of+anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+on+chronic+neuropathic+pain+after+spinal+cord+injury.">Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury.</a> Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).</li><li>G&#243;mez-Soriano, J., Meg&#237;a-Garc&#237;a, A., Serrano-Mu&#241;oz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+spinal+direct+current+simulation+for+spasticity+therapy+following+spinal+cord+injury:+mechanistic+insights+contributing+to+long-term+treatment+effects.">Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects.</a> The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).</li><li>de Ara&#250;jo, A. V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+anodal+transcranial+direct+current+stimulation+to+improve+muscle+strength+and+motor+functionality+after+incomplete+spinal+cord+injury:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis.</a> Spinal Cord. , (2020).</li><li>de Paz, R. H., Serrano-Mu&#241;oz, D., P&#233;rez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avenda&#241;o-Coy, J., G&#243;mez-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+transcranial+direct-current+stimulation+with+gait+training+in+patients+with+neurological+disorders:+a+systematic+review.">Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review.</a> Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gamma+and+alpha+spinal+motor+neurons+activity+by+trans-spinal+direct+current+stimulation:+effects+on+reflexive+actions+and+locomotor+activity.">Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity.</a> Physiological Reports. 4 (3), (2016).</li><li>Bolzoni, F., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+and+postsynaptic+effects+of+local+cathodal+DC+polarization+within+the+spinal+cord+in+anaesthetized+animal+preparations.">Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations.</a> The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).</li><li>Cogiamanian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+Spinal+Direct+Current+Stimulation.">Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation.</a> Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-spinal+direct+current+stimulation+alters+muscle+tone+in+mice+with+and+without+spinal+cord+injury+with+spasticity.">Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).</li><li>Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+long-lasting+subcortical+facilitation+by+transcranial+direct+current+stimulation+in+the+cat.">Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat.</a> The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).</li><li>Manuel, M., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha,+beta+and+gamma+motoneurons:+functional+diversity+in+the+motor+system's+final+pathway.">Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway.</a> Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).</li><li>Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+unit+recruitment+order+during+voluntary+and+electrically+induced+contractions+in+the+tibialis+anterior.">Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior.</a> Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).</li><li>Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+behaviour+of+motor+units+in+the+tibialis+anterior+during+voluntary+contractions.">Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions.</a> Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).</li><li>Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+properties+of+motoneurons+innervating+different+muscle+unit+types+in+rat+gastrocnemius.">Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius.</a> Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-spinal+direct+current+stimulation+modifies+spinal+cord+excitability+through+synaptic+and+axonal+mechanisms.">Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms.</a> Physiological Reports. 2 (9), (2014).</li><li>Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics,+high-frequency+oscillations,+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons.">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li><li>Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., K&#246;nig, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+limits+of+cathodal+transcranial+direct+current+stimulation+in+rats.">Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).</li><li>B&#261;czyk, M., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+direct+current+are+reproduced+by+intermittent+depolarization+of+myelinated+nerve+fibers.">Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).</li><li>B&#261;czyk, M., Drzyma&#322;a-Celichowska, H., Mr&#243;wczy&#324;ski, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motoneuron+firing+properties+are+modified+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats.">Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> Journal of Applied Physiology. 126 (5), 1232-1241 (2019).</li><li>B&#261;czyk, M., Drzyma&#322;a-Celichowska, H., Mr&#243;wczy&#324;ski, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+modifications+of+motoneuron+firing+properties+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats.">Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> European Journal of Neuroscience. , (2019).</li><li>Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+the+ratio+of+injected+current+to+electrode+area+tell+us+about+current+density+in+the+brain+during+tDCS.">What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).</li><li>Rahman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+effects+of+acute+direct+current+stimulation:+somatic+and+synaptic+terminal+effects.">Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects.</a> The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).</li><li>Bikson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+uniform+extracellular+DC+electric+fields+on+excitability+in+rat+hippocampal+slices+in+vitro.">Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro.</a> The Journal of Physiology. 557, 175-190 (2004).</li><li>Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+control+of+motor+outputs+by+intrinsic+and+externally+induced+electric+field+potentials.">Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).</li><li>Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-current+relationships+of+rat+hindlimb+alpha-motoneurones.">Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones.</a> The Journal of Physiology. 573, 663-677 (2006).</li></ol>

Hvis den utføres riktig, bør den kirurgiske delen av den beskrevne protokollen fullføres innen ca. tre timer. Man bør være spesielt forsiktig med å opprettholde stabile fysiologiske forhold til et dyr under operasjonen, spesielt kroppstemperatur og dybde av anestesi. Bortsett fra åpenbare etiske hensyn, kan mangel på riktig anestesi føre til overdreven lembevegelser under nervedeksjon eller laminektomi og føre til skade på preparatet eller en tidlig eksperimentoppsigelse. Ved å lamme et dyr før du trenger in...

Trans-spinal direkte strøm stimulering (tsDCS) er å få anerkjennelse som en potent metode for å endre spinal krets spenning i helse og sykdom1,,2,,3. I denne teknikken overføres en konstant strøm mellom en aktiv elektrode som ligger over utvalgte spinalsegmenter, med en referanseelektrode plassert enten ventrikalt eller mer rostrally4. Flere studier har allerede bekreftet at tsDCS kan brukes til å håndtere visse patologiske forhold, for eksempel nevropatisksmerte 5,spasticitet6,ryggmargsskade7 eller for å lette rehabilitering8. Forskere foreslår at tsDCS fremkaller endringer i iionfordelingen mellom intracellulær og ekstracellulært rom over cellemembranen, og dette kan enten lette eller hemme nevronal aktivitet avhengig av gjeldendeorientering 9,10,11. Men inntil nylig manglet en direkte bekreftelse på denne påvirkningen på motoneuroner.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for å gjennomføre intracellulær registrering av elektriske potensialer fra lumbale spinalmotoneuroner i den bedøvede rotten med samtidig bruk av tsDCS, for å observere endringer i motoneuronmembran og avfyringsegenskaper som svar på anodal eller katadal polarisering av spinalneuronalnettet. Intracellulære opptak åpner flere områder av undersøkelse av nevronegenskaper, utilgjengelig for tidligere brukte ekstracellulæreteknikker 9,12. For eksempel er det mulig å nøyaktig måle motoneuron membran spenning respons på direkte strøm strøm indusert av tsDCS, for å indikere spenningsterskel for pigggenerering, eller for å analysere handling potensielle parametere. Videre tillater denne teknikken oss å bestemme motoneuron passive membranegenskaper, for eksempel inngangsmotstand, og for å observere forholdet mellom intracellulær stimuleringsstrøm og hyppigheten av rytmisk avfyring av motoneuroner. Antidromisk identifisering av registrert motoneuron, basert på stimulering av funksjonelt identifiserte nerver (det vil si nerver som gir efferents til flexors eller extensors) tillater oss å i tillegg identifisere typer innervated motorenheter (rask versus sakte), noe som gir en mulighet til å teste om polarisering påvirker ulike elementer i det modne spinalneuronale systemet. På grunn av omfattende kirurgi før opptaket og høye krav til stabilitet og pålitelighet av opptak, er denne teknikken svært utfordrende, men tillater direkte og langsiktig vurdering av elektrofysiologiske egenskaper av en motoneuron: før, under og etter påføring av tsDCS, noe som er avgjørende for å bestemme både sine akutte handlinger ogvedvarende effekter 13. Som en motoneuron aktiverer direkte ekstradrivstoff muskelfibre14 og tar del i tilbakemeldingskontroll av en muskelsammentrekning og utviklet kraft15,16 enhver observert påvirkning av tsDCS på motorenheten eller muskelkontraktile egenskaper kan være knyttet til moduleringer av motoneuron spenning eller avfyring egenskaper.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Durgs and solutions</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropinum sulfuricum</td>
			<td>Polfa Warszawa</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>346351</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106329</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium Jelfa</td>
			<td>PharmaSwiss/Valeant</td>
			<td>-</td>
			<td>Neuromuscular blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Biowet Pu&#322;awy Sp. z o.o</td>
			<td>-</td>
			<td>Main anesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium citrate</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>6100-05-06</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraspan</td>
			<td>Braun</td>
			<td>-</td>
			<td>HES solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical equipment</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 Blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>10021-00</td>
			<td>Scalpel blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cauterizer</td>
			<td>FST</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chest Tubes</td>
			<td>Mila</td>
			<td>CT1215</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11241-30</td>
			<td>Muscle forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Dura forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5F Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11255-20</td>
			<td>Nerve forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Pia forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11008-13</td>
			<td>Blunt forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11053-10</td>
			<td>Skin forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>FST</td>
			<td>13013-14</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeur</td>
			<td>FST</td>
			<td>16021-14</td>
			<td>For laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>Vein scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15002-08</td>
			<td>Dura scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14184-09</td>
			<td>For trachea cut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>104075-11</td>
			<td>Muscle scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-13</td>
			<td>Skin scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracheal tube</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vein catheter</td>
			<td>Vygon</td>
			<td>1261.201</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel cannulation forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>18403-11</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18320-11</td>
			<td>For vein clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Dilating Probe</td>
			<td>FST</td>
			<td>10160-13</td>
			<td>For vein dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugrgical materials</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel foam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>GTIN 00300090315085</td>
			<td>Hemostatic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4.0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-40</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 6.0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-60</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axoclamp 2B</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor</td>
			<td>CWE</td>
			<td>11-10000</td>
			<td>Gas analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grass S-88</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Constant current stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>507222F</td>
			<td>Heating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-DAM8A</td>
			<td>WPI</td>
			<td>74020</td>
			<td>Extracellular amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdrive</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement IVM/Scientifica</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Microelectrode puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAR-830/AP Small Animal Ventilator</td>
			<td>CWE</td>
			<td>12-02100</td>
			<td>Respirator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support frame</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinal clamps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TP-1 DC stimulator</td>
			<td>WiNUE</td>
			<td>-</td>
			<td>tsDCS stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B150-4 glass capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150-4</td>
			<td>For microelectrodes production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible tubing</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For respirator and CO2 analyzer connection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td>For filling micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For nerve electrodes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo intracellular recording of type-identified rat spinal motoneurons during trans-spinal direct current stimulation

Intracellulær registrering av spinal motoneurons in vivo gir en "gullstandard" for å bestemme cellenes elektrofysiologiske egenskaper i det intakte spinalnettverket og har betydelige fordeler i forhold til klassisk in vitro eller ekstracellulære opptaksteknikker. En fordel med in vivo intracellulære opptak er at denne metoden kan utføres på voksne dyr med et fullt modent nervesystem, og derfor kan mange observerte fysiologiske mekanismer oversettes til praktiske applikasjoner. I dette metodiske papiret beskriver vi denne prosedyren kombinert med eksternt anvendt konstant strømstimulering, som etterligner polariseringsprosesser som forekommer i spinalneuronale nettverk. Trans-spinal direkte strøm stimulering (tsDCS) er en innovativ metode i økende grad brukt som en neuromodulerende intervensjon i rehabilitering etter ulike nevrologiske skader så vel som i sport. Påvirkningen av tsDCS på nervesystemet forblir dårlig forstått og de fysiologiske mekanismene bak sine handlinger er i stor grad ukjente. Anvendelsen av tsDCS samtidig med intracellulære opptak gjør det mulig for oss å direkte observere endringer av motoneuronmembranegenskaper og egenskaper ved rytmisk avfyring som svar på polariseringen av spinalneuronnettverket, noe som er avgjørende for forståelsen av tsDCS-handlinger. Videre, når den presenterte protokollen inkluderer identifisering av motoneuron med hensyn til en innervated muskel og dens funksjon (flexor versus extensor) samt fysiologisk type (rask versus langsom) det gir en mulighet til å selektivt undersøke påvirkning av tsDCS på identifiserte komponenter av spinal kretser, som synes å være annerledes påvirket av polarisering. Den presenterte prosedyren fokuserer på kirurgisk forberedelse for intracellulære opptak og stimulering med vekt på trinnene som er nødvendige for å oppnå forberedelsesstabilitet og reproduserbarhet av resultater. Detaljene i metodikken til anodal- eller cathodal tsDCS-søknaden diskuteres samtidig som man tar hensyn til praktiske og sikkerhetsmessige spørsmål.

Parametere for handlingspotensialer og flere membranegenskaper kan beregnes på grunnlag av intracellulære opptak når stabile forhold for cellepenetrasjon sikres. Figur 1A presenterer et typisk ortokmisk virkningspotensial fremkalt av intracellulær stimulering, som oppfyller alle kriterier for datainkludering (hvilemembranpotensialet på minst -50 mV og spike amplitude høyere enn 50 mV, med en positiv overshoot). Handling potensielle parametere, for eksempel spike amplitude, etterhyperpo...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation at JoVE.com

In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

Denne protokollen beskriver in vivo intracellulær registrering av rotte lumbale motoneurons med samtidig trans-spinal direkte strømstimulering. Metoden gjør det mulig for oss å måle membranegenskaper og registrere rytmisk avfyring av motoneuroner før, under og etter anodal eller cathodal polarisering av ryggmargen.

In Vivo Intracellular Registrering av typeidentifiserte rotte spinal motoneurons under Trans-Spinal Direkte StrømStimulering

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological ...

Denne protokollen bruker intracellulære opptak av spinalmotoneuroner, for å direkte undersøke påvirkningen av trans-spinal direkte strømstimulering på funksjonen til spinalnettverk. Den største fordelen med denne teknikken er at det gjør at intracellulære opptak kan utføres på fullt modent nervesystem. Tilrettelegging av oversettelse av eksperimentelle observasjoner til praktiske anvendelser.Etter å ha bekreftet mangel på respons på pedalrefleks, en bedøvet seks måneder gammel mannlig Wistar rotte, bruk et dissekerende mikroskop og et nummer 21 blad, for å gjøre et langsgående hud snitt fra brystbenet til haken. Og bruk sløv disseksjon for å avsløre riktig halsvene. Plasser to, 4-0 ligaturer under den delen av venen uten forgreningspunkter.Og lag en løs knute på den proksimale enden av venesegmentet. Og en løs knute på den distale enden av segmentet. Klem venen proksimal til hjertet, og ligate den distale enden av venen.Bruk iris saks for å gjøre et snitt mellom klemmen og distal ligatur. Og, holder en klaff av venen, introdusere et ferdigfylt kateter til det punktet hvor venen er blokkert av klemmen. Fjern deretter klemmen og skyv kateteret flere millimeter inn i venen.For en trakeal rør plassering, bruk stumpe tang for å skille de to mandibulære kjertlene som dekker sternohyoid musklene. Og skille sternohyoid musklene på midtlinjen, for å avsløre luftrøret. Plasser tre, 4-0 ligaturer under luftrøret, og lag to knop under trakealrøret innsettingspunkt og en knute over.Sett deretter et trakealrør inn i luftrøret under den tredje trakealbrusk. Og fest røret på plass med de forhåndspre prepared ligaturene. For å dissekere baklemmervene, bruk et nummer 21 blad for å lage et langsgående kutt på den bakre siden av venstre bakben, fra akillessenen til hoften.Og bruk saks for å lage et kutt mellom de fremre og bakre områdene i popliteal fossa, på baksiden av kneleddet. Klipp to hoder av biceps femoris, for å avsløre isjiasnerven. Og skille det laterale hodet fra det mediale hodet av gastrocnemiusmuskelen, for å avsløre tibialnerven og dens grener.Bruk deretter nummer 55 tang, for å nøye dissekere den mediale gastrocnemius og lateral gastrocnemius og soleus nerver. Koble dem fra det omkringliggende vevet samtidig opprettholde sin forbindelse til de respektive muskler. For å utføre laminektomi, bruk et nummer 21 blad for å lage et langsgående snitt fra sakrum opp til thoraxvirvlene.Og identifisere Th13 vertebra, som et laveste thorax segment med en ribbe innsetting. Bruk deretter fine rongeurs for å fjerne de spinøse prosessene og laminae fra Th13 til L2 vertebrae, for å avsløre lumbale segmenter av ryggmargen. For å fikse vertebralkolonnen, plasser rotten i en skreddersydd ramme på en 37 grader Celsius varmepute, koblet til et lukket sløyfevarmesystem.Og bruk hudklaffene til å danne et dypt basseng over den eksponerte ryggmargen. Plasser metallklemmer under Th12 tverrgående prosesser, og på L3 spinøse prosesser, og fyll bassenget med 37 grader Celsius mineralolje. Bruk hudklaffene til å lage et dypt basseng av mineralolje over de eksponerte tibiale, mediale gastrocnemius og laterale gastrocnemius og soleus nerver.Og plasser nervene på bipolare sølvtrådstimulerende elektroder. Koble deretter elektrodene til en firkantet pulsstimulator ved hjelp av separate stimuleringskanaler for hver nerve. For en overflateelektrodeplassering, under det disseksjonsmikroskopet, plasser en sølvkuleelektrode på venstre kaudal side av den eksponerte ryggmargen.Med en referanseelektrode satt inn i ryggmuskulaturen. Og koble begge elektrodene til differensial dc forsterker. Bruk en konstant strømstimulator for å stimulere den mediale gastrocnemius og laterale gastrocnemius og soleus nerver, med firkantede pulser av en 0,1 millisekund varighet gjentatt med en tre hertz frekvens og observere de afferent volleys.På slutten av simuleringen flytter du overflateelektroden rostrally, og gjentar stimuleringen for å identifisere spinalsegmentene der volleyenes amplituder er de høyeste for hver nerve. Etter å ha bestemt plasseringen av maksimal volley, lever en nevromuskulær blokkering intravenøst for å lamme rotten. Mens en assistent kobler trakealrøret til en ekstern ventilator på linje med en gnagerkompatibel cap nominator.For å åpne dura og pia mater, bruk nummer 55 tang for å forsiktig løfte dura mater, og kutte vevet caudally fra L5 segmentet, rostrally opp til L4 segmentet. Bruk deretter et par ultratynne 5SF-tang, for å lage en liten i pia, som dekker den dorsale kolonnen mellom blodkarene. Nøyaktig på nivået av maksimal afferent volley fra den mediale gastrocnemius og lateral gastrocnemius og soleus nerve.For å plassere trans-spinal direkte strøm stimulering elektroder, plasser en saltvann gjennomvåt svamp på ryggsiden av Th12 ryggvirvler. Og bruk fin manipulasjon for å trykke svampen med en aktiv trans-spinal direkte strømstimulering elektrode. Monter deretter en tilpasset samlet mikroelektrod, på mikromanipulatoren, slik at en en til to mikron stepping bevegelse og stereotoksisk kalibrering.Og kjør en mikropipettespiss inn i en valgt patch i pia, i en 15 til 20 graders mediale lateral vinkel. For å registrere motoneuronmembranen og avfyringsegenskapene, stimulerer de respektive nervegrenene i bromodus de respektive nervegrenene for å identifisere motoneuronen på grunnlag av alt eller ingenting utseende, av det antidromiske virkningspotensialet. I den diskontinuerlige strømklemmemodusen til den intracellulære forsterkeren med en strømbryterhastighetsmodus fire til åtte kilohertz, bruk et intracellulært depolariserende strømpulser på 0,5 millisekunder, for å fremkalle et ortopedisk virkningspotensial, i motoneuronen.For å beregne celleinngangsmotstanden, stimulere en motoneuron, med 40 korte 100 millisekunders pulser av hyperpolariserende en nanogramstrøm. For å bestemme den virkelige grunnverdien som minimum amplitude av depolariserende strømmen som kreves for å fremkalle en enkelt pigg, stimulere en motoneuron med 50 millisekund firkantbølgepulser ved økende amplituder. Deretter injiserer du 500 millisekund firkantede bølgepulser av depolariserende strøm, ved økende amplituder.I 0,1 til to nano amp trinn, for å fremkalle rytmiske utslipp av motoneuroner. For en trans-spinal direkte strømstimulering, start polariseringsprosedyrene ved trans-spinal påføring av direkte strøm, samtidig som en stabil penetrasjon av motoneuron opprettholdes. Her vises et typisk ortropisk virkningspotensial, fremkalt av intracellulær stimulering som oppfyller alle kriteriene for datainkludering.I denne analysen, en celle respons på en 100 millisekund hyperpolarizing strøm puls på ett nanogram. Fra hvilken både toppen og platåinngangsmotstanden til en motoneuron, kan bestemmes fra spenningsavbøyningen, kan observeres. Denne utvidede spenningsspor av en reell grunnleggende pigg, viser en klart markert spenningsterskel av spissen.Indikerer nivået av membran depolarisering der spenning inngjerdet natriumkanaler er aktivert for å initiere virkningspotensialet. Disse grafene gir eksempler på intracellulære spenningsspor. Fra to motoneuroner, stimulert intracellulært med 500 millisekunder firkantede pulser av depolariserende strøm.Før, under, og etter en trans-spinal direkte strøm stimulering søknad. Anodal trans-spinal direkte strøm stimulering ble funnet å virke mot en økt motoneuron spenning og høyere frekvenser av rytmisk avfyring. Mens cathodal trans-spinal direkte strøm stimulering, handlet til mot avfyring hemming.Videre, effekten av begge typer trans-spinal direkte strøm stimulering, varte perioden med polarisering. Unøyaktige data kan innhentes, hvis datainkluderingskriteriene er kompromittert på grunn av ufullkommen cellepenetrasjon. En unnlatelse av å kompensere mikroelektrorod motstand og kapasitans eller en ryggmargs ustabilitet.Det er viktig at ingen skade gjøres på ryggmargen under disseksjonen, da skade kan føre til spinalsjokk, noe som gjør ytterligere opptak umulig. Det er mulig å høste vevsprøver for ytterligere histologisk eller immuno cyto kjemisk analyse. For eksempel kan måling av c-fos uttrykk brukes som proxy av nevronal aktivitet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrode Positioning and Montage in Transcranial Direct Current Stimulation

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a technique that has been intensively investigated in the past decade as this method offers a ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Måling Spinal presynaptiske Hemming i mus ved Dorsal Root Potential Recording<em&gt; I Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Direkte-strøm Stimulering og Multi-elektrode Array opptak av Seizure-lignende aktivitet i Mus Brain Slice Forberedelse

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...

Remotely Supervised Transcranial Direct Current Stimulation: An Update on Safety and Tolerability

Eksternt veiledet Transkraniell direkte gjeldende stimulering: En oppdatering på sikkerhet og toleranse

The remotely supervised tDCS (RS-tDCS) protocol enables participation from home through guided and monitored self-administration of tDCS treatment while ...

The Combined Use of Transcranial Direct Current Stimulation and Robotic Therapy for the Upper Limb

Kombinert bruk av Transkraniell direkte gjeldende stimulering og Robotic terapi for den øvre lem

Neurologic disorders such as stroke and cerebral palsy are leading causes of long-term disability and can lead to severe incapacity and restriction of ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Transkraniell likestrøm stimulering (tDCS) i mus

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Direkte injeksjon av en Lentiviral vektor høydepunkter flere Motor veier i ryggmargen rotte

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Stimulation Location Determination using a 3D Digitizer with High-Definition Transcranial Direct Current Stimulation

Besluttsomhet ved stimulering av posisjon ved hjelp av en 3D-digitaliseringsenhet med High-Definition Transkraniell direkte strøm stimulering

The abundance of neuroimaging data and rapid development of machine learning has made it possible to investigate brain activation patterns. However, ...

Simultaneous Application of Transcranial Direct Current Stimulation during Virtual Reality Exposure

Samtidig påføring av transkraniell likestrømstimulering under virtual reality-eksponering

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a form of non-invasive brain stimulation that changes the likelihood of neuronal firing through ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) for Memory Enhancement

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS for Memory Enhancement

Transkraniell likestrømstimulering (tDCS) for minneforbedring

Memory enhancement is one of the great challenges in cognitive neuroscience and neurorehabilitation. Among various techniques used for memory enhancement, ...