Name: in vivo intracellular recording of type-identified rat spinal motoneurons during trans-spinal direct current stimulation
Uploaded: 2020-05-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Science Center-anslaget nr 2017/25/B/NZ7/00373. Författare skulle vilja erkänna arbete Hanna Drzymała-Celichowska och Włodzimierz Mrówczyński, som båda bidragit till datainsamling och analys av resultaten som presenteras i denna uppsats.

Alla förfaranden som är anslutna till detta protokoll har godtagits av lämpliga myndigheter (t.ex. lokala etikkommittén) och följer de nationella och internationella bestämmelserna om djurskydd och förvaltning.
OBS: Varje deltagare som deltar i förfarandet måste vara ordentligt utbildad i grundläggande kirurgiska ingrepp och måste ha en giltig licens för att utföra djurförsök.
1. Anestesi och premedicinering
<ol><li>Söva en råtta med intraperitone...

<ol>
	<li>Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ergogenic+Effects+of+Transcranial+Direct+Current+Stimulation+on+Exercise+Performance.">The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance.</a> Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).</li><li>Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+induces+lasting+fatigue+resistance+and+enhances+explosive+vertical+jump+performance.">Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance.</a> PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).</li><li>Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+(tsDCS)+selectively+inhibits+the+synaptic+efficacy+of+nociceptive+transmission+at+spinal+cord+level.">Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level.</a> Neuroscience. 393, 150-163 (2018).</li><li>Parazzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+current+density+generated+by+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+(tsDCS).">Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS).</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).</li><li>Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+study+of+feasibility+and+effect+of+anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+on+chronic+neuropathic+pain+after+spinal+cord+injury.">Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury.</a> Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).</li><li>G&#243;mez-Soriano, J., Meg&#237;a-Garc&#237;a, A., Serrano-Mu&#241;oz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+spinal+direct+current+simulation+for+spasticity+therapy+following+spinal+cord+injury:+mechanistic+insights+contributing+to+long-term+treatment+effects.">Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects.</a> The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).</li><li>de Ara&#250;jo, A. V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+anodal+transcranial+direct+current+stimulation+to+improve+muscle+strength+and+motor+functionality+after+incomplete+spinal+cord+injury:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis.</a> Spinal Cord. , (2020).</li><li>de Paz, R. H., Serrano-Mu&#241;oz, D., P&#233;rez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avenda&#241;o-Coy, J., G&#243;mez-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+transcranial+direct-current+stimulation+with+gait+training+in+patients+with+neurological+disorders:+a+systematic+review.">Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review.</a> Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gamma+and+alpha+spinal+motor+neurons+activity+by+trans-spinal+direct+current+stimulation:+effects+on+reflexive+actions+and+locomotor+activity.">Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity.</a> Physiological Reports. 4 (3), (2016).</li><li>Bolzoni, F., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+and+postsynaptic+effects+of+local+cathodal+DC+polarization+within+the+spinal+cord+in+anaesthetized+animal+preparations.">Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations.</a> The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).</li><li>Cogiamanian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+Spinal+Direct+Current+Stimulation.">Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation.</a> Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-spinal+direct+current+stimulation+alters+muscle+tone+in+mice+with+and+without+spinal+cord+injury+with+spasticity.">Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).</li><li>Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+long-lasting+subcortical+facilitation+by+transcranial+direct+current+stimulation+in+the+cat.">Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat.</a> The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).</li><li>Manuel, M., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha,+beta+and+gamma+motoneurons:+functional+diversity+in+the+motor+system's+final+pathway.">Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway.</a> Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).</li><li>Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+unit+recruitment+order+during+voluntary+and+electrically+induced+contractions+in+the+tibialis+anterior.">Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior.</a> Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).</li><li>Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+behaviour+of+motor+units+in+the+tibialis+anterior+during+voluntary+contractions.">Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions.</a> Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).</li><li>Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+properties+of+motoneurons+innervating+different+muscle+unit+types+in+rat+gastrocnemius.">Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius.</a> Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).</li><li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-spinal+direct+current+stimulation+modifies+spinal+cord+excitability+through+synaptic+and+axonal+mechanisms.">Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms.</a> Physiological Reports. 2 (9), (2014).</li><li>Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics,+high-frequency+oscillations,+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons.">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li><li>Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., K&#246;nig, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+limits+of+cathodal+transcranial+direct+current+stimulation+in+rats.">Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).</li><li>B&#261;czyk, M., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+direct+current+are+reproduced+by+intermittent+depolarization+of+myelinated+nerve+fibers.">Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).</li><li>B&#261;czyk, M., Drzyma&#322;a-Celichowska, H., Mr&#243;wczy&#324;ski, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motoneuron+firing+properties+are+modified+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats.">Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> Journal of Applied Physiology. 126 (5), 1232-1241 (2019).</li><li>B&#261;czyk, M., Drzyma&#322;a-Celichowska, H., Mr&#243;wczy&#324;ski, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+modifications+of+motoneuron+firing+properties+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats.">Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> European Journal of Neuroscience. , (2019).</li><li>Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+the+ratio+of+injected+current+to+electrode+area+tell+us+about+current+density+in+the+brain+during+tDCS.">What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).</li><li>Rahman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+effects+of+acute+direct+current+stimulation:+somatic+and+synaptic+terminal+effects.">Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects.</a> The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).</li><li>Bikson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+uniform+extracellular+DC+electric+fields+on+excitability+in+rat+hippocampal+slices+in+vitro.">Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro.</a> The Journal of Physiology. 557, 175-190 (2004).</li><li>Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+control+of+motor+outputs+by+intrinsic+and+externally+induced+electric+field+potentials.">Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).</li><li>Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-current+relationships+of+rat+hindlimb+alpha-motoneurones.">Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones.</a> The Journal of Physiology. 573, 663-677 (2006).</li></ol>

Om den utförs korrekt, bör den kirurgiska delen av det beskrivna protokollet slutföras inom cirka tre timmar. Man bör vara särskilt noga med att upprätthålla stabila fysiologiska förhållanden hos ett djur under operationen, i synnerhet kroppstemperatur och djup anestesi. Bortsett från uppenbara etiska överväganden, kan en brist på korrekt anestesi resultera i överdriven lem rörelser under nerv dissekering eller laminectomy och leda till skador på preparatet eller en för tidig experiment uppsägning. Vid ...

Trans-spinal direct current stimulation (tsDCS) vinner erkännande som en potent metod för att modifiera spinal krets retbarhet i hälsa och sjukdom1,2,3. I denna teknik, en konstant ström skickas mellan en aktiv elektrod som ligger ovanför utvalda spinal segment, med en referenselektrod belägen antingen ventrally eller mer rostrally4. Flera studier har redan bekräftat att tsDCS kan användas vid hantering av vissa patologiska tillstånd, såsom neuropatisksmärta 5, spasticitet6, ryggmärgsskada7 eller för att underlätta rehabilitering8. Forskare föreslår att tsDCS framkallar förändringar i jonfördelningen mellan det intracellulära och det extracellulära utrymmet över cellmembranet, och detta kan antingen underlätta eller hämma neuronal aktivitet beroende på den nuvarandeinriktningen 9,10,11. Men tills nyligen, en direkt bekräftelse av detta inflytande på motoneurons saknades.
Här beskriver vi ett utförligt protokoll för att genomföra in vivo intracellulära registrering av elektriska potentialer från ryggradens spinal motoneurons i den sövda råttan med samtidig tillämpning av tsDCS, i syfte att observera förändringar i motoneuron membran och bränning egenskaper som svar på anodal eller cathodal polarisation av spinal neuronala nätverket. Intracellulära inspelningar öppna flera områden av utredning av neuron egenskaper, otillgänglig för tidigare använt extracelluläratekniker 9,12. Till exempel är det möjligt att exakt mäta motoneuron membran spänningsrespons på direktströmsflöde som induceras av tsDCS, för att indikera spänningströskel för spike generation, eller att analysera åtgärder potentiella parametrar. Dessutom gör denna teknik oss att bestämma motoneuron passiva membran egenskaper, såsom ingångsmotstånd, och att observera förhållandet mellan intracellulär stimuleringsström och frekvens av rytmisk bränning av motoneurons. Antidromic identifiering av inspelade motoneuron, baserat på stimulering av funktionellt identifierade nerver (dvs. nerver ger efferents till flexors eller extensors) tillåter oss att dessutom identifiera typer av innervated motor enheter (snabb kontra långsam), vilket ger en möjlighet att testa om polarisering påverkar olika enskilda delar av mogna spinal neuronala systemet. På grund av omfattande kirurgi föregår inspelningen och höga krav på stabilitet och tillförlitlighet av inspelningar, är denna teknik mycket utmanande men tillåter direkt och långsiktig bedömning av elektrofysiologiska egenskaper hos en motoneuron: före, under och efter tillämpning av tsDCS, som är avgörande för att avgöra både dess akuta åtgärder och långlivade effekter13. Som en motoneuron direkt aktiverar extrafusal muskelfibrer14 och tar del i återkoppling kontroll av en muskelkontraktion och utvecklat kraft15,16 någon observerad påverkan av tsDCS på motorenheten eller muskel kontraktil egenskaper kan kopplas till modulationer av motoneuron retbarhet eller bränning egenskaper.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Durgs and solutions</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropinum sulfuricum</td>
			<td>Polfa Warszawa</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>346351</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106329</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium Jelfa</td>
			<td>PharmaSwiss/Valeant</td>
			<td>-</td>
			<td>Neuromuscular blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Biowet Pu&#322;awy Sp. z o.o</td>
			<td>-</td>
			<td>Main anesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium citrate</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>6100-05-06</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraspan</td>
			<td>Braun</td>
			<td>-</td>
			<td>HES solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical equipment</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 Blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>10021-00</td>
			<td>Scalpel blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cauterizer</td>
			<td>FST</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chest Tubes</td>
			<td>Mila</td>
			<td>CT1215</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11241-30</td>
			<td>Muscle forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Dura forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5F Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11255-20</td>
			<td>Nerve forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Pia forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11008-13</td>
			<td>Blunt forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11053-10</td>
			<td>Skin forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>FST</td>
			<td>13013-14</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeur</td>
			<td>FST</td>
			<td>16021-14</td>
			<td>For laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>Vein scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15002-08</td>
			<td>Dura scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14184-09</td>
			<td>For trachea cut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>104075-11</td>
			<td>Muscle scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-13</td>
			<td>Skin scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracheal tube</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vein catheter</td>
			<td>Vygon</td>
			<td>1261.201</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel cannulation forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>18403-11</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18320-11</td>
			<td>For vein clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Dilating Probe</td>
			<td>FST</td>
			<td>10160-13</td>
			<td>For vein dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugrgical materials</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel foam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>GTIN 00300090315085</td>
			<td>Hemostatic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4.0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-40</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 6.0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-60</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axoclamp 2B</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor</td>
			<td>CWE</td>
			<td>11-10000</td>
			<td>Gas analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grass S-88</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Constant current stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>507222F</td>
			<td>Heating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-DAM8A</td>
			<td>WPI</td>
			<td>74020</td>
			<td>Extracellular amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdrive</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement IVM/Scientifica</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Microelectrode puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAR-830/AP Small Animal Ventilator</td>
			<td>CWE</td>
			<td>12-02100</td>
			<td>Respirator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support frame</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinal clamps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TP-1 DC stimulator</td>
			<td>WiNUE</td>
			<td>-</td>
			<td>tsDCS stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B150-4 glass capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150-4</td>
			<td>For microelectrodes production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible tubing</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For respirator and CO2 analyzer connection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td>For filling micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For nerve electrodes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo intracellular recording of type-identified rat spinal motoneurons during trans-spinal direct current stimulation

Intracellulära inspelning av spinal motoneurons in vivo ger en "guldmyntfot" för att bestämma cellernas elektrofysiologiska egenskaper i intakt spinal nätverket och har betydande fördelar i förhållande till klassisk in vitro eller extracellulära inspelningstekniker. En fördel med in vivo intracellulära inspelningar är att denna metod kan utföras på vuxna djur med ett fullt moget nervsystem, och därför kan många observerade fysiologiska mekanismer översättas till praktiska tillämpningar. I denna metodologiska papper beskriver vi detta förfarande i kombination med externt tillämpas konstant ström stimulering, som härmar polarisering processer som förekommer inom spinal neuronala nätverk. Trans-spinal direct current stimulation (tsDCS) är en innovativ metod som alltmer används som en neuromodulatorisk intervention i rehabilitering efter olika neurologiska skador samt inom idrott. Påverkan av tsDCS på nervsystemet förblir dåligt förstådd och de fysiologiska mekanismerna bakom dess handlingar är till stor del okända. Tillämpningen av tsDCS samtidigt med intracellulära inspelningar gör det möjligt för oss att direkt observera förändringar av motoneuron membran egenskaper och egenskaper rytmisk bränning som svar på polariseringen av spinal neuronala nätverket, vilket är avgörande för förståelsen av tsDCS åtgärder. Dessutom, när det presenterade protokollet omfattar identifiering av motoneuron med avseende på en innervated muskel och dess funktion (flexor kontra extensor) samt den fysiologiska typen (snabb kontra långsam) det ger en möjlighet att selektivt undersöka påverkan av tsDCS på identifierade komponenter i spinal kretsar, som verkar vara annorlunda påverkas av polarisering. Det presenterade förfarandet fokuserar på kirurgiska förberedelser för intracellulära inspelningar och stimulering med tonvikt på de steg som är nödvändiga för att uppnå förberedelse stabilitet och reproducerbarhet av resultat. Detaljerna i metodiken för anodal- eller cathodal tsDCS-applikationen diskuteras samtidigt som man uppmärksammar praktiska frågor och säkerhetsfrågor.

Parametrar för aktionspotentialer och flera membranegenskaper kan beräknas på basis av intracellulära inspelningar när stabila förhållanden för cellgenomträngning säkerställs. Figur 1A presenterar en typisk orthodromic åtgärder potential framkallas av intracellulära stimulering, som uppfyller alla kriterier för data integration (den vilande membran potentialen på minst -50 mV, och spike amplitud högre än 50 mV, med en positiv överskridande). Åtgärd potentiella parametrar...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation at JoVE.com

In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

Detta protokoll beskriver in vivo intracellulära inspelningen av råtta ländryggen motoneurons med samtidig trans-spinal direkt nuvarande stimulering. Metoden gör det möjligt för oss att mäta membranegenskaper och att registrera rytmisk bränning av motoneuroner före, under och efter anodal eller katodalpolarisering av ryggmärgen.

In Vivo Intracellulär inspelning av typidentifierade Rat Spinal Motoneurons Under Trans-Spinal Direct Current Stimulation

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological ...

Detta protokoll använder intracellulära inspelningar av spinal motoneurons, att direkt undersöka påverkan av trans-spinal direktström stimulans på funktionen av spinal nätverk. Den stora fördelen med denna teknik är att det gör att intracellulära inspelningar som ska utföras på fullt mogna nervsystemet. Underlätta översättning av de experimentella observationerna till praktiska tillämpningar.Efter att ha bekräftat en brist på svar på pedal reflex, en sövd sex månader gammal manlig Wistar råtta, använda en dissekera mikroskop och ett nummer 21 blad, att göra en längsgående hud snitt från bröstbenet till hakan. Och använd trubbig dissektion för att exponera rätt halsven. Placera två, 4-0 ligaturer under den del av venen utan förgreningspunkter.Och gör en lös knut på den proximala änden av vensegmentet. Och en lös knut på den distala änden av segmentet. Kläm venen proximala till hjärtat, och ligate den distala änden av venen.Använd iris sax för att göra ett snitt mellan klämman och den distala ligaturen. Och, som håller en flik av venen, införa en förfylld kateter till den punkt där venen blockeras av klämman. Ta sedan bort klämman och tryck katetern flera millimeter in i venen.För en trakeal röret placering, använd trubbiga tlykningar för att separera de två mandibular körtlar som täcker sternohyoid musklerna. Och separera sternohyoid musklerna vid mittlinjen, för att exponera luftstrupen. Placera tre, 4-0 ligaturer under luftstrupen, och gör två knutar under trakeal röret insättningspunkten och en knut ovan.Sätt sedan in ett trakealrör i luftstrupen nedanför det tredje luftstrupsbrosket. Och säkra röret på plats med de förberedda ligaturerna. För att dissekera bakbenen nerver, använd ett nummer 21 blad för att göra en längsgående snitt på den bakre sidan av den vänstra bakbenen, från hälsenan till höften.Och använd sax för att göra ett snitt mellan de främre och bakre regionerna i popliteal fossa, på baksidan av knäleden. Skär två huvuden av biceps femoris, att exponera den sciatic nerv. Och separera laterala huvudet från den mediala huvudet av gastrocnemius muskeln, att exponera tibial nerv och dess grenar.Använd sedan nummer 55-forceps, för att noggrant dissekera den mediala gastrocnemius och de laterala gastrocnemius- och soleusnerverna. Koppla bort dem från de omgivande vävnaderna samtidigt som deras anslutning till respektive av muskler. För att utföra laminektomi, använd ett nummer 21 blad för att göra ett längsgående snitt från korsbenet upp till bröstkotorna.Och identifiera Th13 kotan, som ett lägsta bröst segment med en revben insättning. Använd sedan fina rongeurs för att ta bort de spinösa processerna och laminae från Th13 till L2-kotorna, för att exponera ländryggssegmenten i ryggmärgen. För att fixera kotpelaren, placera råttan i en skräddarsydd ram på en 37 grader Celsius värmedyna, ansluten till ett slutet kretslopp värmesystem.Och använd hudflikarna för att bilda en djup pool över den exponerade ryggmärgen. Placera metallklämmor under Th12 tvärprocesser, och vid L3 spinous processer, och fyll poolen med 37 grader Celsius mineralolja. Använd huden klaffar för att göra en djup pool av mineralolja över den exponerade tibial, mediala gastrocnemius och laterala gastrocnemius och soleus nerver.Och placera nerverna på bipolär silvertråd stimulerande elektroder. Anslut sedan elektroderna till en kvadratisk pulsstimulator med hjälp av separata stimuleringskanaler för varje nerv. För en ytelektrodplacering, under det dissekerande mikroskopet, placerar du en silverkulelektrod på den vänstra caudalsidan av den exponerade ryggmärgen.Med en referenselektrod insatt i ryggmusklerna. Och koppla båda elektroderna till differential-DC-förstärkaren. Använd en konstant ström stimulator för att stimulera den mediala gastrocnemius och laterala gastrocnemius och soleus nerver, med kvadratiska pulser av en 0,1 millisekunder varaktighet upprepas vid en tre hertz frekvens och observera afferent volleys.I slutet av simuleringen, flytta ytan elektrod rostrally, och upprepa stimulering för att identifiera spinal segment där amplituderna av volleys är den högsta för varje nerv. Efter fastställande av placeringen av den maximala volley, leverera en neuromuskulär blockerare intravenöst att förlama råttan. Medan en assistent ansluter trakealröret till en extern ventilator i linje med en gnagare kompatibel cap nominator.För att öppna dura och pia mater, använd nummer 55 pinjare för att försiktigt lyfta dura mater, och skär vävnaden caudally från L5-segmentet, rostrally upp till L4-segmentet. Använd sedan ett par ultratunna 5SF-pinjer, för att göra ett litet plåster i pia, som täcker dorsalkolonnen mellan blodkärlen. Exakt på nivån för den maximala afferent volley från den mediala gastrocnemius och laterala gastrocnemius och soleus nerv.För att placera trans-spinal direct current stimulering elektroder, placera en saltlösning indränkt svamp på dorsala sidan av Th12 kotor. Och använd fin manipulation för att trycka på svampen med en aktiv trans-spinal direktströmsstimuleringselektrod. Montera sedan en anpassad poolad mikroelektrod, på mikro manipulatorn, vilket gör att en en till två micron stegrörelse och stereotaxisk kalibrering.Och kör en mikropipette spets i en vald patch i pia, på en 15 till 20 graders mediala laterala vinkel. För att registrera motoneuronmembranet och bränningsegenskaperna, i den intracellulära förstärkarens bryggläge, stimulerar de respektive nervgrenarna att identifiera motoneuron på grundval av det allt eller inget utseende, av den antidromiska aktionspotentialen. I den diskontinuerliga nuvarande klämma läge av den intracellulära förstärkaren med en ström switch rate mode fyra till åtta kilohertz, använd en 0,5 millisekunder intracellulära depolariserande strömpulser, att framkalla en ortodontisk åtgärd potential, i motoneuron.För att beräkna cellen inmatningsbeständighet, stimulera en motoneuron, med 40 korta 100 millisekunder pulser hyperpolariserande en nanogram ström. För att bestämma det verkliga basvärdet som den minsta amplituden av depolariserande ström som krävs för att framkalla en enda spik, stimulera en motoneuron med 50 millisekunder fyrkantsvågpulser vid ökande amplituder. Injicera sedan 500 millisekunders fyrkantsvågpulser av depolariserande ström, vid ökande amplituder.I 0,1 till två nano amp steg, att framkalla rytmiska urladdningar av motoneurons. För en trans-spinal direktströmsstimulering, starta polariseringsförfarandena genom trans-spinal tillämpning av direktström, samtidigt som en stabil penetration av motoneuronen bibehålls. Här visas en typisk ortoptropisk aktionspotential, framkallad av intracellulär stimulering som uppfyller alla kriterier för dataintegration.I denna analys, en cell svar på en 100 millisekkunder hyperpolariserande ström puls av ett nanogram. Från vilken både toppen och platå ingångsmotståndet hos en motoneuron, kan bestämmas från spänningens avböjning, kan observeras. Detta utvidgade spänningsspår av en verklig grundläggande spik, uppvisar en tydligt markerad spänningströskel av spiken.Som anger nivån av membrandepolarisering vid vilken spänning gated natriumkanaler aktiveras för att initiera åtgärden potential. Dessa grafer ger exempel på intracellulära spänningsspår. Från två motoneuroner, stimuleras intracellulärt med 500 millisekunder kvadratpulser av depolariserande ström.Före, under, och efter en trans-spinal direktström stimulering ansökan. Anodal trans-spinal direkt nuvarande stimulering konstaterades att agera mot en ökad motoneuron retbarhet och högre frekvenser av rytmiska bränning. Medan katodal trans-spinal direkt ström stimulering, agerade mot mot bränning hämning.Dessutom, effekterna av båda typerna av trans-spinal direktström stimulering, outlasted perioden av polarisering. Felaktiga uppgifter kan förvärvas, om datainklusionskriterierna äventyras på grund av ofullkomlig cellpenetration. Ett misslyckande att kompensera mikroelektrodresistensen och kapacitansen eller en ryggrads- instabilitet.Det är absolut nödvändigt att ingen skada görs på ryggmärgen under dissekering som skada kan resultera i spinal chock, vilket gör ytterligare inspelningar omöjligt. Det är möjligt att skörda vävnadsprover för ytterligare histologisk eller immunocyt kemisk analys. Till exempel kan mätningen av C-FOS uttryck användas som en proxy av neuronal aktivitet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrode Positioning and Montage in Transcranial Direct Current Stimulation

Elektrod Positionering och Montage i Transkraniell likström stimulering

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a technique that has been intensively investigated in the past decade as this method offers a ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Mätning Spinal Presynaptiska Hämning i möss genom Rygg-rota Potential inspelning<em&gt; In Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Likström stimulering och Multi-elektrod Array Registrering av krampliknande symtom hos möss Brain skiva beredning

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...

Remotely Supervised Transcranial Direct Current Stimulation: An Update on Safety and Tolerability

Distans övervakade Transcranial Direct nuvarande stimulering: En uppdatering på säkerhet och tolerabilitet

The remotely supervised tDCS (RS-tDCS) protocol enables participation from home through guided and monitored self-administration of tDCS treatment while ...

The Combined Use of Transcranial Direct Current Stimulation and Robotic Therapy for the Upper Limb

Den kombinerade användningen av Transcranial Direct nuvarande stimulering och robotliknande terapi för övre extremiteten

Neurologic disorders such as stroke and cerebral palsy are leading causes of long-term disability and can lead to severe incapacity and restriction of ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Transcranial Direct Current stimulering (TDC) hos möss

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Direktinsprutning av en Lentiviral vektor belyser flera motoriska vägar i råtta ryggmärgen

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Stimulation Location Determination using a 3D Digitizer with High-Definition Transcranial Direct Current Stimulation

Stimulering platsbestämning med hjälp av en 3D-digitizer med högupplöst transcranial rikta ström stimulering

The abundance of neuroimaging data and rapid development of machine learning has made it possible to investigate brain activation patterns. However, ...

Simultaneous Application of Transcranial Direct Current Stimulation during Virtual Reality Exposure

Samtidig tillämpning av transkraniell likströmsstimulering under virtual reality-exponering

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a form of non-invasive brain stimulation that changes the likelihood of neuronal firing through ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) for Memory Enhancement

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS for Memory Enhancement

Transkraniell direktströmsstimulering (tDCS) för minnesförbättring

Memory enhancement is one of the great challenges in cognitive neuroscience and neurorehabilitation. Among various techniques used for memory enhancement, ...