Name: in vivo intracellular recording of type-identified rat spinal motoneurons during trans-spinal direct current stimulation
Uploaded: 2020-05-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la subvención No 2017/25/B/NZ7/00373 del Centro Nacional de Ciencias. A los autores les gustaría reconocer el trabajo de Hanna Drzyma-a-Celichowska y W-odzimierz Mrówczy-ski, quienes contribuyeron a la recopilación de datos y al análisis de los resultados presentados en este documento.

Todos los procedimientos relacionados con este protocolo han sido aceptados por las autoridades competentes (por ejemplo, el Comité Local de ética) y siguen las normas nacionales e internacionales sobre bienestar y gestión de los animales.
NOTA: Cada participante involucrado en el procedimiento tiene que estar debidamente capacitado en procedimientos quirúrgicos básicos y tiene que tener una licencia válida para realizar experimentos con animales.
1. Anestesia y...

<ol>
	<li>Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ergogenic+Effects+of+Transcranial+Direct+Current+Stimulation+on+Exercise+Performance.">The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance.</a> Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).</li><li>Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+induces+lasting+fatigue+resistance+and+enhances+explosive+vertical+jump+performance.">Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance.</a> PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).</li><li>Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+(tsDCS)+selectively+inhibits+the+synaptic+efficacy+of+nociceptive+transmission+at+spinal+cord+level.">Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level.</a> Neuroscience. 393, 150-163 (2018).</li><li>Parazzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+current+density+generated+by+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+(tsDCS).">Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS).</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).</li><li>Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+study+of+feasibility+and+effect+of+anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+on+chronic+neuropathic+pain+after+spinal+cord+injury.">Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury.</a> Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).</li><li>G&#243;mez-Soriano, J., Meg&#237;a-Garc&#237;a, A., Serrano-Mu&#241;oz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+spinal+direct+current+simulation+for+spasticity+therapy+following+spinal+cord+injury:+mechanistic+insights+contributing+to+long-term+treatment+effects.">Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects.</a> The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).</li><li>de Ara&#250;jo, A. V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+anodal+transcranial+direct+current+stimulation+to+improve+muscle+strength+and+motor+functionality+after+incomplete+spinal+cord+injury:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis.</a> Spinal Cord. , (2020).</li><li>de Paz, R. H., Serrano-Mu&#241;oz, D., P&#233;rez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avenda&#241;o-Coy, J., G&#243;mez-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+transcranial+direct-current+stimulation+with+gait+training+in+patients+with+neurological+disorders:+a+systematic+review.">Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review.</a> Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gamma+and+alpha+spinal+motor+neurons+activity+by+trans-spinal+direct+current+stimulation:+effects+on+reflexive+actions+and+locomotor+activity.">Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity.</a> Physiological Reports. 4 (3), (2016).</li><li>Bolzoni, F., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+and+postsynaptic+effects+of+local+cathodal+DC+polarization+within+the+spinal+cord+in+anaesthetized+animal+preparations.">Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations.</a> The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).</li><li>Cogiamanian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+Spinal+Direct+Current+Stimulation.">Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation.</a> Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-spinal+direct+current+stimulation+alters+muscle+tone+in+mice+with+and+without+spinal+cord+injury+with+spasticity.">Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).</li><li>Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+long-lasting+subcortical+facilitation+by+transcranial+direct+current+stimulation+in+the+cat.">Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat.</a> The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).</li><li>Manuel, M., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha,+beta+and+gamma+motoneurons:+functional+diversity+in+the+motor+system's+final+pathway.">Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway.</a> Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).</li><li>Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+unit+recruitment+order+during+voluntary+and+electrically+induced+contractions+in+the+tibialis+anterior.">Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior.</a> Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).</li><li>Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+behaviour+of+motor+units+in+the+tibialis+anterior+during+voluntary+contractions.">Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions.</a> Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).</li><li>Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+properties+of+motoneurons+innervating+different+muscle+unit+types+in+rat+gastrocnemius.">Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius.</a> Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-spinal+direct+current+stimulation+modifies+spinal+cord+excitability+through+synaptic+and+axonal+mechanisms.">Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms.</a> Physiological Reports. 2 (9), (2014).</li><li>Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics,+high-frequency+oscillations,+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons.">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li><li>Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., K&#246;nig, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+limits+of+cathodal+transcranial+direct+current+stimulation+in+rats.">Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).</li><li>B&#261;czyk, M., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+direct+current+are+reproduced+by+intermittent+depolarization+of+myelinated+nerve+fibers.">Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).</li><li>B&#261;czyk, M., Drzyma&#322;a-Celichowska, H., Mr&#243;wczy&#324;ski, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motoneuron+firing+properties+are+modified+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats.">Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> Journal of Applied Physiology. 126 (5), 1232-1241 (2019).</li><li>B&#261;czyk, M., Drzyma&#322;a-Celichowska, H., Mr&#243;wczy&#324;ski, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+modifications+of+motoneuron+firing+properties+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats.">Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> European Journal of Neuroscience. , (2019).</li><li>Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+the+ratio+of+injected+current+to+electrode+area+tell+us+about+current+density+in+the+brain+during+tDCS.">What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).</li><li>Rahman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+effects+of+acute+direct+current+stimulation:+somatic+and+synaptic+terminal+effects.">Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects.</a> The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).</li><li>Bikson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+uniform+extracellular+DC+electric+fields+on+excitability+in+rat+hippocampal+slices+in+vitro.">Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro.</a> The Journal of Physiology. 557, 175-190 (2004).</li><li>Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+control+of+motor+outputs+by+intrinsic+and+externally+induced+electric+field+potentials.">Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).</li><li>Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-current+relationships+of+rat+hindlimb+alpha-motoneurones.">Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones.</a> The Journal of Physiology. 573, 663-677 (2006).</li></ol>

Si se realiza correctamente, la parte quirúrgica del protocolo descrito debe completarse en un plazo aproximado de tres horas. Uno debe tener especial cuidado en mantener condiciones fisiológicas estables de un animal durante la cirugía, en particular la temperatura corporal y la profundidad de la anestesia. Aparte de consideraciones éticas obvias, la falta de anestesia adecuada puede resultar en movimientos excesivos de las extremidades durante la disección nerviosa o laminectomía y conducir a daños en la prepara...

La estimulación de corriente directa trans-espinal (tsDCS) está ganando reconocimiento como un método potente para modificar la excitabilidad del circuito espinal en la salud y la enfermedad1,2,3. En esta técnica, se pasa una corriente constante entre un electrodo activo situado por encima de los segmentos espinales seleccionados, con un electrodo de referencia situado ventralmente o más rostralmente4. Varios estudios ya han confirmado que el tsDCS se puede utilizar en el manejo de ciertas condiciones patológicas, como el dolor neuropático5,la espasticidad6,la lesión de la médula espinal7 o para facilitar la rehabilitación8. Los investigadores sugieren que tsDCS evoca alteraciones en la distribución iónica entre el espacio intracelular y el espacio extracelular a través de la membrana celular, y esto puede facilitar o inhibir la actividad neuronal dependiendo de la orientación actual9,10,11. Sin embargo, hasta hace poco, faltaba una confirmación directa de esta influencia en las motoneurones.
Aquí, describimos un protocolo detallado para llevar a cabo el registro intracelular in vivo de potenciales eléctricos de motoneurones espinales lumbares en la rata anestesiada con aplicación simultánea de tsDCS, con el fin de observar cambios en la membrana de motoneuron y propiedades de disparo en respuesta a la polarización anodal o cathodal de la red neuronal espinal. Las grabaciones intracelulares abren varias áreas de investigación de las propiedades de las neuronas, no disponibles para las técnicas extracelulares utilizadas anteriormente9,,12. Por ejemplo, es posible medir con precisión la respuesta de voltaje de membrana de motoneuron al flujo de corriente directa inducido por tsDCS, indicar el umbral de voltaje para la generación de picos, o analizar los parámetros potenciales de acción. Además, esta técnica nos permite determinar las propiedades de la membrana pasiva del motoneurón, como la resistencia a la entrada, y observar la relación entre la corriente de estimulación intracelular y la frecuencia de cocción rítmica de motoneurones. La identificación antidrómica del motoneurón registrado, basada en la estimulación de los nervios identificados funcionalmente (es decir, los nervios que proporcionan aferentes a flexores o extensores) nos permite identificar adicionalmente tipos de unidades motoras inervadas (rápidas frente a lentas), lo que da la oportunidad de probar si la polarización influye de manera diferente en los elementos individuales del sistema neuronal espinal maduro. Debido a la extensa cirugía anterior al registro y a los altos requisitos de estabilidad y fiabilidad de las grabaciones, esta técnica es muy difícil, pero permite una evaluación directa y a largo plazo de las características electrofisiológicas de un motoneuron: antes, durante y después de la aplicación de tsDCS, lo que es crucial para determinar tanto sus acciones agudas como los efectos persistentes13. Como un motoneuron activa directamente las fibras musculares extrafusales14 y participa en el control de retroalimentación de una contracción muscular y fuerza desarrollada15,16 cualquier influencia observada de tsDCS en la unidad motora o propiedades contráctiles musculares pueden estar vinculadas a modulaciones de excitabilidad de motoneuron o características de disparo.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Durgs and solutions</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropinum sulfuricum</td>
			<td>Polfa Warszawa</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>346351</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106329</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium Jelfa</td>
			<td>PharmaSwiss/Valeant</td>
			<td>-</td>
			<td>Neuromuscular blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Biowet Pu&#322;awy Sp. z o.o</td>
			<td>-</td>
			<td>Main anesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium citrate</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>6100-05-06</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraspan</td>
			<td>Braun</td>
			<td>-</td>
			<td>HES solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical equipment</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 Blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>10021-00</td>
			<td>Scalpel blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cauterizer</td>
			<td>FST</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chest Tubes</td>
			<td>Mila</td>
			<td>CT1215</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11241-30</td>
			<td>Muscle forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Dura forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5F Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11255-20</td>
			<td>Nerve forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Pia forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11008-13</td>
			<td>Blunt forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11053-10</td>
			<td>Skin forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>FST</td>
			<td>13013-14</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeur</td>
			<td>FST</td>
			<td>16021-14</td>
			<td>For laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>Vein scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15002-08</td>
			<td>Dura scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14184-09</td>
			<td>For trachea cut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>104075-11</td>
			<td>Muscle scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-13</td>
			<td>Skin scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracheal tube</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vein catheter</td>
			<td>Vygon</td>
			<td>1261.201</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel cannulation forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>18403-11</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18320-11</td>
			<td>For vein clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Dilating Probe</td>
			<td>FST</td>
			<td>10160-13</td>
			<td>For vein dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugrgical materials</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel foam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>GTIN 00300090315085</td>
			<td>Hemostatic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4.0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-40</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 6.0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-60</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axoclamp 2B</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor</td>
			<td>CWE</td>
			<td>11-10000</td>
			<td>Gas analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grass S-88</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Constant current stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>507222F</td>
			<td>Heating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-DAM8A</td>
			<td>WPI</td>
			<td>74020</td>
			<td>Extracellular amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdrive</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement IVM/Scientifica</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Microelectrode puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAR-830/AP Small Animal Ventilator</td>
			<td>CWE</td>
			<td>12-02100</td>
			<td>Respirator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support frame</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinal clamps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TP-1 DC stimulator</td>
			<td>WiNUE</td>
			<td>-</td>
			<td>tsDCS stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B150-4 glass capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150-4</td>
			<td>For microelectrodes production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible tubing</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For respirator and CO2 analyzer connection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td>For filling micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For nerve electrodes</td>
		</tr>
	</tbody>
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in vivo intracellular recording of type-identified rat spinal motoneurons during trans-spinal direct current stimulation

El registro intracelular de motoneurones espinales in vivo proporciona un "estándar de oro" para determinar las características electrofisiológicas de las células en la red espinal intacta y posee ventajas significativas en relación con las técnicas clásicas de registro in vitro o extracelular. Una ventaja de las grabaciones intracelulares in vivo es que este método se puede realizar en animales adultos con un sistema nervioso completamente maduro, y por lo tanto muchos mecanismos fisiológicos observados se pueden traducir a aplicaciones prácticas. En este documento metodológico, describimos este procedimiento combinado con la estimulación de corriente constante aplicada externamente, que imita los procesos de polarización que ocurren dentro de las redes neuronales espinales. La estimulación de corriente directa trans-espinal (tsDCS) es un método innovador cada vez más utilizado como una intervención neuromoduladora en la rehabilitación después de diversas lesiones neurológicas, así como en deportes. La influencia de tsDCS en el sistema nervioso sigue siendo mal entendida y los mecanismos fisiológicos detrás de sus acciones son en gran parte desconocidos. La aplicación del tsDCS simultáneamente con grabaciones intracelulares nos permite observar directamente los cambios de las propiedades de la membrana del motoneurón y las características de la cocción rítmica en respuesta a la polarización de la red neuronal espinal, que es crucial para la comprensión de las acciones tsDCS. Por otra parte, cuando el protocolo presentado incluye la identificación del motoneuron con respecto a un músculo inervado y su función (flexor versus extensor) así como el tipo fisiológico (rápido versus lento) proporciona una oportunidad para investigar selectivamente la influencia de tsDCS en los componentes identificados del circuito espinal, que parecen verse afectados de manera diferente por la polarización. El procedimiento presentado se centra en la preparación quirúrgica para grabaciones intracelulares y estimulación con énfasis en los pasos que son necesarios para lograr la estabilidad de la preparación y la reproducibilidad de los resultados. Los detalles de la metodología de la aplicación anodal o cathodal tsDCS se discuten mientras se presta atención a cuestiones prácticas y de seguridad.

Los parámetros de los potenciales de acción y varias propiedades de membrana se pueden calcular sobre la base de grabaciones intracelulares cuando se aseguran condiciones estables de penetración celular. La Figura 1A presenta un potencial de acción ortodrómica típico evocado por la estimulación intracelular, que cumple con todos los criterios de inclusión de datos (el potencial de membrana en reposo de al menos -50 mV, y la amplitud del pico superior a 50 mV, con un exceso positivo)....

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In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

Este protocolo describe el registro intracelular in vivo de motoneurones lumbares de rata con estimulación simultánea de corriente directa trans-espinal. El método nos permite medir las propiedades de la membrana y registrar la cocción rítmica de motoneurones antes, durante y después de la polarización anodal o catódal de la médula espinal.

En Vivo Registro Intracelular de Motoneurones Espinales de Rata Tipo Identificados Durante estimulación de corriente directa trans-espinal

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological ...

Este protocolo utiliza grabaciones intracelulares de motoneurones espinales, para investigar directamente la influencia de la estimulación de corriente directa trans-espinal en la función de las redes espinales. La principal ventaja de esta técnica es que permite realizar grabaciones intracelulares en sistemas nerviosos completamente maduros. Facilitar la traducción de las observaciones experimentales a aplicaciones prácticas.Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, una rata Wistar macho anestesada de seis meses de edad, utilice un microscopio diseccionante y una hoja número 21, para hacer una incisión longitudinal de la piel desde el esternón hasta la barbilla. Y usa la disección contundente para exponer la vena yugular derecha. Coloque dos ligaduras de 4-0 debajo de la sección de la vena sin puntos de ramificación.Y haz un nudo suelto en el extremo proximal del segmento de la vena. Y un nudo suelto en el extremo distal del segmento. Sujeta la vena proximal al corazón y liga el extremo distal de la vena.Utilice tijeras de iris para hacer una incisión entre la abrazadera y la ligadura distal. Y, sosteniendo una solapa de la vena, introduzca un catéter precargado hasta el punto donde la vena está bloqueada por la abrazadera. A continuación, retire la abrazadera y empuje el catéter varios milímetros en la vena.Para una colocación de tubo traqueal, utilice fórceps contundentes para separar las dos glándulas mandibulares que cubren los músculos esternoideos. Y separar los músculos esternohoides en la línea media, para exponer la tráquea. Coloque tres ligaduras de 4-0 debajo de la tráquea y haga dos nudos por debajo del punto de inserción del tubo traqueal y un nudo arriba.A continuación, inserte un tubo tráqueo en la tráquea por debajo del tercer cartílago traqueal. Y fije el tubo en su lugar con las ligaduras pre-preparadas. Para diseccionar los nervios de las extremidades posteriores, utilice una hoja número 21 para hacer un corte longitudinal en el lado posterior de la extremidad posterior izquierda, desde el tendón de Aquiles hasta la cadera.Y usa tijeras para hacer un corte entre las regiones anterior y posterior de la fosa popliteal, en la parte posterior de la articulación de la rodilla. Corta dos cabezas del bíceps femoris, para exponer el nervio ciático. Y separar la cabeza lateral de la cabeza medial del músculo gastrocnemius, para exponer el nervio tibial y sus ramas.A continuación, utilice el número 55 fórceps, para diseccionar cuidadosamente el gastrocnemius medial y el gastrocnemius lateral y los nervios del soleo. Desconectarlos de los tejidos circundantes manteniendo su conexión con los respectivos músculos. Para realizar la laminectomía, utilice una hoja número 21 para hacer una incisión longitudinal desde el sacro hasta las vértebras torácicas.E identificar la vértebra Th13, como un segmento torácico más bajo con una inserción de costilla. Luego usa rongeurs finos para eliminar los procesos espinosos y las láminas de la Th13 a las vértebras L2, para exponer los segmentos lumbares de la médula espinal. Para fijar la columna vertebral, coloque la rata en un marco hecho a medida en una almohadilla de calentamiento de 37 grados Celsius, conectada a un sistema de calefacción de bucle cerrado.Y usa los colgajos de la piel para formar una piscina profunda sobre la médula espinal expuesta. Coloque abrazaderas metálicas por debajo de los procesos transversales Th12, y en los procesos espinosos L3, y llene la piscina con 37 grados Centígrados de aceite mineral. Usa las aletas de la piel para hacer una piscina profunda de aceite mineral sobre los nervios tibial, gastrocnemius medial y gastrocnemius lateral y soleus expuestos.Y coloque los nervios en electrodos estimulantes de alambre de plata bipolar. A continuación, conecte los electrodos a un estimulador de pulso cuadrado utilizando canales de estimulación separados para cada nervio. Para una colocación de electrodos de superficie, bajo el microscopio de disección, coloque un electrodo de bola de plata en el lado caudal izquierdo de la médula espinal expuesta.Con un electrodo de referencia insertado en los músculos de la espalda. Y conecte ambos electrodos al amplificador diferencial de CC. Utilice un estimulador de corriente constante para estimular el gastrocnemius medial y los nervios de gastrocnemius lateral y soleo, con pulsos cuadrados de una duración de 0,1 milisegundos repetidos a una frecuencia de tres hercios y observar las voleas aferentes.Al final de la simulación, mueva el electrodo de superficie rostralmente y repita la estimulación para identificar los segmentos espinales en los que las amplitudes de las voleas son las más altas para cada nervio. Después de determinar la ubicación de la volea máxima, entregue un bloqueador neuromuscular por vía intravenosa para paralizar la rata. Mientras que un asistente conecta el tubo traqueal a un respirador externo en línea con un nominador de tapa compatible con roedores.Para abrir la dura y la pia mater, utilice el número 55 fórceps para levantar suavemente la dura mater, y corte el tejido caudalmente desde el segmento L5, rostralmente hasta el segmento L4. Luego usa un par de fórceps 5SF ultra delgados, para hacer un pequeño parche en la pia, cubriendo la columna dorsal entre los vasos sanguíneos. Exactamente a nivel de la volea aferente máxima del gastrocnemius medial y el gastrocnemius lateral y el nervio soleus.Para colocar los electrodos de estimulación de corriente directa trans-espinal, coloque una esponja empapada de solución salina en el lado dorsal de las vértebras Th12. Y utilice la manipulación fina para presionar la esponja con un electrodo de estimulación de corriente directa trans-espinal activo. A continuación, monte un microelectrodo agrupado personalizado, en el micro manipulador, lo que permite un movimiento de paso de una a dos micras y calibración estereotaxia.Y conducir una punta de micropipeta en un parche seleccionado en la pia, en un ángulo lateral medial de 15 a 20 grados. Para registrar la membrana del motoneuron y las propiedades de disparo, en el modo puente del amplificador intracelular, estimular las respectivas ramas nerviosas para identificar la motoneuron sobre la base de la apariencia de todo o nada, del potencial de acción antidrómica. En el modo de abrazadera de corriente discontinua del amplificador intracelular con un modo de velocidad de conmutación de corriente de cuatro a ocho kilohercios, utilice un pulso de corriente despolarizante intracelular de 0,5 milisegundos, para evocar un potencial de acción de ortodoncia, en el motoneuron.Para calcular la resistencia de entrada celular, estimule un motoneuron, con 40 pulsos cortos de 100 milisegundos de hiperpolarización de una corriente de nanogramos. Para determinar el valor base real como la amplitud mínima de la corriente despolarizante necesaria para provocar un solo pico, estimule una motoneuron con pulsos de onda cuadrada de 50 milisegundos en amplitudes crecientes. A continuación, inyecte pulsos de onda cuadrada de 500 milisegundos de corriente despolarizante, a amplitudes crecientes.En 0.1 a dos pasos de nano amplificadores, para evocar descargas rítmicas de motoneurones. Para una estimulación de corriente directa trans-espinal, iniciar los procedimientos de polarización mediante la aplicación trans-espinal de corriente directa, manteniendo una penetración estable de la motoneuron. Aquí, se muestra un potencial de acción ortotrópico típico, evocado por la estimulación intracelular que cumple con todos los criterios para la inclusión de datos.En este análisis, una respuesta celular a un pulso de corriente hiperpolarizante de 100 milisegundos de un nanograma. A partir de la cual se puede observar tanto la resistencia de entrada de pico como de meseta de un motoneuron a partir de la desviación de voltaje. Esta traza de voltaje ampliada de un pico básico real, exhibe un umbral de voltaje claramente marcado del pico.Indicando el nivel de despolarización de membrana en el que se activan los canales de sodio cerrados de tensión para iniciar el potencial de acción. Estos gráficos proporcionan ejemplos de trazas de voltaje intracelular. A partir de dos motoneurones, estimulado intracelularmente con pulsos cuadrados de 500 milisegundos de corriente despolarizante.Antes, durante y después de una aplicación de estimulación de corriente directa trans-espinal. Se encontró que la estimulación de corriente directa trans-espinal anodal actúa hacia un aumento de la excitabilidad de motoneuron y frecuencias más altas de disparo rítmico. Mientras que la estimulación de corriente directa trans-espinal cathodal, actuó para evitar la inhibición de la cocción.Además, los efectos de ambos tipos de estimulación de corriente directa trans-espinal, duraron más que el período de polarización. Los datos inexactos pueden ser adquiridos, si los criterios de inclusión de datos se ven comprometidos debido a la penetración celular imperfecta. Un fracaso para compensar la resistencia y capacitancia del microelectrodo o una inestabilidad de la médula espinal.Es imperativo que no se dañe la médula espinal durante la disección, ya que la lesión puede resultar en shock espinal, haciendo que las grabaciones adicionales sean imposibles. Es posible recolectar muestras de tejido para un análisis químico histológico o inmunocito. Por ejemplo, la medición de la expresión c-fos se puede utilizar como proxy de actividad neuronal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrode Positioning and Montage in Transcranial Direct Current Stimulation

Colocación de los electrodos y montaje en estimulación transcraneal corriente continua

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a technique that has been intensively investigated in the past decade as this method offers a ...

Investigación

Neurociencias

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

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Medición de la columna vertebral presináptica inhibición en ratones mediante la raíz dorsal de grabación Potencial<em&gt; En Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

La estimulación de corriente directa y multi-electrodo matriz de registro de la actividad convulsiva en ratones cerebro rebanada preparación

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...

Remotely Supervised Transcranial Direct Current Stimulation: An Update on Safety and Tolerability

Remotamente bajo supervisión directa de Transcranial estímulo actual: Una actualización sobre la seguridad y tolerabilidad

The remotely supervised tDCS (RS-tDCS) protocol enables participation from home through guided and monitored self-administration of tDCS treatment while ...

The Combined Use of Transcranial Direct Current Stimulation and Robotic Therapy for the Upper Limb

El uso combinado de terapia robótica y estimulación de corriente directa de Transcranial para el miembro superior

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Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Estimulación por corriente directa transcraneal (tDCS) en ratones

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Inyección directa de un Vector lentivirales destaca múltiples caminos del Motor en la médula espinal de rata

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Stimulation Location Determination using a 3D Digitizer with High-Definition Transcranial Direct Current Stimulation

Determinación de la ubicación de estimulación mediante un digitalizador 3D con estimulación de corriente directa transcraneal de alta definición

The abundance of neuroimaging data and rapid development of machine learning has made it possible to investigate brain activation patterns. However, ...

Simultaneous Application of Transcranial Direct Current Stimulation during Virtual Reality Exposure

Aplicación simultánea de estimulación transcraneal de corriente continua durante la exposición a la realidad virtual

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a form of non-invasive brain stimulation that changes the likelihood of neuronal firing through ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) for Memory Enhancement

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS for Memory Enhancement

Estimulación transcraneal de corriente continua (tDCS) para mejorar la memoria

Memory enhancement is one of the great challenges in cognitive neuroscience and neurorehabilitation. Among various techniques used for memory enhancement, ...