Name: improved uplc-uv method for the quantification of vitamin c in lettuce varieties (lactuca sativa l.) and crop wild relatives (lactuca spp.)
Uploaded: 2020-06-30T13:00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp. at JoVE.com

ونعترف بامتنان بنك جرثومبلاس النباتي في سرقسطة (BGHZ-CITA، إسبانيا) ومركز الموارد الوراثية (CNG، واغينغن، هولندا) لتوريد البذور اللازمة لهذا العمل. نشكر ج. أ. أرانجويلو، أ. كاستيانوس و"مختبر الفُرْقِة" من CITA على الدعم التقني، وD. L. Goodchild لاستعراض اللغة الإنجليزية. وقد تم تمويل هذا العمل من المشروعين RTA2017-00093-00-00 من المعهد الوطني للبحوث الزراعية والغذائية والتكنولوجيا (INIA) LMP164_18 من حكومة أراغون؛ والبرنامج التشغيلي فيدر أراغون 2014-2020 والصندوق الاجتماعي الأوروبي من الاتحاد الأوروبي [Grupos Consolidados A12-17R: "Grupo de investigación en fruticultura: caracterización, adaptación y mejora genéica" و A14-17R: "Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles" (SAGAS)]. وقد تم دعم I.M.L. بعقد ما قبل الدكتوراه لتدريب الأطباء من وزارة العلوم والابتكار والجامعات الإسبانية (MCIU) والوكالة الإسبانية للبحوث الحكومية (AEI).

<ol>
	<li>Llorach, R., Mart&#237;nez-S&#225;nchez, A., Tom&#225;s-Barber&#225;n, F. A., Gil, M. I., Ferreres, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+polyphenols+and+antioxidant+properties+of+five+lettuce+varieties+and+escarole.">Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole.</a> Food Chemistry. 108 (3), 1028-1038 (2008).</li><li>Carr, A. C., Frei, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+new+recommended+dietary+allowance+for+vitamin+C+based+on+antioxidant+and+health+effects+in+humans.">Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 69 (6), 1086-1107 (1999).</li><li>Carr, A. C., Vissers, M. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+or+food-derived+vitamin+C-Are+they+equally+bioavailable.">Synthetic or food-derived vitamin C-Are they equally bioavailable.</a> Nutrients. 5 (11), 4284-4304 (2013).</li><li>Lee, S. K., Kader, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preharvest+and+postharvest+factors+influencing+vitamin+C+content+of+horticultural+crops.">Preharvest and postharvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops.</a> Postharvest Biology and Technology. 20 (3), 207-220 (2000).</li><li>Shekhovtsova, T. N., Muginova, S. V., Luchinina, J. A., Galimova, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+methods+in+food+analysis:+determination+of+ascorbic+acid.">Enzymatic methods in food analysis: determination of ascorbic acid.</a> Analytica Chimica Acta. 573-574, 125-132 (2006).</li><li>Zhan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+exposure+during+storage+preserving+soluble+sugar+and+L-ascorbic+acid+content+of+minimally+processed+romaine+lettuce+(Lactuca+sativa+L.var.+longifolia).">Light exposure during storage preserving soluble sugar and L-ascorbic acid content of minimally processed romaine lettuce (Lactuca sativa L.var. longifolia).</a> Food Chemistry. 136 (1), 273-278 (2013).</li><li>Malejane, D. N., Tinyani, P., Soundy, P., Sultanbawa, Y., Sivakumar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficit+irrigation+improves+phenolic+content+and+antioxidant+activity+in+leafy+lettuce+varieties.">Deficit irrigation improves phenolic content and antioxidant activity in leafy lettuce varieties.</a> Food Science and Nutrition. 6 (2), 334-341 (2017).</li><li>Tarrago-Trani, M. T., Phillips, K. M., Cotty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-specific+method+validation+for+quantitative+analysis+of+vitamin+C+in+diverse+foods.">Matrix-specific method validation for quantitative analysis of vitamin C in diverse foods.</a> Journal of Food Composition and Analysis. 26 (1-2), 12-25 (2012).</li><li>Klimczak, I., Gliszczy&#324;ska-&#346;wig&#322;o, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+UPLC+and+HPLC+methods+for+determination+of+vitamin+C.">Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C.</a> Food Chemistry. 175, 100-105 (2015).</li><li>Z&#322;otek, U., &#346;wieca, M., Jakubczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+abiotic+elicitation+on+main+health-promoting+compounds,+antioxidant+activity+and+commercial+quality+of+butter+lettuce+(Lactuca+sativa+L.).">Effect of abiotic elicitation on main health-promoting compounds, antioxidant activity and commercial quality of butter lettuce (Lactuca sativa L.).</a> Food Chemistry. 148, 253-260 (2014).</li><li>Koh, E., Charoenprasert, S., Mitchell, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+organic+and+conventional+cropping+systems+on+ascorbic+acid,+vitamin+C,+flavonoids,+nitrate,+and+oxalate+in+27+varieties+of+spinach+(Spinacia+oleracea+L).">Effect of organic and conventional cropping systems on ascorbic acid, vitamin C, flavonoids, nitrate, and oxalate in 27 varieties of spinach (Spinacia oleracea L).</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (12), 3144-3150 (2012).</li><li>Ka&#322;uzewicz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+short-term+storage+on+the+content+of+flavonoids+and+vitamin+C+in+Broccoli.">The influence of short-term storage on the content of flavonoids and vitamin C in Broccoli.</a> European Journal of Horticultural Science. 77 (3), 137-143 (2012).</li><li>van Treuren, R., van Eekelen, H. D. L. M., Wehrens, R., de Vos, R. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+variation+in+the+lettuce+gene+pool:+towards+healthier+crop+varieties+and+food.">Metabolite variation in the lettuce gene pool: towards healthier crop varieties and food.</a> Metabolomics. 14 (11), 1-14 (2018).</li><li>Swartz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPLC:+An+introduction+and+review.">UPLC: An introduction and review.</a> Journal of Liquid Chromatography &amp; Related Technologies. 28 (7), 1253-1263 (2005).</li><li>Sp&#237;nola, V., Mendes, B., C&#226;mara, J. S., Castilho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+and+fast+UHPLC-PDA+methodology+for+determination+of+L-ascorbic+and+dehydroascorbic+acids+in+fruits+and+vegetables.+Evaluation+of+degradation+rate+during+storage.">An improved and fast UHPLC-PDA methodology for determination of L-ascorbic and dehydroascorbic acids in fruits and vegetables. Evaluation of degradation rate during storage.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (4), 1049-1058 (2012).</li><li>Ball, G. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Water-soluble vitamin assays in human nutrition. , (1994).</li><li>Bertol&#237;n, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+carotenoids,+tocopherols,+retinol+and+cholesterol+in+ovine+lyophilised+samples+of+milk,+meat,+and+liver+and+in+unprocessed/raw+samples+of+fat.">Simultaneous determination of carotenoids, tocopherols, retinol and cholesterol in ovine lyophilised samples of milk, meat, and liver and in unprocessed/raw samples of fat.</a> Food Chemistry. 257, 182-188 (2018).</li><li>Sp&#237;nola, V., Llorent-Mart&#237;nez, E. J., Castilho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+vitamin+C+in+foods:+Current+state+of+method+validation.">Determination of vitamin C in foods: Current state of method validation.</a> Journal of Chromatography A. 1369, 2-17 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=radiation+is+beneficial+for+yield+and+quality+of+indoor+cultivated+lettuce.">radiation is beneficial for yield and quality of indoor cultivated lettuce.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1-10 (2019).</li><li>Damerum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+genetic+basis+of+antioxidant+status+in+lettuce+(Lactuca+sativa).">Elucidating the genetic basis of antioxidant status in lettuce (Lactuca sativa).</a> Horticulture Research. 2 (15055), 1-13 (2015).</li></ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

فيتامين ج هو عنصر غذائي مهم جدا، لكنه مركب لتيل جدا جدا، لذلك له UPLC-الأشعة فوق البنفسجية الكم يعتمد على عوامل متعددة، مثل تخزين العينة وإعداد، وطريقة الاستخراج والظروف الكروماتوغرافي. لذلك، كان هناك حاجة إلى إجراء سريع وبسيط لمنع AA (مع قوة مضادة للأكسدة) أكسدة إلى DHAA (بدون خصائص مضادة للأكسدة). وكان من الضروري أيضا تجنب ارتفاع درجة الحرارة ودرجة الحرارة الظروف، فضلا عن الضوء الشديد والغلاف الجوي المؤكد أثناء العلاج عينة لتعزيز استقرار المجمع.
للحد من أكسدة AA، اتخذت التدابير التالية. أولاً، تم حقن العينات كمواد بداية لكلا البروتوكولين لضمان التحديد الكمي الدقيق لمحتوى فيتامين C والتلاعب بسهولة بالعينات. وكان يفضل هذا الخيار على طحن غرامة، وجدت عادة في جميع أنحاء الأدب19، كما يذوب الغبار بسرعة كبيرة حتى يصبح الماء المتاحة مرة أخرى. أثناء إجراء الاستخراج، تم استخدام حجم أعلى من محلول أكثر حمضية (8٪ حمض الخليك و 1٪ من الـ MPA) كمستخرج في البروتوكول الأمثل(الملف التكميلي 2)، والذي يعمل أيضًا كمثبت عن طريق منع تدهور AA. هذا الحل الوارد أيضا EDTA كعامل شيلاتينغ لزيادة الاستقرار16، على عكس الاستخراج في البروتوكول غير الأمثل(ملف تكميلي 2). وعلاوة على ذلك، اختبرنا ما إذا كان من الممكن تعزيز إجراء الاستخراج باستخدام اثنين من الاستخراج المتتالية مع 2.5 مل من الاستخراج بدلا من واحد مع 5 مل وتحت الغلاف الجوي N2 بدلا من الظروف الجوية القياسية. تم التوصل إلى أفضل النتائج باستخدام استخراج واحد فقط في ظل جو غير معدل، مما أدى إلى تبسيط البروتوكول من خلال اتخاذ خطوات إضافية غير ضرورية (البيانات غير مبينة). كما أدخلت تغييرات طفيفة أخرى في البروتوكول من أجل تعزيز استخراج (أي صوتنة)، والحصول على استخراج أوضح (الترشيح أدق) وتقليل مدة البروتوكول(ملف إضافي 2). وفيما يتعلق بالظروف الكروماتوغرافية، تم التحقق من الطريقة كما ذكر قبل18،وضمان المعلمات التحليلية الجيدة(الجدول 3). الى جانب ذلك، واستخدام المياه فائقة الpure مع حمض فورميك (pH 2.0) والميثانول (98:2 v:v: v) مع تدفق 0.3 مل مين-1، بدلا من فوسفات مونوبوتاسيوم 30 مل م (pH 3.0) في 1 مل دقيقة-1 كما المرحلة المتنقلة(ملف تكميلي 2)،أدى إلى تحسين طريقة. وكان من المرجح أن يكون التقدم الأكثر أهمية باستخدام نظام UPLC بدلاً من HPLC ، مما سمح لنا بقدر أكبر من التحكم في الظروف المؤثرة (مثل درجة الحرارة) مما أدى إلى حل قمم AA دون تدخلات من قبل مركبات غير معروفة ، في وقت أقصر واستهلاك حجم أقل من استخراج (ملف إضافي 2).
ومع ذلك، هناك حدان رئيسيان لهذه الطريقة. الأول هو أنه لا يمكن قياس DHAA مباشرة باستخدام كاشف الأشعة فوق البنفسجية بسبب انخفاض الاستيعاب في نطاق الأشعة فوق البنفسجية من الطيف. من المهم تحديد محتوى DHAA لأنه يعرض بعض الأنشطة البيولوجية ويسهل تحويلها إلى AA في جسم الإنسان5. لذلك، هناك حاجة إلى رد فعل إضافي للحد من DHAA إلى AA، جنبا إلى جنب مع تشغيل الكروماتوغرافي الثاني من أجل قياس TAA ومن ثم تحديد DHAA بشكل غير مباشر عن طريق طرح AA المحتوى من TAA(الشكل 3). في هذا المعنى، وقد تم تحسين خطوة التخفيض باستخدام تركيز أعلى من وكيل خفض (DTT)، وزيادة وقت رد الفعل من 5 إلى 30 دقيقة، ووقف التفاعل مع حامض الكبريتيك(ملف تكميلية 2). ويشكل انخفاض استقرار AA القيد الثاني للأسلوب. كما AA يبدأ في التحلل 4 ح بعد استخراج (ملف تكميلية 1),فمن الضروري أن يحدد كميا في هذا الفاصل الزمني. لذلك، فإن عدد العينات لاستخراج مشروط من قبل إجراء الكروماتوغرافي. هذا هو السبب في أننا نقترح تجميدها في تلك الخطوة في هذا البروتوكول ، على الرغم من أنه في هذه الحالة ، لا يمكن وضعها جميعًا في أوتزل أوتوماتيبلر ليتم قياسها تلقائيًا. لحسن الحظ، RT مخفضة لAA سمح لنا للحصول على الكروماتوميجرامات 3 دقيقة، أقصر بكثير من الكروماتوجرامات 7 دقيقة التي تم الحصول عليها باستخدام HPLC (ملف تكميلية 2). وبالتالي، يمكن تحديد محتوى فيتامين C في عدد كبير من العينات في نافذة 4 ساعة.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig03.jpg"> الشكل 3: سير عمل القياس الكمي لفيتامين C في الخس وبعض الأقارب البرية. مخطط تخطيطي للبروتوكول الأمثل الذي يظهر فرعين لتحديد AA فقط أو AA + DHAA (TAA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
كما فيتامين (ج) هو المغذيات الأساسية للبشر ونظرا لفوائده الصحية الهامة, أصبح موضوع العديد من الدراسات. ولذلك، تم تحديد كميا في مجموعة كبيرة ومتنوعة من المحاصيل، بما في ذلك الخس، واحدة من أكثر الخضروات استهلاكا في جميع أنحاء العالم. وقد تم استبدال الطرق الكلاسيكية البسيطة تدريجيا من قبل تقنيات الكروماتوغرافيا السائل لأنها أكثر تحديدا ودقة10. ومع ذلك، نظرا للحاجة إلى رد فعل إضافي لقياس كل من، AA وDA عبر HPLC، في بعض الدراسات على الخس، فقط AA14 أو فقط TAA11 (دون تحديد كمية AA قبل الحد من DHAA إلى AA) تم قياسها. وعلاوة على ذلك، فإن عدد قليل فقط من المؤلفين قد كمية AA وDA، على الرغم من مساهمة كل من الجزيئات في نشاط فيتامين C المضادة للأكسدة2. ومع ذلك، أصبحت تقنية UPLC أكثر أهمية في الآونة الأخيرة بسبب أدائها العالي عند قياس فيتامين C في العديد من المحاصيل16. وبمقارنة النتائج التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة مع المنهجيتين، UPLC و HPLC، تم تأكيد هذه المزايا: تم تحقيق مستويات عالية من الحساسية في AA، وفي أوقات قصيرة جداً، مما يعني أيضاً استهلاك موارد أقل. وعلى الرغم من كفاءة UPLC، فإن تشن وآخرون20 فقط هي التي طبقت هذه التقنية لقياس محتوى فيتامين C في الخس، مما أدى إلى التقليل من شأن ذلك حيث تم تحديد كمية نموذج AA فقط.
باختصار، يمثل هذا العمل أول محاولة ناجحة لتحديد إجمالي محتوى فيتامين C ليس فقط في أصناف مختلفة من الخس ولكن أيضًا في بعض أقاربهم البرية. كما أن تحديد كمي فيتامين ج ضروري لتحديد الخس الذي يحتوي على نشاط مضاد للأكسدة أعلى في برامج التربية. في هذا المعنى، وزيادة إجمالي فيتامين C المحتوى في الخس الأقارب البرية وجدت هنا وزيادة محتوى AA ذكرت في الدراسات السابقة14، فضلا عن غيرها من المركبات المضادة للأكسدة21، يوسع المرشحين المناسبين لتحسين القيمة الغذائية للخس.
في الختام, حتى مع بعض القيود الكامنة في طبيعة فيتامين (ج), مثل تدهوره التدريجي بعد ساعات قليلة من استخراجها أو الحاجة إلى رد فعل الحد بسبب انخفاض DHAA UV-absorptivity, فإنه يوفر أقل كثافة العمل وأقل وقتاً تستغرق طريقة لقياس محتوى فيتامين (ج). بالإضافة إلى ذلك، كما أنها قوية جدا ويظهر حساسية عالية وقوة القرار. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن نقلها بسهولة ليس فقط إلى المواد النباتية الأخرى مع تغييرات طفيفة أو معدومة، ولكن أيضا للمنتجات المصنعة التي توفر المداواة الغذائية من فيتامين (ج) إلى البشر، مما يؤدي إلى مجموعة واسعة من التطبيقات في المستقبل في مجال الناشئة من اختبار لجودة الغذاء موثوق بها.

الخس المزروع(Lactuca sativa L.) هو واحد من أكثر الخضروات الورقية المنتجة والمستهلكة في جميع أنحاء العالم ، مع إنتاج إجمالي حوالي 27.3 مليون طن في عام 20181. وينظر المستهلكون إلى الخس على أنه صحي. وتعزى الخصائص الغذائية أساسا إلى مصدر المركبات المضادة للأكسدة في المحصول، مثل فيتامين C، من بين أمور أخرى مثل البوليفينول وفيتامين E2. فيتامين ج هو المغذيات الدقيقة الأساسية للبشر على عكس العديد من الفقاريات الأخرى، كما أننا غير قادرين على إنتاجه بسبب الطفرات الموجودة في الترميز الجيني للانزيم الخطوة الأخيرة في المسار البيولوجي3. وهو مطلوب لعملية التمثيل الغذائي للخلايا الطبيعية، كما أنه يلعب دورا هاما في الاستجابات المناعية أساسا بسبب نشاطها المضادة للأكسدة3,4.
يتكون مجموع فيتامين C من حمض الاسكوربيك (AA) وحمض ديهيدرواسكوبيك (DHAA). AA هو الشكل الأكثر نشاطا بيولوجيا من فيتامين، ولكن DHAA (منتج الأكسدة) يظهر أيضا النشاط البيولوجي ويمكن تحويلها بسهولة إلى AA في جسم الإنسان5. ولذلك، فإن تحديد كلا الشكلين مهم لتحديد إجمالي محتوى فيتامين C لأي محصول بستين، بما في ذلك الخس.
وقد استخدمت مجموعة واسعة من النهج على أساس تقنيات تحليلية مختلفة لقياس فيتامين (ج) في الخضروات، مثل الأنزيمية، الطيفية، وأساليب titrimetric6،7،8. على الرغم من أن هذه الطرق بسيطة، فهي ليست محددة كيميائيا لAA9. وبالتالي، يفضل أساليب الكروماتوغرافي، وخاصة تقنية التصوير اللوني عالي الأداء السائل -الأشعة فوق البنفسجية (HPLC-UV)، وذلك بسبب دقتها العالية10. وقد استخدمت HPLC-UV لتحديد فيتامين C في تنوع كبير من المحاصيل, مثل القرنبيط, السبانخ والخس11,12,13. ومع ذلك، فإن القياس الكمي المتزامن للـ AA و DHAA معقد بسبب انخفاض الاستيعاب في DHAA في نطاق الأشعة فوق البنفسجية للطيف. بدلا من ذلك، يمكن تحديد DHAA بشكل غير مباشر باستخدام عامل خفض أن يحول DHAA إلى AA، وقياس مجموع حمض الاسكوربيك (TAA)، ومن ثم حساب الفرق بين TAA وAA. نظرا لضرورة انخفاض التفاعل, في بعض الدراسات, فقط AA تم تحديد كميا14, والتي يمكن أن تمثل في الواقع التقليل من نشاط فيتامين (ج). وهناك حاجة أيضا إلى أن رد فعل التخفيض إضافية لتحديد DHAA بشكل غير مباشر حتى عندما يتم استخدام التقدم الأخير في تقنيات الكروماتوغرافيا السائلة، لونية سائلة فائقة الأداء (UPLC). وتستفيد هذه الخطوة أيضا من المزايا التي يعرضها UPLC عند مقارنتها بـ HPLC: زيادة الكفاءة والدقة، وزيادة الحساسية، وتحليل الوقت الأقصر، والاستهلاك الأقل للمذيبات15. ونتيجة لذلك، تم استخدام تقنية UPLC-UV لتحديد كمية فيتامين C في المحاصيل المختلفة16.
بالإضافة إلى ذلك ، AA هو جزيء لاتمل جدا . وهكذا، من المهم وضع بروتوكول يمنع تدهوره أثناء تخزين الخس وتحليل فيتامين C9. وفي هذا السياق، يقدم البروتوكول التالي تحديدًا كميًا سريعًا ومحسّنًا لمحتوى فيتامين C في الخس بواسطة UPLC-UV، بالإضافة إلى إجراء استخراج فعال. ولم تدرج أصناف النخبة في هذه الدراسة فحسب، بل أدرجت أيضا في الأراضي التقليدية وبعض الأقارب البرية بسبب اهتمامهم المحتمل بتربية المحاصيل، وتحديدا في تحسين القيمة الغذائية للخس.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT) &#8805;98% (Ellman&#8242;s reagent)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm f stainless steel ball</td>
			<td>Euro Aznar Supplies S.L.</td>
			<td>20112100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube for centrifuge</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>429946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL HPLC amber vial</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL syringe with needle</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>JS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Dealtalab</td>
			<td>202840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) &#8805;99.9% (titration)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene tube</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>429951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (CH3COOH) &#8805;99% purity glacial, ReagentPlus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrilo, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 &#181;m filtrated)</td>
			<td>Chem-lab</td>
			<td>CL00.0189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 &#181;m)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 1 L, 200 mL</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>191725, 191722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>766384</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15549004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>5438040100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer VirTis genesis 25EL</td>
			<td>VirTis</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph Multi Reax mixer</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph Reax top mixer</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an e&#955; Detector</td>
			<td>Hewlett Packard</td>
			<td>na</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid &#8805;99%, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol &#8805;99.9% (HPLC supergradient grade)</td>
			<td>ChemLab</td>
			<td>CL00.0189.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 10-1000 &#956;L</td>
			<td>Socorex</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 &#181;m)</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>54919</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE-silicone cap with preaperture</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R</td>
			<td>Gyrozen</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose filters 0.22 &#181;m (13 mm)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1015190-5108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose filters 0.45-&#181;m (13 mm)</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>SFCA-145-100</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer He&#955;ios &#946;</td>
			<td>Thermo Scientific Corporation</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4) 95.0-98.0% purity, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>WasserLab</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasons H-D</td>
			<td>Selecta</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks 1 L, 100 mL</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>191489, 191486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA e&#955; Detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved uplc-uv method for the quantification of vitamin c in lettuce varieties (lactuca sativa l.) and crop wild relatives (lactuca spp.)

الفيتامينات، وخاصة فيتامين (ج)، هي المغذيات الدقيقة الهامة الموجودة في الفواكه والخضروات. فيتامين C هو أيضا مساهم رئيسي في قدرتها المضادة للأكسدة. الخس هو واحد من الخضروات الأكثر شعبية بين المستهلكين في جميع أنحاء العالم. بروتوكول دقيق لقياس محتوى فيتامين (ج) في الخس والأنواع الأخرى ذات الصلة أمر بالغ الأهمية. نحن نُصف هنا طريقة تستخدم تقنية التصوير اللوني -فوق البنفسجية-البنفسجية السائلة فائقة الأداء، حيث تم تحسين إعداد العينة، واستخراج الفيتامينات، وظروف التصوير اللوني.
تم جمع عينات لتمثيل المصنع بأكمله، والمجمدة في -80 درجة مئوية وlyophilized لمنع الأكسدة غير المرغوب فيها وجعل التلاعب بهم أسهل. تم استخراج فيتامين (ج) في وسائل الإعلام الحمضية، مما ساهم أيضا في استقراره. كما يمكن أن يكون فيتامين (ج) موجودة في شكلين مختلفين، حمض الاسكوربيك (AA) وحمض ديهيدرواسكوبيك (DHAA)، وينبغي قياس كل من المركبات لقياس دقيق. تم قياس DHAA بشكل غير مباشر بعد تخفيضه إلى AA لأن AA يظهر absorptivity أعلى من DHAA في نطاق الأشعة فوق البنفسجية من الطيف. من المقتطف نفسه, تم إجراء قياسين, واحد قبل وواحد بعد أن الحد من التفاعل. في الحالة الأولى، كنا تحديد كمية المحتوى AA، وفي الثانية، ونحن كمي مجموع AA وDA (TAA: مجموع حمض الأسكوربيك) في شكل AA. ثم تم الحصول على كمية DHAA بشكل غير مباشر عن طريق طرح AA قادمة من القياس الأول من TAA. تم تحديدها بواسطة UPLC-UV، وذلك باستخدام معيار AA التجاري لبناء منحنى المعايرة وتحسين الإجراء الكروماتوغرافي، للحصول على قمم AA التي تم حلها بالكامل في وقت قصير. ويمكن استقراء هذا البروتوكول بسهولة على أي مواد نباتية أخرى مع تغييرات طفيفة أو معدومة. وكشفت دقته عن اختلافات ذات دلالة إحصائية غير من تصور. وتناقش نقاط القوة والقيود الأخرى في عمق أكثر في المخطوطة.

يتطلب تحديد كمي فيتامين ج في مصفوفات Lactuca تطوير نهج الكروماتوغرافي يمكن أن يضمن نتائج موثوقة. ويبين الشكل 1A خروماً ناتجاً عن بروتوكول غير محسن(ملف إضافي 2)، الذي يقدم ذروة AA مع "الكتف" الثانوية غير معروفة الهوية. ومع ذلك، بعد تحسين ظروف الاستخراج والكروماتوغرافية، تم التوصل إلى حل AA الذروة دون تداخل مركبات غير معروفة(الشكل 1B). وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام معدات UPLC-UV بدلاً من HPLC-UV سمح لنا بتقليل وقت الاحتفاظ (RT) لـ AA: 1.874 دقيقة في الكروماتوغرامات المحسنة مقابل 2.980 دقيقة في غير المحسنة(الشكل 1) ، بالإضافة إلى أوقات التشغيل ، 3 و 7 دقائق للبروتوكولات المحسنة وغير المحسنة ، على التوالي.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig01.jpg"> الشكل 1: الكروماتوغرام من AA في نفس عينة الخس (أصناف تجارية 'Begoña'). (A) HPLC-UV الكروم الناتجة عن بروتوكول غير محسن (الشروط الموضحة في الملف التكميلي 2). (B) UPLC-UV الكروماتجرام التي تم الحصول عليها مع بروتوكول الأمثل (الشروط الموضحة في الجدول 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
التدخلات في AA القمم، مثل تلك التي لوحظت في الشكل 1A،أدى باستمرار إلى التقليل من فيتامين C (AA، DHAA و TAA) المحتوى(الشكل 2)بسبب عدم كفاية الفصل أثناء عملية الكروماتوغرافي كما تم دمج مناطق الذروة المتداخلة من قبل انخفاض عمودي عند أعمق نقطة بينهما. هذا التحيز ملحوظ بشكل خاص في حالة الأقارب البرية المحاصيل، وخاصة في DHAA ومحتوى TAA(الشكل 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig2v2.jpg"> الشكل 2: توزيع محتوى فيتامين C. تقسيم المؤامرات الكمان من DHAA، AA و TAA المحتوى (ملغ ز-1 من الوزن الجاف) في أصناف الخس التجارية والتقليدية وبعض الأقارب البرية باستخدام بروتوكولات غير الأمثل والمحسنة. تظهر الخطوط السوداء قيم الوسط. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig2v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
وعلاوة على ذلك، منعنا استخدام بروتوكول غير محسن من استخراج أي استنتاج مفيد من النتائج لأنها أظهرت جميع العينات، كلا النوعين من الخس والأقارب البرية، وجود محتوى مماثل من فيتامين C. وعلى النقيض من ذلك، فإن البروتوكول الأمثل سمح لنا بالكشف عن الاختلافات ذات الأهمية الإحصائية فيما بينها بالنسبة لمحتوى DHAA و TAA(الجدول 4)،وأغنىها هي الأنواع البرية (الشكل 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">غير مُحسّن</td>
			<td colspan="2">الامثل</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>F-نسبة</td>
			<td>
p-قيمة</td>
			<td>F-نسبة</td>
			<td>
p-قيمة</td>
		</tr>
<tr>
<td>DHAA</td>
			<td>0.460</td>
			<td>0.637ns
</td>
			<td>5.613</td>
			<td>0.009**</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aa</td>
			<td>0.070</td>
			<td>0.932ns
</td>
			<td>1.020</td>
			<td>0.374ns
</td>
		</tr>
<tr>
<td>TAA</td>
			<td>0.015</td>
			<td>0.985ns
</td>
			<td>4.438</td>
			<td>0.022*</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
nsو * و ** تشير إلى غير هامة وكبيرة في p<0.05 و 0.01 على التوالي.</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 4: التباين في محتوى فيتامين (ج). نسب F (حاصل من اثنين من الفروق، الفرق بين المجموعة والتباين داخل المجموعة) وقيم الأهمية من ANOVA في اتجاه واحد النظر في نوع Lactuca (أصناف الخس التجارية، وأصناف الخس التقليدية، والأقارب البرية المحاصيل) ل DHAA، AA و TAA المحتوى في بروتوكولات غير الأمثل والمحسنة.
ملف تكميلي 1: AA و TAA الاستقرار في 5 درجة مئوية على 24 ساعة. (أ)AA و TAA مناطق الذروة في جميع أنحاء 24 ح . (ب) AA و TAA المحتوى (ملغ ز-1 من الوزن الجاف) في جميع أنحاء 24 ساعة. تمثل الأشرطة الانحرافات المعيارية لاثنين من النسخ المتماثلة التقنية (n = 2) التي يتم الاحتفاظ بها في الاختزال التلقائي عند 5 درجة مئوية وحمايتها من التعرض للضوء. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61440/Supplemental_File_1_.pptx" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.</a>
ملف تكميلي 2: الاختلافات الرئيسية بين الأمثل والبروتوكول غير الأمثل ل تا، AA و DHAA استخراج و الكم. وكانت العينات المستخدمة هي نفسها في كلتا الحالتين. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61440/Supplemental__File_2_.xlsx" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp. at JoVE.com

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp.

نقدم طريقة سريعة وموثوق بها لتحديد فيتامين C في لاكوكا SPP. باستخدام UPLC-UV، التي يحتمل أن تكون قابلة للنقل إلى نباتات أخرى. الخطوات الرئيسية هي إعداد العينة واستخراج فيتامين (ج) في ظل ظروف مستقرة، والحد من حمض ديهيدرواسكوبيك إلى حمض الاسكوربيك وتحسين الإجراء الكروماتوغرافي.

تحسين UPLC-UV طريقة ل الكم من فيتامين (ج) في أصناف الخس(Lactuca sativa L.) والمحاصيل البرية الأقارب(Lactuca spp.)

Vitamins, especially vitamin C, are important micronutrients found in fruits and vegetables. Vitamin C is also a major contributor to their antioxidant ...

فيتامين C هو مؤشر على القيمة الغذائية للفواكه والخضروات. نحن بحاجة إلى طريقة سهلة وموثوق بها لتحديدها كميا، وخاصة في الخس، والخضروات الورقية الأكثر استهلاكا في جميع أنحاء العالم. هذه الطريقة تمنع تدهور فيتامين C، وتوفر استخراج محسنة وسرعة، وتحديد كمي موثوق به لكل من الأحماض الاسكوربيك وdehydroascorbic، وذلك بفضل دقة وحساسية.ويمكن استخدام هذه الطريقة في تكنولوجيا الأغذية لخلق علامات الواقع الغذائية، في الطب لدراسة الآثار الغذائية على الصحة وتربية النباتات، لزيادة محتوى فيتامين (ج) في أنواع مختلفة. مما يدل على الإجراء مع إينيس مدينا لوزانو، سيكون خوسيه أنخيل أرانخويلو وأرانتزازو كاستيانوس، وهما محللان من مختبري. لإعداد عينات النبات، حصاد واحد على الأقل الخارجي وورقة داخلية واحدة لكل مصنع وتجميد الأوراق فورا في النيتروجين السائل، قبل وضعها في تخزين ناقص 80 درجة مئوية.لlyophilize عينات النباتات المجمدة، ووضع أنابيب العينة غير المغطاة على الصواني داخل غرفة مجفف تجميد من مزيل الجفاف، وبرنامج مزيل lyophil كما هو مبين. الحفاظ على درجة حرارة المكثف في ناقص 80.2 درجة مئوية، وثابت فراغ في 112 عندما تكون المادة جافة تماما، إضافة 10 ملليمتر كرات الفولاذ المقاوم للصدأ القطر إلى عينات مزيل، في أنابيب البولي بروبلين 20 ملليلتر. واستخدام دوامة متعددة الأنابيب، في الوقت المناسب وكثافة، لطحن العينات في الغبار الناعم.لإعداد الأسهم القياسية حمض الاسكوربيك وحلول التخفيف، تزن بالضبط 10 ملليغرام من معيار حمض الاسكوربيك على توازن الدقة. وعند 90 ملليلتر من المرحلة المتنقلة للعينة. استخدم جهاز ستيرلر المغناطيسي لإذابة العينة، واستخدم قارورة حجمية لقياس 100 ملليلتر بدقة من الحل الناتج.إضافة إضافية فائقة الpure المياه، حموضة في درجة الحموضة اثنين مع حمض فليك، حسب الضرورة. ثم إعداد خمسة تخفيفات من المخزون، للحصول على منحنى المعايرة. العمل تحت كثافة الضوء المنخفض، إضافة 50 ملليغرام من العينة الأرض الlyophilized وخمسة ملليلتر من المذيبات استخراج، إلى أنبوب الطرد المركزي البولي بروبلين 15 ملليلتر ودوامة الحل لمدة خمس ثوان.بعد هز العينة لمدة 10 دقائق على شاكر المدارية في 2000 الثورات في الدقيقة الواحدة، ونقل الأنبوب إلى حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق، في درجة حرارة الغرفة وجمع العينة عن طريق الطرد المركزي. ثم سلالة supernatant من خلال 0.22 ميكرون تجديد مرشح السليلوز، في قارورة العنبر خمسة ملليلتر، لاستخراج كل من الأحماض الاسكوربيك وdehydroascorbic في استخراج واحد. لإعداد التخفيف لتحديد تركيز حمض الاسكوربيك في عينات الأوراق، إضافة 200 ميكرولترات من استخراج واحد، و 800 ميكرولترات من الماء فائقة الخطورة في قارورة كروماتوغرافيا سائلة من نوع العنبر مليلتر، وإغلاق القارورة بمكونات PTFE/السيليكون.بالنسبة لاستخراج حمض الاسكوربيك الكلي، قم بنقل 200 ميكرولترات من استخراج واحد، إلى قارورة كروماتوغرافيا سائلة من نوع ملليلتر، وإضافة 200 ميكرولترات من محلول الحد من القارورة. أغلق القارورة مع المكونات ودوامة الحل لمدة خمس ثوان. بعد حضانة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء، واستخدام 200 ميكرولترات من 0.4 حمض الكبريتيك المولر، لوقف التفاعل وتثبيت حمض الاسكوربيك، إلى درجة الحموضة الحمضية.لإعداد التخفيف لتحديد مجموع تركيز حمض الاسكوربيك في العينات، إضافة 400 ميكرولترات من الماء فائقة التبخر، إلى مجموع استخراج حمض الاسكوربيك اثنين. أغلق القارورة بمكونات. قبل ساعة واحدة على الأقل من بدء التجربة، تأكد من أن جميع الحلول العاملة قد تم تحميلها في نظام UPLC والتبديل على الوحدات النمطية UPLC الثلاثة.عند انتهاء عملية المعايرة الداخلية، افتح البرنامج وحمّل البرنامج الفعال. مرة واحدة يتم تحميل البرنامج انقر فوق مدير المذيبات الرباعية وانقر فوق زر الماوس الأيمن لتحديد وحدة التحكم في التشغيل، للوصول إلى وحدة التحكم إدارة UPLC. انقر فوق النظام، والتحكم وبدء التشغيل، للشروع في إعداد وتثبيت صك UPLC، وانقر فوق مذيبات رئيس الوزراء، QSM، والتحقق من A، B، C، D، غسل الختم ومدة رئيس الوزراء، أكبر من خمس دقائق، لتطهير جميع خطوط UPLC، لمدة خمس دقائق على الأقل.انقر فوق SM، والتحقق من غسل المذيبات أكبر من 45 ثانية. تحقق من المذيبات التطهير، و 35 دورات لتطهير وتنظيف حاقن. لتكبيل UPLC إلى شروط الأسلوب، تحقق من اكويبيرات إلى الأسلوب و QSM، وتعيين التدفق إلى 0.3 ملليلتر في الدقيقة.المذيب A إلى 2٪ المذيب B إلى 0٪ المذيب C 98٪ والمذيب D إلى 0٪ لا يزال في اكوسيبرات إلى الأسلوب وSM وتعيين العينة إلى 5 درجات مئوية، والعمود إلى 30 درجة مئوية. لا يزال في اكوريبراتي إلى أسلوب وأخرى، حدد مصباح تشغيل، وانقر فوق ابدأ. السماح للمعدات بالستقر لمدة ساعة على الأقل.للتحقق من الاستقرار، انقر فوق تشغيل نظام وحدة التحكم و QSM وحدد ضغط نظام QSM، فقط للتحقق من الضغط في العمود. إذا لم تكن هناك اتجاهات محددة في التغييرات الضغط، وقيمة دلتا هو أقل من 10 جنيه لكل بوصة مربعة من الضغط، في شاشة البداية السريعة، وملء المصفوفة مع أسماء المعايير والعينات التي سيتم تحليلها. لتحديد تركيز حمض الاسكوربيك في المعايير، حقن خمسة ميكرولترات من كل تخفيف في صك UPLC، وتنفيذ الكروماتوغرافيا، بدءا من معظم المخفف، إلى الحل الأكثر تركيزا كما هو مبين في الجدول.لتحديد حمض الاسكوربيك وتركيز حمض الاسكوربيك الكلي في عينات الأوراق، يحقن خمسة ميكرولترات من المصطف المخفف ويستخرج اثنين على التوالي، في أداة UPLC لتحليل الكروماتوغرافيا. لحساب حمض الاسكوربيك ومجموع تركيزات حمض الاسكوربيك، في البرنامج انقر فوق Quickstart، تصفح المشروع، القنوات، اسم معيار أو عينة وقناة المساعد الشخصي الرقمي واحد، 245 نانومتر في 1.2 نانومتر. لفتح الكروماتوجرامات القياسية وعينة، انقر على نقطة البداية من الكروماتوغرام واسحبه إلى نقطة النهاية، لدمج الذروة المقابلة في المعايير والعينات.ثم استخدام البيانات من التخفيفات القياسية حمض الاسكوربيك، لبناء منحنى المعايرة، لتمثيل قيم امتصاص الكروماتوغرافيا المحددة واستيفاء قيم الامتصاص من العينة، للحصول على حمض الاسكوربيك وتركيز حمض الاسكوربيك الكلي، وفقا للصيغة. فيتامين C الكم في مصفوفات Lactuca، يتطلب تطوير نهج الكروماتوغرافي التي يمكن أن تضمن نتائج موثوقة. هنا، يمكن ملاحظة الكروماتوغرام الناتجة عن بروتوكول غير محسن تقديم وذروة حمض الاسكوربيك، جنبا إلى جنب مع مجهول الهوية في الكتف عامل منجم.ومع ذلك، بعد تحسين ظروف الاستخراج والكروماتوغرافية، يمكن التوصل إلى حل ذروة حمض الاسكوربيك دون تداخل المركبات غير معروف. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام معدات الأشعة فوق البنفسجية UPLC، بدلاً من الأشعة فوق البنفسجية HPLC، يقلل من زمن الاستبقاء والجري. التدخلات في قمم حمض الاسكوربيك، يؤدي باستمرار إلى التقليل من محتوى فيتامين C، وذلك بسبب عدم كفاية الفصل أثناء عملية الكروماتوغرافي.كما يتم دمج مناطق الذروة المتداخلة من قبل انخفاض عمودي في أعمق نقطة بينهما. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام بروتوكول غير الأمثل يمنع استخلاص أي استنتاج مفيد، من النتائج. كما يبدو أن جميع العينات لها محتوى فيتامين C مماثلة, في أي من أشكاله.وفي المقابل، يتيح استخدام البروتوكول الأمثل الكشف عن الاختلافات ذات الأهمية الإحصائية بين الأنواع المختلفة من العينات. تأكد من جمع عينات متعددة، للحفاظ على العينات بشكل صحيح، لتقليل تعرض العينة لعوامل المؤكد، وتحديد كلا الشكلين من فيتامين C.The إجمالي محتوى فيتامين C يمكن أن يكون كميا ليس فقط في أي نوع من النباتات ولكن أيضا، في أي فاكهة في أي من الفواكه والخضروات، أو حتى الأغذية المصنعة مع تعديلات تقنية قليلة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.)

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

عزل البروتينات الدهنية عالية الكثافة لغير الترميز الصغيرة RNA الكمي

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

وسيلة فعالة لتخليق Peptoids مع مونمرات مختلط ليسين من نوع / ارجينين من نوع وتقييم نشاطهم مكافحة يشماني

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

أسلوب ثقافة بديلة للحفاظ على هيبوميثيليشن الجينية للخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام مجاهدي خلق مثبطات PD0325901 وفيتامين (ج)

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

أسلوب قياس ألوان لقياس محتوى الحديد في النباتات

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome التنميط في الليشمانياوالخلايا البشرية والخصية الماوس

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

الكشف عن نشاط ج فوسفوليباسي في هوموجيناتي المخ من نحل العسل

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

القياس الكمي لديناميات شبكة تفاعل البروتين باستخدام الترسيب المناعي المشترك المتعدد

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

الحصول على بيانات النسخ عالية الجودة من بذور الحبوب من خلال طريقة معدلة لتنميط التعبير الجيني

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

تحليل RNA لطخة للكشف عن و الكم من MicroRNAs النبات

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...