Name: improved uplc-uv method for the quantification of vitamin c in lettuce varieties (lactuca sativa l.) and crop wild relatives (lactuca spp.)
Uploaded: 2020-06-30T13:00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp. at JoVE.com

Nous remercions la Vegetable Germplasm Bank de Saragosse (BGHZ-CITA, Espagne) et le Centre for Genetic Resources (CNG, Wageningen, Pays-Bas) d’avoir fourni les semences nécessaires à ces travaux. Nous remercions J. A. Aranjuelo, A. Castellanos et « laboratorio de valoración nutritiva » du CITA pour leur soutien technique et D. L. Goodchild d’avoir examiné la langue anglaise. Ces travaux ont été financés par les projets RTA2017-00093-00-00 de l’Institut national de recherche et de technologie agricoles et alimentaires (INIA) et LMP164_18 du gouvernement d’Aragón; et par le programme opérationnel FEDER Aragón 2014-2020 et le Fonds social européen de l’Union européenne [Grupos Consolidados A12-17R: « Grupo de investigación en fruticultura: caracterización, adaptación y mejora genéica » et A14-17R: « Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles » (SAGAS)]. I.M.L. a été soutenu par un contrat prédoctoral pour la formation des médecins du ministère espagnol de la Science, de l’Innovation et des Universités (MCIU) et de l’Agence nationale espagnole de recherche (AEI).

1. Préparation des matières végétales
<ol><li>Échantillonner au moins deux feuilles par plante dans des tubes de polypropylène de 50 mL, une externe (plus ancienne) et une externe (plus jeune) afin de représenter plus précisément l’ensemble de la plante. Recueillir au moins trois répliques biologiques pour chaque échantillon.</li>
	<li>Congelez-les immédiatement à l’aide d’azote liquide et conservez-les à -80 °C jusqu’à utilisation. Assurez-vous que l’azote liquide n’entre pas dans les tubes; sinon, ils pourraient exploser lorsqu’ils sont enlevés en raison de l’expansion du gaz pendant la vaporisation. ATTENTION : Des gants et un écran facial sont nécessaires en raison des dangers potentiels associés à l’utilisation d’azote liquide.</li>
	<li>Retirer les bouchons des tubes et les placer sur les plateaux dans la chambre de sécheuse du lyophiliseur (tableau desmatériaux)programmée comme suit : -25 °C pour 72 h, -10 °C pendant 10 h, 0 °C pendant 10 h et 20 °C pendant au moins 4 h. Maintenir la température du condenseur et la constante du vide pendant le processus de séchage au gel à -80,2 °C et 112 mTorr, respectivement.</li>
	<li>Lorsque le matériau est complètement sec (entre 4 et 7 jours selon la plante et le degré de compactage dans le tube), conservez à 4 °C, -20 °C ou -80 °C pour un stockage court (jours à semaines), moyen (mois) ou long (années), respectivement. L’inclusion de sacs contenant des perles de gel de silice dans les tubes contenant de l’échantillon est recommandée.</li>
	<li>Placez les échantillons lyophilisés dans des tubes en polypropylène de 20 mL ainsi que des boules d’acier inoxydable de 10 mm de diamètre et broyez-les avec un vortexer multitube en utilisant l’intensité et le temps nécessaires pour obtenir une poussière fine. REMARQUE : Pendant tout le processus, protégez les échantillons contre l’exposition à la lumière directe.</li>
</ol>2. Préparation des reagents et des solutions
<ol><li>Préparer la solution d’extraction des solvants : 8 % d’acide acétique (v/v), 1 % de MPA (acide métaphosphorique) (w/v), 1 mM d’EDTA (acide éthylènediaminetétraacetic).<ol>
<li>Calculer le volume total de solvant nécessaire pour traiter l’ensemble des échantillons en tenant compte du fait que 5 mL seront ajoutés à chacun. Pour préparer 1 L de la solution, ajouter à un flacon : 30 g de MPA, 0,372 g de déshydratation EDTA, 80 mL d’acide acétique et 500 mL d’eau ultrapure (volumes d’échelle et quantités en conséquence). Sceller la bouche du flacon avec du film plastique.</li>
		<li>Une fois dissous à l’aide d’un agitateur magnétique, utilisez un flacon volumétrique pour mesurer avec précision 1 L, en ajoutant l’eau ultrapure nécessaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer le tampon de réaction de réduction (0,5 M Tris (2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) pH 9.0) et la solution réducteur (40 mM DTT (1,4-Dithiothreitol) avec 0,5 M Tris pH 9,0).<ol>
<li>Calculez le volume total de solution de réduction nécessaire pour traiter l’ensemble des échantillons en tenant compte du fait que 200 μL seront ajoutés à chacun d’eux. Pour préparer 100 mL de tampon, ajouter à un bécher : 6,055 g de Tris et 90 mL d’eau ultrapure (volumes d’échelle et quantités en conséquence). Sceller la bouche du bécher avec du film plastique.</li>
		<li>Une fois dissous à l’aide d’un agitateur magnétique, réglez la solution au pH 9.0 en ajoutant 2 M HCl et utilisez un flacon volumétrique pour mesurer avec précision 100 mL, en ajoutant l’eau ultrapure nécessaire.</li>
		<li>Pour préparer 100 mL de la solution réducteur, ajouter à un bécher : 0,629 g de TNT (pureté : 98 %) et 90 mL du tampon (0,5 M Tris pH 9,0) précédemment préparé (2,2,1 à 2,2,2). Échellez les volumes et les quantités en conséquence. Sceller la bouche du bécher avec du film plastique.</li>
		<li>Une fois dissous à l’aide d’un agitateur magnétique, utilisez un flacon volumétrique pour mesurer avec précision 100 mL, en ajoutant le volume nécessaire de tampon 0,5 M Tris pH 9.0. REMARQUE : La solution de réduction est très instable. C’est pourquoi une solution fraîchement faite est fortement recommandée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Acide sulfurique (0,4 M H2SO4)<ol>
<li>Calculer le volume total d’acide sulfurique de 0,4 M nécessaire pour traiter l’ensemble des échantillons en tenant compte du fait que 200 μL seront ajoutés à chacun. Pour préparer 100 mL de la solution, ajouter à un bécher: 80 mL d’eau ultrapure, puis 2,22 mL de H2SO4 (pureté: 96%, densité: 1,84 g mL-1). Utilisez un flacon volumétrique pour mesurer avec précision 100 mL, en ajoutant l’eau ultrapure nécessaire. ATTENTION : L’acide sulfurique est très corrosif, il doit donc être manipulé à l’aide d’un équipement de protection et sous le capot. En outre, l’acide doit être ajouté à l’eau ultrapure, et non l’eau à l’acide, pour réduire les fumées et éviter les accidents.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Acide chlorhydrique (2 M HCl).<ol>
<li>Pour préparer 100 mL d’acide chlorhydrique de 2 M, ajouter à un bécher : 80 mL d’eau ultrapure, puis 6,13 mL de HCl (pureté : 37%, densité : 1,19 g mL-1). Sceller la bouche du bécher avec du film plastique. Utilisez un flacon volumétrique pour mesurer avec précision 100 mL, en ajoutant l’eau ultrapure nécessaire. Échelle des volumes en conséquence. ATTENTION: L’acide chlorhydrique est très corrosif, il doit donc être manipulé à l’aide d’équipement de protection et sous le capot. En outre, l’acide doit être ajouté à l’eau ultrapure, et non l’eau à l’acide, pour réduire les fumées et éviter les accidents.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Norme AA (stock et dilutions)<ol>
<li>Peser exactement 10 mg de norme AA (pureté: 99%) en utilisant un équilibre de précision et ajouter 90 mL de phase mobile (pH d’eau ultrapure 2.0 avec acide formique).</li>
		<li>Une fois dissous à l’aide d’un agitateur magnétique, utiliser une fiole volumétrique pour mesurer avec précision 100 mL, en ajoutant le volume nécessaire de pH d’eau ultrapure 2.0 avec de l’acide formique. REMARQUE : Protégez cette solution de stock de l’exposition à la lumière.</li>
		<li>Préparez cinq dilutions à partir du stock de la norme AA pour obtenir une courbe d’étalonnage suivant les instructions du tableau 1 et procéder à l’étape 5.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Standard</td>
			<td>[AA] (μg mL-1)</td>
			<td>Solution AA (100 μg mL-1)(μL)</td>
			<td>Phase mobile (μL)a</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>5</td>
			<td>995</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>2.5</td>
			<td>25</td>
			<td>975</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>50</td>
			<td>950</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>900</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>250</td>
			<td>750</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">
a PH d’eau ultrapure 2.0 acidifié par acide formique.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Protocole pour préparer cinq normes d’AA (acide ascorbique). Des volumes de soluté et de solvant pour préparer chacune des différentes concentrations des normes sont indiqués.
3. Extraction des AA et du DHAA
REMARQUE : Il est recommandé de travailler dans des conditions de faible intensité lumineuse pendant les étapes d’extraction.
<ol><li>Dans un tube de centrifugeuse en polypropylène de 15 mL, ajouter 50 mg d’échantillon de sol lyophilisé et 5 mL de solvant d’extraction (étape 2.1).</li>
	<li>Agiter le mélange à l’aide d’un vortex pendant 5 s, puis d’un shaker orbital pendant 10 min à 2000 rpm.</li>
	<li>Introduire le tube dans un bain ultrasonique pendant 10 min à température ambiante avec ultrason activé.</li>
	<li>Centrifugeuse à 4 000 x g pendant 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Prenez le supernatant, passez-le à travers un filtre à cellulose régénéré de 0,22 μm et rangez-le dans un flacon d’ambre de 5 mL. Il s’agit de l’extrait 1, qui contient AA et DHAA. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici en gelant les extraits à -80 °C et en les protégeant de l’exposition à la lumière car les AA et les DHAA sont très instables et se dégradent facilement en présence de lumière, à des températures élevées ou dans des atmosphères oxydantes (Dossier supplémentaire 1).</li>
</ol>4. Réduction de DHAA à AA pour extraire TAA
<ol><li>Transférer 200 μL d’extrait 1 sur un flacon ambré de 2 mL pour la chromatographie liquide et ajouter 200 μL de la solution réducteur (étape 2.2). Fermez le flacon à l’aide d’une prise en silicone PTFE avec pré-ouverture et secouez-le avec un vortex de 5 s.</li>
	<li>Laissez la solution reposer pendant 30 min à température ambiante et protégez-la de la lumière.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de 0,4 M H2SO4 pour arrêter la réaction et stabiliser l’AA dans le pH acide. La solution qui en résulte est Extrait 2, qui contient seulement AA et est en fait TAA.</li>
</ol>5. Détermination
<ol><li>Préparation UPLC-UV<ol>
<li>Préparez les solutions de travail décrites dans le tableau 2,filtrées convenablement à travers des filtres de 0,22 μm, sonnées pendant au moins 10 minutes et les placer dans le système UPLC.</li>
		<li>Allumez les trois modules UPLC et attendez la fin du processus d’étalonnage interne.</li>
		<li>Ouvrez le logiciel (p. ex., Empower 3) et chargez le programme instrumental décrit dans le tableau 2: Empower 3 | Exécuter des échantillons | Méthode de vitamine C | UPLC_PDA | Utilisez QuickStart.</li>
		<li>Une fois que le logiciel est chargé avec le bon programme, accédez à la console de gestion UPLC : Quaternary Solvent Manager | Cliquez sur le bouton de la souris droite | Console de lancement.</li>
		<li>Procéder à la préparation et à la stabilisation de l’instrument UPLC : Système | Contrôle | Démarrage.<ol>
<li>Purgez toutes les lignes UPLC pendant au moins 5 min : Solvants Prime | QSM - France | Vérifiez A, B, C, D et Seal Wash | Durée de prime > 5 min.</li>
			<li>Purger et nettoyer l’injecteur : Solvants prime | SM - France | Vérifiez le solvant Wash (> 45 s) et vérifiez purge solvant (> 35 cycles).</li>
			<li>Equilibrer UPLC aux conditions de méthode : Equilibrate à la méthode | QSM - France | Débit (0,3 mL min-1) | Solvant A (2%) | Solvant B (0%) | Solvant C (98%) | Solvant D (0%); Equilibrer à la méthode | SM - France | Échantillon (5 °C) | Colonne (30 °C) et Equilibrate à méthode | Autres | Vérifiez la lampe allumée | Appuyez sur Démarrer.</li>
			<li>Attendez au moins 1 h (encore plus de temps est recommandé) pour que l’équipement se stabilise. La stabilité peut être vérifiée en vérifiant la pression dans la colonne de la console de lancement: Système | Gestionnaire de solvants quaternaires | Pression du système QSM. Assurez-vous qu’il n’y a pas de tendances identifiables dans les changements de pression (augmentations ou diminutions) et que la valeur du delta est inférieure à 10 psi.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dans l’écran QuickStart, remplissez la matrice avec les noms des normes et des échantillons à analyser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Détermination AA dans les normes<ol>
<li>Transférer 1 mL de chacune des cinq normes AA précédemment préparées (étape 2.5.3) à 2 mL de flacons ambrés pour la chromatographie liquide. Fermez le flacon à l’aide d’une prise en silicone PTFE avec pré-ouverture et injectez 5 μL dans l’instrument UPLC.</li>
		<li>Effectuer la chromatographie suivant la procédure décrite dans le tableau 2 à partir de la plus diluée à la plus concentrée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Détermination AA dans les échantillons<ol>
<li>Pipette 200 μL d’extrait 1 dans un flacon ambré de 2 mL pour la chromatographie liquide et ajouter 800 μL d’eau ultrapure. Fermez le flacon à l’aide d’une prise en silicone PTFE avec pré-ouverture et injectez 5 μL dans l’instrument UPLC.</li>
		<li>Effectuer la chromatographie suivant la procédure décrite dans le tableau 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Détermination taa dans les échantillons<ol>
<li>Ajouter 400 μL d’eau ultrapure à l’extrait 2. Fermez le flacon à l’aide d’une prise en silicone PTFE avec pré-ouverture et injectez 5 μL dans l’instrument UPLC.</li>
		<li>Effectuer la chromatographie suivant la procédure décrite dans le tableau 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Composants et paramètres</td>
			<td>Description</td>
		</tr>
<tr>
<td>Instrument</td>
			<td>Acquity UPLC Classe H</td>
		</tr>
<tr>
<td>Détecteur</td>
			<td>PDA eν Detector νabs for AA=245 nm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Logiciel</td>
			<td>Autonomisation 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colonne</td>
			<td>Acquity UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 μm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Canal A</td>
			<td>CH3OH</td>
		</tr>
<tr>
<td>Canal B/Lavage</td>
			<td>H2O:CH3OH (50:50 v:v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Canal C</td>
			<td>PH d’eau ultrapure 2.0 acidifié par acide formiquea
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Canal D/Lavage des phoques</td>
			<td>Eau ultrapure: acetonitrile (90:10 v:v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phase mobile</td>
			<td>0,3 mL min-1 de 2%A + 98%C (mode isocratique)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Température de la colonne</td>
			<td>30 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Température de l’autosampler</td>
			<td>5 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume d’injection</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temps de rétention AA</td>
			<td>1.874 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Durée de fonctionnement</td>
			<td>3 min</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
a Volume indéterminé d’acide formique utilisé jusqu’à l’ajustement du pH</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Procédure chromagraphique optimisée pour déterminer l’AA (acide ascorbique) dans les extraits de laitue et de parents sauvages. Description des composants, conditions et solutions utilisés.
6. Quantification des AA et du DHAA
<ol><li>Analyse statistique<ol>
<li>Déterminer les paramètres analytiques de la méthode chromagraphique tel que décrit par Bertolín et coll.18 (Tableau 3). REMARQUE : Les valeurs des paramètres présentés dans le tableau 3 devront être définies dans des conditions expérimentales spécifiques.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Paramètres analytiques de la méthode</td>
			<td>Valeurs</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plage linéaire (μg mL-1)</td>
			<td>0.5-25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Équation linéaire</td>
			<td>y=53 143,03 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R2
</td>
			<td>0.99998</td>
		</tr>
<tr>
<td>Limite de détection (mg AA g-1 de matière sèche)</td>
			<td>0.013</td>
		</tr>
<tr>
<td>Limite de quantification (mg AA g-1 de matière sèche)</td>
			<td>0.045</td>
		</tr>
<tr>
<td>Répétabilité (CV, %)a
</td>
			<td>1.75</td>
		</tr>
<tr>
<td>Précision intermédiaire (CV, %)a
</td>
			<td>4.22</td>
		</tr>
<tr>
<td>Récupération (Rec, %)b
</td>
			<td>95,6 ±2,4</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
a CV : coefficient de variation</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
b L’analyse de récupération a été effectuée avec 10 aliquots contenant 50 mg du même échantillon, 5 piqués avec 2 mg d’AA g-1 de matière sèche, et 5 non piqués. %Rec=([AA]échantillon à pointes-[AA]sample)/([AA]spiked)x100.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : Paramètres analytiques optimisés pour la détection et la quantification des AA (acide ascorbique) et du TAA (acide ascorbique total). La plage linéaire, l’équation et le coefficient de détermination de la courbe d’étalonnage (R2),ainsi que les limites de détection et de quantification de l’AA (le même pour taa), et la répétabilité, la précision intermédiaire et la récupération ont été obtenus avec un volume d’injection d’échantillon de 5 μL.
<ol start="2"><li>Calculer la concentration d’AA et de TAA.<ol>
<li>Ouvrez les chromatogrammes standard et échantillon : QuickStart | Parcourir le projet | Canaux | « nom de la norme ou de l’échantillon » | PDA Ch1 245 nm@1,2 nm.</li>
		<li>Intégrer le pic correspondant (AA ou TAA) dans les normes et les échantillons en cliquant sur son point de départ (environ 1.790 min) et en le faisant glisser avec la souris jusqu’à son point final (environ 1.910 min).</li>
		<li>Construire une courbe d’étalonnage représentant les valeurs d’absorption déterminées chromatographiquement (étape 5.2.) par rapport à la concentration des cinq normes AA préparées ci-dessus (tableau 1).</li>
		<li>Interpoler les valeurs d’absorption des échantillons déterminés aux étapes 5.3 et 5.4 et obtenir la concentration d’AA et de TAA, respectivement, avec la formule suivante : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61440/61440equ01.jpg"> où y est la zone de pointe intégrée, x est la concentration AA ou TAA en ppm et m et n sont la pente et le y-interceptde la ligne de régression obtenue, respectivement.</li>
		<li>Pour calculer la concentration de DHAA, appliquez la formule suivante : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61440/61440equ02.jpg"> REMARQUE : Pour obtenir les concentrations totales du DHAA, de l’AA et du TAA en mg g-1 de poids sec, les valeurs obtenues en interpolant directement dans la courbe d’étalonnage devront être multipliées par le volume total de l’extrait et le facteur de dilution appliqué, puis divisées par le poids de l’échantillon utilisé pour effectuer l’extraction.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Llorach, R., Mart&#237;nez-S&#225;nchez, A., Tom&#225;s-Barber&#225;n, F. A., Gil, M. I., Ferreres, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+polyphenols+and+antioxidant+properties+of+five+lettuce+varieties+and+escarole.">Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole.</a> Food Chemistry. 108 (3), 1028-1038 (2008).</li><li>Carr, A. C., Frei, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+new+recommended+dietary+allowance+for+vitamin+C+based+on+antioxidant+and+health+effects+in+humans.">Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 69 (6), 1086-1107 (1999).</li><li>Carr, A. C., Vissers, M. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+or+food-derived+vitamin+C-Are+they+equally+bioavailable.">Synthetic or food-derived vitamin C-Are they equally bioavailable.</a> Nutrients. 5 (11), 4284-4304 (2013).</li><li>Lee, S. K., Kader, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preharvest+and+postharvest+factors+influencing+vitamin+C+content+of+horticultural+crops.">Preharvest and postharvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops.</a> Postharvest Biology and Technology. 20 (3), 207-220 (2000).</li><li>Shekhovtsova, T. N., Muginova, S. V., Luchinina, J. A., Galimova, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+methods+in+food+analysis:+determination+of+ascorbic+acid.">Enzymatic methods in food analysis: determination of ascorbic acid.</a> Analytica Chimica Acta. 573-574, 125-132 (2006).</li><li>Zhan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+exposure+during+storage+preserving+soluble+sugar+and+L-ascorbic+acid+content+of+minimally+processed+romaine+lettuce+(Lactuca+sativa+L.var.+longifolia).">Light exposure during storage preserving soluble sugar and L-ascorbic acid content of minimally processed romaine lettuce (Lactuca sativa L.var. longifolia).</a> Food Chemistry. 136 (1), 273-278 (2013).</li><li>Malejane, D. N., Tinyani, P., Soundy, P., Sultanbawa, Y., Sivakumar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficit+irrigation+improves+phenolic+content+and+antioxidant+activity+in+leafy+lettuce+varieties.">Deficit irrigation improves phenolic content and antioxidant activity in leafy lettuce varieties.</a> Food Science and Nutrition. 6 (2), 334-341 (2017).</li><li>Tarrago-Trani, M. T., Phillips, K. M., Cotty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-specific+method+validation+for+quantitative+analysis+of+vitamin+C+in+diverse+foods.">Matrix-specific method validation for quantitative analysis of vitamin C in diverse foods.</a> Journal of Food Composition and Analysis. 26 (1-2), 12-25 (2012).</li><li>Klimczak, I., Gliszczy&#324;ska-&#346;wig&#322;o, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+UPLC+and+HPLC+methods+for+determination+of+vitamin+C.">Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C.</a> Food Chemistry. 175, 100-105 (2015).</li><li>Z&#322;otek, U., &#346;wieca, M., Jakubczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+abiotic+elicitation+on+main+health-promoting+compounds,+antioxidant+activity+and+commercial+quality+of+butter+lettuce+(Lactuca+sativa+L.).">Effect of abiotic elicitation on main health-promoting compounds, antioxidant activity and commercial quality of butter lettuce (Lactuca sativa L.).</a> Food Chemistry. 148, 253-260 (2014).</li><li>Koh, E., Charoenprasert, S., Mitchell, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+organic+and+conventional+cropping+systems+on+ascorbic+acid,+vitamin+C,+flavonoids,+nitrate,+and+oxalate+in+27+varieties+of+spinach+(Spinacia+oleracea+L).">Effect of organic and conventional cropping systems on ascorbic acid, vitamin C, flavonoids, nitrate, and oxalate in 27 varieties of spinach (Spinacia oleracea L).</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (12), 3144-3150 (2012).</li><li>Ka&#322;uzewicz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+short-term+storage+on+the+content+of+flavonoids+and+vitamin+C+in+Broccoli.">The influence of short-term storage on the content of flavonoids and vitamin C in Broccoli.</a> European Journal of Horticultural Science. 77 (3), 137-143 (2012).</li><li>van Treuren, R., van Eekelen, H. D. L. M., Wehrens, R., de Vos, R. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+variation+in+the+lettuce+gene+pool:+towards+healthier+crop+varieties+and+food.">Metabolite variation in the lettuce gene pool: towards healthier crop varieties and food.</a> Metabolomics. 14 (11), 1-14 (2018).</li><li>Swartz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPLC:+An+introduction+and+review.">UPLC: An introduction and review.</a> Journal of Liquid Chromatography &amp; Related Technologies. 28 (7), 1253-1263 (2005).</li><li>Sp&#237;nola, V., Mendes, B., C&#226;mara, J. S., Castilho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+and+fast+UHPLC-PDA+methodology+for+determination+of+L-ascorbic+and+dehydroascorbic+acids+in+fruits+and+vegetables.+Evaluation+of+degradation+rate+during+storage.">An improved and fast UHPLC-PDA methodology for determination of L-ascorbic and dehydroascorbic acids in fruits and vegetables. Evaluation of degradation rate during storage.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (4), 1049-1058 (2012).</li><li>Ball, G. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Water-soluble vitamin assays in human nutrition. , (1994).</li><li>Bertol&#237;n, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+carotenoids,+tocopherols,+retinol+and+cholesterol+in+ovine+lyophilised+samples+of+milk,+meat,+and+liver+and+in+unprocessed/raw+samples+of+fat.">Simultaneous determination of carotenoids, tocopherols, retinol and cholesterol in ovine lyophilised samples of milk, meat, and liver and in unprocessed/raw samples of fat.</a> Food Chemistry. 257, 182-188 (2018).</li><li>Sp&#237;nola, V., Llorent-Mart&#237;nez, E. J., Castilho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+vitamin+C+in+foods:+Current+state+of+method+validation.">Determination of vitamin C in foods: Current state of method validation.</a> Journal of Chromatography A. 1369, 2-17 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=radiation+is+beneficial+for+yield+and+quality+of+indoor+cultivated+lettuce.">radiation is beneficial for yield and quality of indoor cultivated lettuce.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1-10 (2019).</li><li>Damerum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+genetic+basis+of+antioxidant+status+in+lettuce+(Lactuca+sativa).">Elucidating the genetic basis of antioxidant status in lettuce (Lactuca sativa).</a> Horticulture Research. 2 (15055), 1-13 (2015).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La vitamine C est un nutriment très important, mais c’est un composé très labile aussi, de sorte que sa quantification UPLC-UV dépend de facteurs multiples, tels que le stockage et la préparation d’échantillons, la méthode d’extraction et les conditions chromatographiques. Par conséquent, une procédure rapide et simple pour empêcher l’oxydation d’AA (avec le pouvoir antioxydant) au DHAA (sans propriétés antioxydantes) était nécessaire. Il était également crucial d’éviter les conditions élevées de pH et de température, ainsi que la lumière intense et une atmosphère oxydante pendant le traitement de l’échantillon pour promouvoir la stabilité du composé.
Afin de minimiser l’oxydation des AA, les mesures suivantes ont été prises. Tout d’abord, les échantillons ont été lyophilisés comme matériau de départ pour les deux protocoles afin d’assurer une quantification précise de la teneur en vitamine C et de manipuler facilement les échantillons. Cette option a été préférée au broyage fin, communément trouvé dans toute lalittérature 19,car la poussière dégèle très rapidement de sorte que l’eau redevient disponible. Au cours de la procédure d’extraction, un volume plus élevé d’une solution plus acide (8% d’acide acétique et 1% de MPA) a été utilisé comme extracteur dans le protocole optimisé (Fichier supplémentaire 2), qui a également agi comme un stabilisateur en empêchant la dégradation de l’AA. Cette solution contenait également EDTA comme un agent de chélating pour augmenter lastabilisation 16, contrairement à l’extracteur dans le protocole non optimisé (Fichier supplémentaire 2). En outre, nous avons testé si la procédure d’extraction pouvait être améliorée en utilisant deux extractions consécutives avec 2,5 mL d’extracteur au lieu d’un seul avec 5 mL et sous une atmosphère N2 au lieu des conditions atmosphériques standard. Les meilleurs résultats ont été obtenus en utilisant une seule extraction dans une atmosphère non modifiée, ce qui a simplifié le protocole en effectuant des étapes supplémentaires inutiles (données non affichées). D’autres modifications mineures ont également été introduites dans le protocole afin d’améliorer l’extraction (c.-à-d. la sonication), d’obtenir un extrait plus clair (filtration plus fine) et de réduire la durée du protocole (Dossier supplémentaire 2). En ce qui concerne les conditions chromatographiques, la validation de la méthode a été effectuée comme indiquéavant 18,garantissant de bons paramètres analytiques (tableau 3). En outre, l’utilisation de l’eau ultrapure avec de l’acide formique (pH 2.0) et du méthanol (98:2 v:v) avec un débit de 0,3 mL min-1, au lieu du phosphate monopotassium 30 mM (pH 3.0) à 1 mL min-1 comme phase mobile ( Fichier supplémentaire2), a abouti à une méthode améliorée. L’avancement le plus important a probablement été l’utilisation d’un système UPLC au lieu d’un HPLC, ce qui nous a permis un plus grand contrôle des conditions d’impact (comme la température) et résultant en des pics résolus AA sans interférences par des composés inconnus, dans un temps plus court et consommant moins de volume d’extrait (Fichier supplémentaire 2).
Néanmoins, il existe deux principales limites à cette méthode. La première est que le DHAA ne peut pas être mesuré directement à l’aide d’un détecteur UV en raison de sa faible absorptivité dans la gamme UV du spectre. Il est important de quantifier la teneur en DHAA parce qu’elle présente une certaine activité biologique et qu’elle est facilement convertible en AA dans le corps humain5. Pour cela, une réaction supplémentaire pour réduire le DHAA à AA est nécessaire, ainsi qu’une deuxième course chromatographic afin de mesurer TAA et ensuite déterminer DHAA indirectement en soustrayant le contenu AA de TAA (Figure 3). En ce sens, l’étape de réduction a été optimisée en utilisant une concentration plus élevée de l’agent réducteur (TNT), en augmentant le temps de réaction de 5 à 30 min, et en arrêtant la réaction avec de l’acide sulfurique (Fichier supplémentaire 2). La faible stabilité des AA constitue la deuxième limitation de la méthode. Comme AA commence à se dégrader 4 h après extraction (Fichier supplémentaire 1), il est nécessaire de le quantifier dans cet intervalle de temps. Ainsi, le nombre d’échantillons à extraire est conditionné par la procédure chromatographique. C’est pourquoi nous proposons de les geler à cette étape de ce protocole, mais dans ce cas, ils ne pourraient pas tous être placés dans l’autosampler UPLC pour être mesurés automatiquement. Heureusement, la RT réduite pour AA nous a permis d’obtenir des chromatogrammes de 3 min, beaucoup plus courts que les chromatogrammes de 7 min obtenus à l’aide de HPLC(Supplemental File 2). Par conséquent, la teneur en vitamine C pourrait être déterminée dans un nombre élevé d’échantillons dans une fenêtre de 4 h.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig03.jpg"> Figure 3 : Flux de travail de la quantification de la vitamine C dans la laitue et chez certains parents sauvages. Diagramme schématique du protocole optimisé montrant deux branches pour la détermination de seulement AA ou AA + DHAA (TAA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig03large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Comme la vitamine C est un nutriment essentiel pour l’homme et en raison de ses avantages importants pour la santé, elle est devenue l’objet de nombreuses études. Par conséquent, il a été quantifié dans une grande variété de cultures, y compris la laitue, l’un des légumes les plus consommés dans le monde entier. Les méthodes classiques simples ont été progressivement remplacées par des techniques de chromatographie liquide parce qu’elles sont plus spécifiques etprécises 10. Cependant, en raison de la nécessité d’une réaction supplémentaire pour quantifier à la fois, AA et DHAA via HPLC, dans certaines études sur la laitue, seulement AA14 ou seulement TAA11 (sans quantifier AA avant la réduction de DHAA en AA) ont été mesurés. En outre, seulement quelques auteurs ont quantifié AA et DHAA, en dépit de la contribution des deux molécules à l’activité antioxydante de vitamine C2. Néanmoins, la technique UPLC est devenue plus importante ces derniers temps en raison de ses performances plus élevées lors de la mesure de la vitamine C dans plusieurs cultures16. En comparant les résultats obtenus dans cette étude avec les deux méthodologies, UPLC et HPLC, ces avantages ont été confirmés : des pics AA bien définis grâce à une sensibilité plus élevée, et en très peu de temps, ont été atteints, ce qui implique également moins de ressources consommées. En dépit de l’efficacité d’UPLC, seulement Chen et autres20 ont appliqué cette technique pour mesurer la teneur en vitamine C dans la laitue, qui a toujours mené à une sous-estimation car seule la forme d’AA a été quantifiée.
En résumé, ce travail représente la première tentative réussie de déterminer la teneur totale en vitamine C non seulement dans différentes variétés de laitue, mais aussi chez certains de leurs parents sauvages. La quantification de la vitamine C est également essentielle pour sélectionner les laitues ayant une activité antioxydante plus élevée dans les programmes de reproduction. En ce sens, l’augmentation de la teneur totale en vitamine C chez les parents sauvages de laitue trouvés ici et l’augmentation de la teneur en AA rapportée dans les étudesprécédentes 14, ainsi que d’autres composésantioxydants 21, élargit les candidats appropriés pour améliorer la valeur nutritive des laitues.
En conclusion, même avec certaines limitations inhérentes à la nature de la vitamine C, comme sa dégradation progressive quelques heures après avoir été extrait ou la nécessité d’une réaction de réduction due à la faible absorptivité UV DHAA, il offre une méthode moins laborieuse et moins longue pour mesurer la teneur en vitamine C. En outre, il est également très robuste et montre une sensibilité élevée et la puissance de résolution. En outre, il est facilement transférable non seulement à d’autres matériaux végétaux avec des changements légers ou nuls, mais aussi aux produits transformés qui fournissent l’apport alimentaire en vitamine C à l’homme, ce qui donne lieu à un large éventail d’applications futures dans le domaine émergent des tests pour une qualité alimentaire fiable.

La laitue cultivée(Lactuca sativa L.) est l’un des légumes feuillus les plus produits et consommés dans le monde, avec une production totale d’environ 27,3 millions de tonnes en 20181. La laitue est perçue comme saine par les consommateurs. Les propriétés nutritionnelles sont principalement attribuées à la source de composés antioxydants dans la culture, tels que la vitamine C, entre autres comme les polyphénols et la vitamine E2. La vitamine C est un micronutriment essentiel pour l’homme contrairement à beaucoup d’autres vertébrés, car nous sommes incapables de le produire en raison de mutations présentes dans le codage génétique pour l’enzyme de dernière étape dans la voie biosynthétique3. Il est nécessaire pour un métabolisme cellulaire normal et il joue également un rôle important dans les réponses immunitaires principalement en raison de son activitéantioxydante 3,4.
La vitamine C totale est composée d’acide ascorbique (AA) et d’acide déshydroascorbique (DHAA). AA est la forme la plus biologiquement active de la vitamine, mais DHAA (son produit d’oxydation) montre également l’activité biologique et il peut être facilement converti en AA dans le corps humain5. Par conséquent, la quantification des deux formes est importante pour déterminer la teneur totale en vitamine C de toute culture horticole, laitue incluse.
Une grande variété d’approches basées sur différentes techniques analytiques ont été employées pour mesurer la vitamine C dans les légumes, telles que les méthodes enzymatiques, spectrophotométriques, et titrimétriques6,7,8. Bien que ces méthodes soient simples, elles ne sont pas chimiquement spécifiques pour AA9. Par conséquent, les méthodes chromatographiques sont préférées, en particulier la technique de chromatographie liquide-ultraviolet (HPLC-UV) haute performance, en raison de leur précisionplus élevée 10. HPLC-UV a été utilisé pour déterminer la vitamine C dans une grande diversité de cultures, comme le brocoli, épinards et laitue11,12,13. Cependant, la quantification simultanée d’AA et de DHAA est compliquée en raison de la faible absorptivity de DHAA dans la gamme UV du spectre. Alternativement, DHAA peut être déterminé indirectement en utilisant un agent réducteur qui convertit DHAA en AA, en mesurant l’acide ascorbique total (TAA), puis en calculant la différence entre TAA et AA. En raison de la nécessité d’une réaction de réduction, dans certaines études, seulement AA a été quantifié14, qui pourrait effectivement représenter une sous-estimation de l’activité de la vitamine C. Cette réaction de réduction supplémentaire est également nécessaire pour déterminer indirectement le DHAA, même lorsque la dernière avancée des techniques de chromatographie liquide, la chromatographie liquide ultra-performante (UPLC), est utilisée. Cette étape bénéficie également des avantages que l’UPLC présente par rapport à HPLC : efficacité et résolution plus élevées, sensibilité accrue, analyse plus courte du temps et consommation de solvantsplus faible 15. En conséquence, la technique UPLC-UV a été utilisée pour quantifier la vitamine C dans différentes cultures16.
En outre, AA est une molécule très labile; ainsi, il est important de développer un protocole qui empêche sa dégradation pendant le stockage de laitue et l’analyse de la vitamine C9. Dans ce contexte, le protocole suivant offre une quantification rapide et améliorée de la teneur en vitamine C dans la laitue par UPLC-UV, ainsi qu’une procédure d’extraction efficace. Non seulement les cultivars d’élite ont été inclus dans la présente étude, mais aussi les variétés locales traditionnelles et certains parents sauvages en raison de leur intérêt potentiel pour la sélection des cultures, en particulier dans l’amélioration de la valeur nutritive de la laitue.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT) &#8805;98% (Ellman&#8242;s reagent)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm f stainless steel ball</td>
			<td>Euro Aznar Supplies S.L.</td>
			<td>20112100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube for centrifuge</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>429946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL HPLC amber vial</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL syringe with needle</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>JS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Dealtalab</td>
			<td>202840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) &#8805;99.9% (titration)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene tube</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>429951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (CH3COOH) &#8805;99% purity glacial, ReagentPlus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrilo, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 &#181;m filtrated)</td>
			<td>Chem-lab</td>
			<td>CL00.0189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 &#181;m)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 1 L, 200 mL</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>191725, 191722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>766384</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15549004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>5438040100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer VirTis genesis 25EL</td>
			<td>VirTis</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph Multi Reax mixer</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph Reax top mixer</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an e&#955; Detector</td>
			<td>Hewlett Packard</td>
			<td>na</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid &#8805;99%, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol &#8805;99.9% (HPLC supergradient grade)</td>
			<td>ChemLab</td>
			<td>CL00.0189.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 10-1000 &#956;L</td>
			<td>Socorex</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 &#181;m)</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>54919</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE-silicone cap with preaperture</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R</td>
			<td>Gyrozen</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose filters 0.22 &#181;m (13 mm)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1015190-5108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose filters 0.45-&#181;m (13 mm)</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>SFCA-145-100</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer He&#955;ios &#946;</td>
			<td>Thermo Scientific Corporation</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4) 95.0-98.0% purity, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>WasserLab</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasons H-D</td>
			<td>Selecta</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks 1 L, 100 mL</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>191489, 191486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA e&#955; Detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved uplc-uv method for the quantification of vitamin c in lettuce varieties (lactuca sativa l.) and crop wild relatives (lactuca spp.)

Les vitamines, en particulier la vitamine C, sont d’importants micronutriments que l’on retrouve dans les fruits et légumes. La vitamine C est également un contributeur majeur à leur capacité antioxydante. La laitue est l’un des légumes les plus populaires parmi les consommateurs du monde entier. Un protocole précis pour mesurer la teneur en vitamine C de la laitue et d’autres espèces apparentées est crucial. Nous décrivons ici une méthode utilisant la technique ultra-haute performance chromatographie-ultraviolette liquide (UPLC-UV), dans laquelle les conditions de préparation d’échantillons, d’extraction de vitamines et de chromatographie ont été optimisées.
Des échantillons ont été prélevés pour représenter l’ensemble de la plante, congelée à -80 °C et lyophilisée pour prévenir l’oxydation indésirable et faciliter leur manipulation. L’extraction de la vitamine C a été effectuée dans les médias acides, ce qui a également contribué à sa stabilité. Comme la vitamine C peut être présente sous deux formes interconvertibles différentes, l’acide ascorbique (AA) et l’acide déshydroascorbique (DHAA), les deux composés doivent être mesurés pour une quantification précise. Le DHAA a été quantifié indirectement après sa réduction à AA parce que l’AA montre une absorptivity plus élevée que DHAA dans la gamme UV du spectre. À partir du même extrait, deux mesures ont été effectuées, une avant et une après cette réaction de réduction. Dans le premier cas, nous quantifiions la teneur en AA, et dans le second, nous avons quantifié la somme d’AA et de DHAA (TAA : acide ascorbique total) sous forme d’AA. Ensuite, la quantité de DHAA a été obtenue indirectement en soustrayant aa provenant de la première mesure de TAA. Ils ont été déterminés par UPLC-UV, en utilisant une norme commerciale AA pour construire une courbe d’étalonnage et d’optimiser la procédure chromatographique, pour obtenir des pics AA qui ont été complètement résolus en peu de temps. Ce protocole pourrait être facilement extrapolé à tout autre matériau végétal avec des changements légers ou nuls. Son exactitude a indiqué des différences statistiquement significatives autrement non perçues. D’autres points forts et limitations sont discutés plus en profondeur dans le manuscrit.

La quantification de la vitamine C dans les matrices de Lactuca nécessite le développement d’une approche chromagraphique qui peut assurer des résultats fiables. La figure 1A montre un chromatogramme résultant d’un protocole non optimisé (Fichier supplémentaire 2), qui présente un pic AA avec une « épaule » mineure non identifiée. Néanmoins, après avoir amélioré les conditions d’extraction et de chromatographie, un pic AA résolu sans interférences de composés inconnus a été atteint (Figure 1B). En outre, l’utilisation d’équipements UPLC-UV au lieu de HPLC-UV nous a permis de réduire le temps de rétention (RT) pour AA : 1.874 min dans les chromatogrammes optimisés contre 2.980 min dans les protocoles non optimisés(figure 1),ainsi que les temps de fonctionnement, 3 et 7 minutes pour les protocoles optimisés et non optimisés, respectivement.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig01.jpg"> Figure 1 : Chromatogrammes d’AA dans le même échantillon de laitue (cultivar commercial 'Begoña'). (A) chromatogramme HPLC-UV résultant d’un protocole non optimisé (conditions décrites dans le fichier supplémentaire 2). (B) chromatogramme UPLC-UV obtenu avec le protocole optimisé (conditions décrites dans le tableau 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig01large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Les interférences dans les pics d’AA, comme celles observées à la figure 1A,ont constamment entraîné une sous-estimation de la teneur en vitamine C (AA, DHAA et TAA) (figure 2) en raison d’une séparation insuffisante pendant le processus chromatographic que les zones de pointe qui se chevauchent ont été intégrés par une chute verticale au point le plus profond entre eux. Ce biais est particulièrement perceptible dans le cas des parents sauvages de cultures, en particulier dans la teneur en DHAA et TAA (Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig2v2.jpg"> Figure 2 : Distribution du contenu de la vitamine C. Parcelles de violon fendue de contenu DHAA, AA et TAA (mg g-1 de poids sec) dans les variétés de laitue commerciales et traditionnelles et certains parents sauvages en utilisant des protocoles non optimisés et optimisés. Les lignes noires affichent les valeurs moyennes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig2v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
En outre, l’utilisation d’un protocole non optimisé nous a empêchés d’extraire toute conclusion utile des résultats car ils ont montré tous les échantillons, les deux types de laitues et les parents sauvages, ayant une teneur similaire en vitamine C. En revanche, le protocole optimisé nous a permis de détecter des différences statistiquement significatives entre eux pour le contenu du DHAA et du TAA (tableau 4), les plus riches étant les espèces sauvages (figure 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Non optimisé</td>
			<td colspan="2">Optimisé</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Rapport F</td>
			<td>
p-valeur</td>
			<td>Rapport F</td>
			<td>
p-valeur</td>
		</tr>
<tr>
<td>DHAA (DHAA)</td>
			<td>0.460</td>
			<td>0.637ns
</td>
			<td>5.613</td>
			<td>0.009**</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aa</td>
			<td>0.070</td>
			<td>0,932ns
</td>
			<td>1.020</td>
			<td>0.374ns
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taa</td>
			<td>0.015</td>
			<td>0,985ns
</td>
			<td>4.438</td>
			<td>0.022*</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
ns, * et ** indiquent non significatif et significatif à p<0.05 et 0.01, respectivement.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 4 : Variation de la teneur en vitamine C. Les ratios F (quotients de deux écarts, la variance entre les groupes et la variance au sein du groupe) et les valeurs d’importance de l’ANOVA unilatère compte tenu du type de Lactuca (variétés de laitue commerciale, variétés de laitue traditionnelles et parents sauvages des cultures) pour la teneur en DHAA, AA et TAA dans des protocoles non optimisés et optimisés.
Dossier supplémentaire 1 : Stabilité AA et TAA à 5 °C sur 24 h. ( A )AAet TAA zones de pointe tout au long de 24 h. (B) AA et TAA contenu (mg g-1 de poids sec) tout au long de 24 h. Les barres représentent les écarts types de deux répliques techniques (n=2) conservées dans l’autosampler à 5 °C et protégées contre l’exposition à la lumière. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61440/Supplemental_File_1_.pptx" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 2 : Principales différences entre le protocole optimisé et le protocole non optimisé pour l’extraction et la quantification de TAA, AA et DHAA. Les échantillons utilisés étaient les mêmes dans les deux cas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61440/Supplemental__File_2_.xlsx" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp.

Nous présentons une méthode rapide et fiable pour quantifier la vitamine C dans Lactuca spp. en utilisant UPLC-UV, potentiellement transférable à d’autres plantes. Les étapes clés sont la préparation de l’échantillon et l’extraction de la vitamine C dans des conditions stables, la réduction de l’acide déshydroascorbique à l’acide ascorbique et l’optimisation de la procédure chromatographique.

Amélioration de la méthode UPLC-UV pour la quantification de la vitamine C dans les variétés delaitue (Lactuca sativa L.) et Crop Wild Relatives(Lactuca spp.)

Vitamins, especially vitamin C, are important micronutrients found in fruits and vegetables. Vitamin C is also a major contributor to their antioxidant ...

La vitamine C est un indicateur de la valeur nutritive des fruits et légumes. Nous avons besoin d’une méthode facile et fiable pour la quantifier, en particulier dans la laitue, le légume feuilux le plus consommé dans le monde. Cette méthode prévient la dégradation de la vitamine C, et fournit une extraction améliorée et une quantification rapide et fiable des acides ascorbiques et déshydroascorbiques, grâce à sa précision et sa sensibilité.Cette méthode peut être utilisée dans la technologie alimentaire pour créer des étiquettes de faits nutritionnels, en médecine pour étudier les effets des aliments sur la santé et dans la sélection des plantes, afin d’augmenter la teneur en vitamine C chez différentes espèces. Jose Angel Aranjuelo et Arantzazu Castellanos, deux analystes de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure avec Ines Medina Lozano. Pour préparer les échantillons de plantes, récoltez au moins une feuille externe et une feuille intérieure par plante et congelez immédiatement les feuilles dans de l’azote liquide, avant de les placer dans un entrepôt de moins 80 degrés Celsius.Pour lyophiliser les échantillons de plantes congelées, placez les tubes d’échantillon non plafonnés sur les plateaux dans la chambre de sécheuse du lyophilisateur et programmez le lyophilisateur tel qu’indiqué. Maintenir la température du condenseur à moins 80,2 degrés Celsius, et la constante du vide à 112 Lorsque le matériau est complètement sec, ajouter des boules d’acier inoxydable de 10 millimètres de diamètre aux échantillons lyophilisés, dans des tubes en polypropylène de 20 millilitres. Et utilisez un vortexer multi-tube, au moment et à l’intensité appropriés, pour moudre les échantillons dans une poussière fine.Pour préparer des solutions standard et de dilution de l’acide ascorbique, pesez exactement 10 milligrammes d’acide ascorbique standard sur un équilibre de précision. Et à 90 millilitres de phase mobile à l’échantillon. Utilisez un agitateur magnétique pour dissoudre l’échantillon et utilisez un flacon volumétrique pour mesurer avec précision 100 millilitres de la solution qui en résulte.Ajout d’eau ultrapure supplémentaire, acidifiée au pH 2 avec de l’acide formique, si nécessaire. Ensuite, préparez cinq dilutions du stock, pour obtenir une courbe d’étalonnage. En travaillant sous une faible intensité lumineuse, ajouter un échantillon de sol lyophilisé de 50 milligrammes et cinq millilitres de solvant d’extraction, à un tube de centrifugeuse en polypropylène de 15 millilitres et vortexer la solution pendant cinq secondes.Après avoir secoué l’échantillon pendant 10 minutes sur un shaker orbital à 2000 révolutions par minute, transférer le tube dans un bain ultrasonique pendant 10 minutes, à température ambiante et recueillir l’échantillon par centrifugation. Puis filtrer le supernatant à travers un filtre à cellulose régénéré de 0,22 micron, dans un flacon d’ambre de cinq millilitres, pour extraire les acides ascorbiques et déshydroascorbiques dans l’extrait un. Pour préparer la dilution pour déterminer la concentration d’acide ascorbique dans les échantillons de feuilles, ajouter 200 microlitres d’extrait un, et 800 microlitres d’eau ultrapure dans un flacon de chromatographie liquide ambrée de deux millilitres, et fermer le flacon avec un bouchon PTFE/silicone.Pour l’extraction totale de l’acide ascorbique, transférer 200 microlitres de l’extrait un, dans un flacon de chromatographie liquide ambrée de deux millilitres, et ajouter 200 microlitres de solution réducteur au flacon. Fermez le flacon avec une prise et vortex la solution pendant cinq secondes. Après une incubation de 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière, utilisez 200 microlitres d’acide sulfurique molaire de 0,4 molar, pour arrêter la réaction et stabiliser l’acide ascorbique, à un pH acide.Pour préparer la dilution pour déterminer la concentration totale d’acide ascorbique dans les échantillons, ajouter 400 microlitres d’eau ultrapure, au total extrait d’acide ascorbique deux. Fermez le flacon à l’aide d’une prise. Au moins une heure avant le début de l’expérience, confirmez que toutes les solutions de travail ont été chargées dans le système UPLC et allumez les trois modules UPLC.Lorsque le processus d’étalonnage interne est terminé, ouvrez le logiciel et chargez le programme instrumental. Une fois le logiciel chargé, cliquez sur Quaternary Solvent Manager et cliquez sur le bouton de la souris droite pour sélectionner la console de lancement, pour accéder à la console de gestion UPLC. Cliquez sur Système, Contrôle et Démarrage, pour procéder à la préparation et à la stabilisation de l’instrument UPLC, et cliquez sur Solvants Prime, QSM, vérifiez A, B, C, D, Seal Wash et Duration of Prime, plus de cinq minutes, pour purger toutes les lignes UPLC, pendant au moins cinq minutes.Cliquez sur SM, vérifiez Wash Solvent plus de 45 secondes. Vérifiez purge solvant, et 35 cycles pour purger et nettoyer l’injecteur. Pour équilibrer l’UPLC aux conditions de méthode, vérifiez equilibrate à la méthode et QSM, et réglez le flux à 0,3 millilitres par minute.Solvant A à 2%solvant B à 0%solvant C 98%et solvant D à 0%Encore en équilibre à méthode et SM et définir l’échantillon à 5 degrés Celsius, et la colonne à 30 degrés Celsius. Toujours dans Equilibrate to Method and Other, sélectionnez Lampe allumée et cliquez sur Démarrer. Laissez l’équipement se stabiliser pendant au moins une heure.Pour vérifier la stabilité, cliquez sur Launch Console System et QSM et sélectionnez QSM System Pressure, uniquement pour vérifier la pression dans la colonne. S’il n’y a pas de tendances identifiables dans les changements de pression, et que la valeur delta est inférieure à 10 livres par pouce carré de pression, dans l’écran de démarrage rapide, remplissez la matrice avec les noms des normes et des échantillons à analyser. Pour déterminer la concentration d’acide ascorbique dans les normes, injectez cinq microlitres de chaque dilution dans l’instrument UPLC, et effectuez la chromatographie, à partir de la plus diluée, à la solution la plus concentrée comme indiqué dans le tableau.Pour déterminer l’acide ascorbique et la concentration totale d’acide ascorbique dans les échantillons de feuilles, injectez cinq microlitres de l’extrait dilué un et en extrayez deux respectivement, dans l’instrument UPLC pour l’analyse chromatographic. Pour calculer l’acide ascorbique et les concentrations totales d’acide ascorbique, dans le logiciel cliquez sur Quickstart, Browse Project, Channels, le nom de la norme ou l’échantillon et le canal PDA un, 245 nanomètres à 1,2 nanomètres. Pour ouvrir les chromatogrammes standard et échantillon, cliquez sur le point de départ du chromatogramme et faites-le glisser jusqu’au point final, pour intégrer le pic correspondant dans les normes et les échantillons.Ensuite, utilisez les données des dilutions standard de l’acide ascorbique, pour construire une courbe d’étalonnage, pour représenter les valeurs d’absorption chromatographiquement déterminées et interpoler les valeurs d’absorption de l’échantillon, pour obtenir l’acide ascorbique et la concentration totale d’acide ascorbique, selon la formule. La quantification de la vitamine C dans les matrices de Lactuca, nécessite le développement d’une approche chromagraphique qui peut assurer des résultats fiables. Ici, un chromatogramme résultant d’une présentation de protocole non optimisé et d’un pic d’acide ascorbique, ainsi qu’un non identifié à l’épaule du mineur peuvent être observés.Néanmoins, après avoir amélioré les conditions d’extraction et chromatographiques, un pic d’acide ascorbique résolu sans interférences de composés inconnus peut être atteint. En outre, l’utilisation de l’équipement ultraviolet UPLC, au lieu de HPLC ultraviolet, réduit la rétention et les temps de fonctionnement. Les interférences dans les pics d’acide ascorbique, entraînent constamment une sous-estimation de la teneur en vitamine C, en raison d’une séparation insuffisante pendant le processus chromatographique.Comme les zones de pointe qui se chevauchent sont intégrées par une chute verticale au point le plus profond entre elles. En outre, l’utilisation d’un protocole non optimisé empêche l’extraction de toute conclusion utile, à partir des résultats. Comme tous les échantillons semblent avoir une teneur similaire en vitamine C, sous l’une de ses formes.En revanche, l’utilisation du protocole optimisé permet la détection de différences statistiquement significatives entre les différents types d’échantillons. Assurez-vous de recueillir plusieurs échantillons, de préserver correctement les échantillons, de minimiser l’exposition de l’échantillon aux agents oxydants et de quantifier les deux formes de vitamine C.La teneur totale en vitamine C peut être quantifiée non seulement chez n’importe quelle espèce végétale, mais aussi, dans n’importe quel fruit dans n’importe quel fruit et légume, ou même les aliments transformés avec peu de modifications techniques.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.)

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Isolement de lipoprotéines de haute densité pour les non-codant petit ARN Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Recherche

Biochimie

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

Une méthode efficace pour la synthèse de Peptoïdes avec Monomères / Arginine type de type Lysine mixte et de l&#39;évaluation de leur activité anti-leishmaniose

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

Une méthode de Culture Alternative pour maintenir l’hypométhylation génomique des cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de MEK inhibiteur PD0325901 et vitamine C

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Une méthode colorimétrique pour mesurer la teneur en fer chez les plantes

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilage en Leishmania, les cellules humaines et des testicules de souris

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Détection de l’activité de la Phospholipase C dans l’homogénat de cerveau de l’abeille

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Échelle du protéome Quantification d’homogénéité à l’échelle de la molécule unique d’étiquetage

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Quantification de la dynamique du réseau d'interaction des protéines à l'aide de la co-immunoprécipitation multiplexée

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Obtenir des données transcriptome de haute qualité à partir de graines de céréales par une méthode modifiée pour le profilage de l’expression génique

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

Analyse des taches d’ARN pour la détection et la quantification des microARN végétaux

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...