Name: in vivo intracellular recording of type-identified rat spinal motoneurons during trans-spinal direct current stimulation
Uploaded: 2020-05-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciência nº 2017/25/B/NZ7/00373. Os autores gostariam de reconhecer o trabalho de Hanna Drzymała-Celichowska e Włodzimierz Mrówczyński, que contribuíram para a coleta e análise dos resultados apresentados neste artigo.

Todos os procedimentos ligados a este protocolo foram aceitos pelas autoridades competentes (por exemplo, Comitê de Ética Local) e seguem as regras nacionais e internacionais sobre bem-estar e gestão animal.
NOTA: Cada participante envolvido no procedimento deve ser devidamente treinado em procedimentos cirúrgicos básicos e tem que ter uma licença válida para a realização de experimentos em animais.
1. Anestesia e premeditação
<ol><li>Anestesiar um rato...

<ol>
	<li>Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ergogenic+Effects+of+Transcranial+Direct+Current+Stimulation+on+Exercise+Performance.">The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance.</a> Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).</li><li>Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+induces+lasting+fatigue+resistance+and+enhances+explosive+vertical+jump+performance.">Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance.</a> PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).</li><li>Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+(tsDCS)+selectively+inhibits+the+synaptic+efficacy+of+nociceptive+transmission+at+spinal+cord+level.">Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level.</a> Neuroscience. 393, 150-163 (2018).</li><li>Parazzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+current+density+generated+by+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+(tsDCS).">Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS).</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).</li><li>Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+study+of+feasibility+and+effect+of+anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+on+chronic+neuropathic+pain+after+spinal+cord+injury.">Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury.</a> Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).</li><li>G&#243;mez-Soriano, J., Meg&#237;a-Garc&#237;a, A., Serrano-Mu&#241;oz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+spinal+direct+current+simulation+for+spasticity+therapy+following+spinal+cord+injury:+mechanistic+insights+contributing+to+long-term+treatment+effects.">Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects.</a> The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).</li><li>de Ara&#250;jo, A. V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+anodal+transcranial+direct+current+stimulation+to+improve+muscle+strength+and+motor+functionality+after+incomplete+spinal+cord+injury:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis.</a> Spinal Cord. , (2020).</li><li>de Paz, R. H., Serrano-Mu&#241;oz, D., P&#233;rez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avenda&#241;o-Coy, J., G&#243;mez-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+transcranial+direct-current+stimulation+with+gait+training+in+patients+with+neurological+disorders:+a+systematic+review.">Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review.</a> Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gamma+and+alpha+spinal+motor+neurons+activity+by+trans-spinal+direct+current+stimulation:+effects+on+reflexive+actions+and+locomotor+activity.">Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity.</a> Physiological Reports. 4 (3), (2016).</li><li>Bolzoni, F., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+and+postsynaptic+effects+of+local+cathodal+DC+polarization+within+the+spinal+cord+in+anaesthetized+animal+preparations.">Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations.</a> The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).</li><li>Cogiamanian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+Spinal+Direct+Current+Stimulation.">Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation.</a> Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-spinal+direct+current+stimulation+alters+muscle+tone+in+mice+with+and+without+spinal+cord+injury+with+spasticity.">Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).</li><li>Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+long-lasting+subcortical+facilitation+by+transcranial+direct+current+stimulation+in+the+cat.">Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat.</a> The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).</li><li>Manuel, M., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha,+beta+and+gamma+motoneurons:+functional+diversity+in+the+motor+system's+final+pathway.">Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway.</a> Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).</li><li>Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+unit+recruitment+order+during+voluntary+and+electrically+induced+contractions+in+the+tibialis+anterior.">Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior.</a> Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).</li><li>Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+behaviour+of+motor+units+in+the+tibialis+anterior+during+voluntary+contractions.">Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions.</a> Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).</li><li>Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+properties+of+motoneurons+innervating+different+muscle+unit+types+in+rat+gastrocnemius.">Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius.</a> Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-spinal+direct+current+stimulation+modifies+spinal+cord+excitability+through+synaptic+and+axonal+mechanisms.">Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms.</a> Physiological Reports. 2 (9), (2014).</li><li>Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics,+high-frequency+oscillations,+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons.">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li><li>Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., K&#246;nig, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+limits+of+cathodal+transcranial+direct+current+stimulation+in+rats.">Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).</li><li>B&#261;czyk, M., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+direct+current+are+reproduced+by+intermittent+depolarization+of+myelinated+nerve+fibers.">Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).</li><li>B&#261;czyk, M., Drzyma&#322;a-Celichowska, H., Mr&#243;wczy&#324;ski, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motoneuron+firing+properties+are+modified+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats.">Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> Journal of Applied Physiology. 126 (5), 1232-1241 (2019).</li><li>B&#261;czyk, M., Drzyma&#322;a-Celichowska, H., Mr&#243;wczy&#324;ski, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+modifications+of+motoneuron+firing+properties+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats.">Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> European Journal of Neuroscience. , (2019).</li><li>Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+the+ratio+of+injected+current+to+electrode+area+tell+us+about+current+density+in+the+brain+during+tDCS.">What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).</li><li>Rahman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+effects+of+acute+direct+current+stimulation:+somatic+and+synaptic+terminal+effects.">Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects.</a> The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).</li><li>Bikson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+uniform+extracellular+DC+electric+fields+on+excitability+in+rat+hippocampal+slices+in+vitro.">Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro.</a> The Journal of Physiology. 557, 175-190 (2004).</li><li>Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+control+of+motor+outputs+by+intrinsic+and+externally+induced+electric+field+potentials.">Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).</li><li>Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-current+relationships+of+rat+hindlimb+alpha-motoneurones.">Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones.</a> The Journal of Physiology. 573, 663-677 (2006).</li></ol>

Se realizada corretamente, a parte cirúrgica do protocolo descrito deve ser concluída dentro de aproximadamente três horas. Deve-se tomar cuidado especial na manutenção de condições fisiológicas estáveis de um animal durante a cirurgia, em especial a temperatura corporal e a profundidade da anestesia. Além de considerações éticas óbvias, a falta de anestesia adequada pode resultar em movimentos excessivos de membros durante a dissecção nervosa ou laminectomia e levar a danos à preparação ou a um térmi...

A estimulação da corrente direta trans-espinhal (tsDCS) está ganhando reconhecimento como um método potente para modificar a excitabilidade do circuito espinhal na saúde e na doença1,,2,3. Nesta técnica, é passada uma corrente constante entre um eletrodo ativo localizado acima dos segmentos espinhais selecionados, com um eletrodo de referência localizado ventrally ou mais rostrally4. Vários estudos já confirmaram que o TSDCS pode ser usado no gerenciamento de certas condições patológicas, como dor neuropática5, espasticidade6,lesão medular7 ou para facilitar a reabilitação8. Os pesquisadores sugerem que o TSDCS evoca alterações na distribuição de íons entre o espaço intracelular e o espaço extracelular através da membrana celular, e isso pode facilitar ou inibir a atividade neuronal dependendo da orientação atual9,,10,,11. No entanto, até recentemente, faltava uma confirmação direta dessa influência sobre os motoneurons.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para realizar o registro intracelular in vivo de potenciais elétricos de motoneurons lombares no rato anesthetizado com aplicação simultânea de TSDCS, a fim de observar alterações na membrana motoneuron e propriedades de disparo em resposta à polarização anodal ou catódal da rede neuronal espinhal. Gravações intracelulares abrem diversas áreas de investigação de propriedades de neurônios, indisponíveis para técnicas extracelulares previamente utilizadas9,12. Por exemplo, é possível medir com precisão a resposta de tensão da membrana do motoneuron ao fluxo de corrente direta induzido pelo TSDCS, indicar limiar de tensão para geração de picos ou analisar parâmetros potenciais de ação. Além disso, essa técnica nos permite determinar as propriedades da membrana passiva do motoneuron, como a resistência à entrada, e observar a relação entre a corrente de estimulação intracelular e a frequência de disparo rítmico de motoneurons. A identificação antidrómica do motoneuron registrado, com base na estimulação de nervos identificados funcionalmente (ou seja, nervos que fornecem eferentes a flexores ou extensores) permite identificar adicionalmente tipos de unidades motoras inervadas (rápida versus lenta), o que dá a oportunidade de testar se a polarização influencia de forma diferente elementos individuais do sistema neuronal espinhal maduro. Devido à extensa cirurgia que precede o registro e aos altos requisitos de estabilidade e confiabilidade das gravações, essa técnica é altamente desafiadora, mas permite a avaliação direta e a longo prazo das características eletrofisiológicas de um motoneuron: antes, durante e depois da aplicação do TSDCS, que é crucial para determinar tanto suas ações agudas quanto os efeitos persistentes13. Como um motoneuron ativa diretamente as fibras musculares extrafusais14 e participa do controle de feedback de uma contração muscular e desenvolveu força15,16 qualquer influência observada de tsDCS na unidade motora ou propriedades contratuais musculares pode estar ligada a modulações de excitabilidade do motoneuron ou características de disparo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Durgs and solutions</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropinum sulfuricum</td>
			<td>Polfa Warszawa</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>346351</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106329</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium Jelfa</td>
			<td>PharmaSwiss/Valeant</td>
			<td>-</td>
			<td>Neuromuscular blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Biowet Pu&#322;awy Sp. z o.o</td>
			<td>-</td>
			<td>Main anesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium citrate</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>6100-05-06</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraspan</td>
			<td>Braun</td>
			<td>-</td>
			<td>HES solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical equipment</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 Blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>10021-00</td>
			<td>Scalpel blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cauterizer</td>
			<td>FST</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chest Tubes</td>
			<td>Mila</td>
			<td>CT1215</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11241-30</td>
			<td>Muscle forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Dura forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5F Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11255-20</td>
			<td>Nerve forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Pia forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11008-13</td>
			<td>Blunt forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11053-10</td>
			<td>Skin forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>FST</td>
			<td>13013-14</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeur</td>
			<td>FST</td>
			<td>16021-14</td>
			<td>For laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>Vein scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15002-08</td>
			<td>Dura scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14184-09</td>
			<td>For trachea cut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>104075-11</td>
			<td>Muscle scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-13</td>
			<td>Skin scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracheal tube</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vein catheter</td>
			<td>Vygon</td>
			<td>1261.201</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel cannulation forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>18403-11</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18320-11</td>
			<td>For vein clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Dilating Probe</td>
			<td>FST</td>
			<td>10160-13</td>
			<td>For vein dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugrgical materials</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel foam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>GTIN 00300090315085</td>
			<td>Hemostatic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4.0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-40</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 6.0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-60</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axoclamp 2B</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor</td>
			<td>CWE</td>
			<td>11-10000</td>
			<td>Gas analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grass S-88</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Constant current stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>507222F</td>
			<td>Heating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-DAM8A</td>
			<td>WPI</td>
			<td>74020</td>
			<td>Extracellular amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdrive</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement IVM/Scientifica</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Microelectrode puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAR-830/AP Small Animal Ventilator</td>
			<td>CWE</td>
			<td>12-02100</td>
			<td>Respirator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support frame</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinal clamps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TP-1 DC stimulator</td>
			<td>WiNUE</td>
			<td>-</td>
			<td>tsDCS stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B150-4 glass capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150-4</td>
			<td>For microelectrodes production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible tubing</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For respirator and CO2 analyzer connection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td>For filling micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For nerve electrodes</td>
		</tr>
	</tbody>
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in vivo intracellular recording of type-identified rat spinal motoneurons during trans-spinal direct current stimulation

O registro intracelular de motoneurons espinhais in vivo fornece um "padrão-ouro" para determinar as características eletrofisiológicas das células na rede espinhal intacta e contém vantagens significativas em relação às técnicas clássicas de gravação in vitro ou extracelular. Uma vantagem das gravações intracelulares in vivo é que esse método pode ser realizado em animais adultos com um sistema nervoso totalmente maduro, e, portanto, muitos mecanismos fisiológicos observados podem ser traduzidos para aplicações práticas. Neste artigo metodológico, descrevemos esse procedimento combinado com a estimulação de corrente constante aplicada externamente, que imita processos de polarização ocorridos dentro das redes neuronais espinhais. A estimulação de corrente direta trans-espinhal (TSDCS) é um método inovador cada vez mais utilizado como intervenção neuromodulatória na reabilitação após várias lesões neurológicas, bem como em esportes. A influência do TSDCS no sistema nervoso permanece mal compreendida e os mecanismos fisiológicos por trás de suas ações são amplamente desconhecidos. A aplicação do tsDCS simultaneamente com gravações intracelulares permite observar diretamente as alterações das propriedades da membrana motoneuron e características do disparo rítmico em resposta à polarização da rede neuronal espinhal, o que é crucial para a compreensão das ações do TSDCS. Além disso, quando o protocolo apresentado inclui a identificação do motoneuron no que diz respeito a um músculo inervado e sua função (flexor versus extensor), bem como o tipo fisiológico (rápido versus lento) proporciona uma oportunidade de investigar seletivamente a influência do TSDCS em componentes identificados de circuitos espinhais, que parecem ser diferentemente afetados pela polarização. O procedimento apresentado foca na preparação cirúrgica para gravações intracelulares e estimulação com ênfase nas etapas necessárias para alcançar a estabilidade da preparação e a reprodutibilidade dos resultados. Os detalhes da metodologia da aplicação anodal ou cathodal tsDCS são discutidos enquanto prestam atenção às questões práticas e de segurança.

Parâmetros de potencial de ação e várias propriedades de membrana podem ser calculados com base em gravações intracelulares quando condições estáveis de penetração celular são garantidas. A Figura 1A apresenta um potencial típico de ação ortodrómica evocado pela estimulação intracelular, que atende a todos os critérios de inclusão de dados (o potencial de membrana de repouso de pelo menos -50 mV, e a amplitude de pico superior a 50 mV, com uma superação positiva). Os pa...

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In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

Este protocolo descreve a gravação intracelular in vivo de motoneurons lombares de rato com estimulação simultânea de corrente trans-espinhal. O método permite medir as propriedades da membrana e registrar disparos rítmicos de motoneurons antes, durante e depois da polarização anodal ou catódal da medula espinhal.

In Vivo Intracelular Gravação de Motoneurons vertebrais de rato identificados tipo durante estimulação de corrente direta trans-espinhal

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological ...

Este protocolo utiliza gravações intracelulares de motoneurons espinhais, para investigar diretamente a influência da estimulação de corrente direta trans-espinhal na função das redes espinhais. A maior vantagem dessa técnica é que ela permite que gravações intracelulares sejam realizadas em sistema nervoso totalmente maduro. Facilitando a tradução das observações experimentais para aplicações práticas.Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, um rato Wistar macho anestesizado de seis meses de idade, use um microscópio dissecando e uma lâmina número 21, para fazer uma incisão longitudinal da pele do esterno para o queixo. E use dissecção contundente para expor a veia jugular certa. Coloque duas ligaduras 4-0 abaixo da seção da veia sem pontos de ramificação.E faça um nó solto na extremidade proximal do segmento da veia. E um nó solto na extremidade distal do segmento. Fixar a veia proximal ao coração, e ligar a extremidade distal da veia.Use uma tesoura de íris para fazer uma incisão entre o grampo e a ligadura distal. E, segurando um retalho da veia, introduza um cateter pré-preenchido ao ponto onde a veia é bloqueada pelo grampo. Em seguida, remova o grampo e empurre o cateter vários milímetros para dentro da veia.Para uma colocação de tubo traqueal, use fórceps contundentes para separar as duas glândulas mandibulares que cobrem os músculos esternonióides. E separar os músculos esternohióides na linha média, para expor a traqueia. Coloque três ligaduras de 4-0 abaixo da traqueia, e faça dois nós abaixo do ponto de inserção do tubo traqueal e um nó acima.Em seguida, insira um tubo traqueal na traqueia abaixo da terceira cartilagem traqueal. E fixe o tubo no lugar com as ligaduras pré-preparadas. Para dissecar os nervos do membro traseiro, use uma lâmina número 21 para fazer um corte longitudinal no lado posterior do membro traseiro esquerdo, do tendão de Aquiles até o quadril.E use uma tesoura para fazer um corte entre as regiões anterior e posterior da fossa popliteal, na parte de trás da articulação do joelho. Corte duas cabeças do bíceps femoris, para expor o nervo ciático. E separar a cabeça lateral da cabeça medial do músculo gastrocnemius, para expor o nervo tibial e seus ramos.Em seguida, use o número 55 fórceps, para dissecar cuidadosamente o gastrocnemius medial e os nervos gastrocnemius laterais e soleus. Desconectando-os dos tecidos circundantes, mantendo sua conexão com os respectivos músculos. Para realizar a laminectomia, use uma lâmina número 21 para fazer uma incisão longitudinal do sacro até as vértebras torácicas.E identificar a vértebra Th13, como um segmento torácico mais baixo com uma inserção da costela. Em seguida, use rongeurs finos para remover os processos espinhosos e laminae das vértebras de Th13 para as vértebras L2, para expor os segmentos lombares da medula espinhal. Para fixar a coluna vertebral, coloque o rato em uma estrutura feita sob medida em uma almofada de aquecimento Celsius de 37 graus, conectada a um sistema de aquecimento de loop fechado.E use os retalhos da pele para formar uma piscina profunda sobre a medula espinhal exposta. Coloque grampos metálicos abaixo dos processos transversais th12, e nos processos espinhosos L3, e encha a piscina com 37 graus Celsius de óleo mineral. Use os retalhos da pele para fazer uma piscina profunda de óleo mineral sobre os nervos tibial, gastrocnemius medial e gastrocnemius lateral e soleus.E coloque os nervos em fios de prata bipolar estimulando eletrodos. Em seguida, conecte os eletrodos a um estimulador de pulso quadrado usando canais de estimulação separados para cada nervo. Para uma colocação de eletrodos de superfície, sob o microscópio dissecando, coloque um eletrodo de bola de prata no lado esquerdo caudal da medula espinhal exposta.Com um eletrodo de referência inserido nos músculos das costas. E conecte ambos os eletrodos ao amplificador DC diferencial. Use um estimulador de corrente constante para estimular o gastrocnemius medial e os nervos gastrocnemius laterais e soleus, com pulsos quadrados de uma duração de 0,1 milissegundo repetida em uma frequência de três hertz e observar os voleios aferentes.No final da simulação, mova o eletrodo superficial rostrally, e repita a estimulação para identificar os segmentos espinhais em que as amplitudes das voleios são as mais altas para cada nervo. Depois de determinar a localização do voleio máximo, entregue um bloqueador neuromuscular por via intravenosa para paralisar o rato. Enquanto um assistente conecta o tubo traqueal a um ventilador externo em linha com um nominador de tampa compatível com roedores.Para abrir o dura e pia mater, use o número 55 fórceps para levantar suavemente a dura mater, e cortar o tecido caudally do segmento L5, rostrally até o segmento L4. Em seguida, use um par de fórceps ultra finos de 5SF, para fazer um pequeno patch na pia, cobrindo a coluna dorsal entre os vasos sanguíneos. Exatamente ao nível do voleio máximo diferente do gastrocnemius medial e gastrocnemius lateral e nervo soleus.Para colocar os eletrodos de estimulação de corrente direta trans-espinhal, coloque uma esponja salina encharcada no lado dorsal das vértebras de Th12. E use uma boa manipulação para pressionar a esponja com um eletrodo de estimulação de corrente trans-espinhal ativa. Em seguida, monte um microeletrodo combinado personalizado, no micro manipulador, permitindo um movimento de piso de um a dois mícticos e calibração estereotaxica.E dirija uma ponta de micropipette em um patch selecionado na pia, em um ângulo lateral medial de 15 a 20 graus. Para registrar a membrana de motoneuron e propriedades de disparo, no modo ponte do amplificador intracelular, estimular os respectivos ramos nervosos para identificar o motoneuron com base na aparência tudo ou nada, do potencial de ação antidrômica. No modo de fixação atual descontínua do amplificador intracelular com um modo de taxa de comutação atual de quatro a oito quilohertz, use um pulso de corrente intracelular de 0,5 milissegundos, para evocar um potencial de ação ortodôntica, no motoneuron.Para calcular a resistência à entrada da célula, estimule um motoneuron, com 40 pulsos curtos de 100 milissegundos de hiperpolarização de uma corrente de nanograma. Para determinar o valor real da base como a amplitude mínima da corrente despolarizadora necessária para provocar um único pico, estimule um motoneuron com pulsos de onda quadrada de 50 milissegundos em amplitudes crescentes. Em seguida, injete pulsos de onda quadrada de 500 milissegundos de corrente despolarizadora, aumentando as amplitudes.Em 0,1 a dois passos nano amp, para evocar descargas rítmicas de motoneurons. Para uma estimulação de corrente direta trans-espinhal, inicie os procedimentos de polarização por aplicação trans-espinhal de corrente direta, mantendo uma penetração estável do motoneuron. Aqui, um típico potencial de ação ortotrópica, evocado pela estimulação intracelular que atende a todos os critérios de inclusão de dados é mostrado.Nesta análise, uma resposta celular a um pulso de corrente hiperpolarizadora de 100 milissegundos de um nanograma. A partir do qual a resistência de entrada de pico e platô de um motoneuron, pode ser determinada a partir da deflexão de tensão, pode ser observada. Este traço de tensão expandida de um pico básico real, exibe um limiar de tensão claramente marcado do pico.Indicando o nível de despolarização da membrana em que os canais de sódio fechados de tensão são ativados para iniciar o potencial de ação. Estes gráficos fornecem exemplos de traços de tensão intracelular. De dois motoneurons, estimulados intracelularmente com pulsos quadrados de 500 milissegundos de corrente despolarizadora.Antes, durante e depois de uma aplicação de estimulação de corrente direta trans-espinhal. A estimulação de corrente trans-espinhal anodal foi encontrada para atuar em direção a uma maior excitabilidade do motoneuron e maiores frequências de disparo rítmico. Enquanto a estimulação de corrente trans-espinhal cathodal, atuou para disparar a inibição.Além disso, os efeitos de ambos os tipos de estimulação trans-espinhal direta da corrente, superaram o período de polarização. Dados imprecisos podem ser adquiridos, se os critérios de inclusão de dados forem comprometidos devido à penetração celular imperfeita. Falha em compensar a resistência e a capacitância da microeletrísmo ou uma instabilidade medular.É imperativo que nenhum dano seja causado à medula espinhal durante a dissecção, pois a lesão pode resultar em choque espinhal, impossibilitando novas gravações. É possível colher amostras de tecido para análises químicas histológicas ou imunocitológicas. Por exemplo, a medição da expressão c-fos pode ser usada como um proxy da atividade neuronal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrode Positioning and Montage in Transcranial Direct Current Stimulation

Posicionamento do eletrodo e Montage na estimulação transcraniana por corrente

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a technique that has been intensively investigated in the past decade as this method offers a ...

Neurociência

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Medindo Spinal pré-sináptica Inibição em Ratos por raiz dorsal Gravação Potencial<em&gt; In Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

A estimulação de corrente contínua e Multi-eletrodo de gravação matriz de perda de consciência em Ratos Cérebro Slice Preparação

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...

Remotely Supervised Transcranial Direct Current Stimulation: An Update on Safety and Tolerability

Remotamente controlados direta Transcranial estimulação atual: Uma atualização para a segurança e tolerabilidade

The remotely supervised tDCS (RS-tDCS) protocol enables participation from home through guided and monitored self-administration of tDCS treatment while ...

The Combined Use of Transcranial Direct Current Stimulation and Robotic Therapy for the Upper Limb

O uso combinado de terapia robótica e atual estimulação transcraniana direto para o membro superior

Neurologic disorders such as stroke and cerebral palsy are leading causes of long-term disability and can lead to severe incapacity and restriction of ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Transcraniana por corrente contínua estimulação (tDCS) em ratos

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Injeção direta de um vetor de Lentivirus destaca várias vias motoras na medula espinhal de ratos

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Stimulation Location Determination using a 3D Digitizer with High-Definition Transcranial Direct Current Stimulation

Determinação de localização de estimulação usando um digitalizador 3D com estimulação transcraniana de alta definição da corrente direta

The abundance of neuroimaging data and rapid development of machine learning has made it possible to investigate brain activation patterns. However, ...

Simultaneous Application of Transcranial Direct Current Stimulation during Virtual Reality Exposure

Aplicação simultânea de estimulação de corrente direta transcraniana durante exposição à realidade virtual

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a form of non-invasive brain stimulation that changes the likelihood of neuronal firing through ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) for Memory Enhancement

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS for Memory Enhancement

Estimulação de corrente direta transcraniana (tDCS) para aprimoramento da memória

Memory enhancement is one of the great challenges in cognitive neuroscience and neurorehabilitation. Among various techniques used for memory enhancement, ...