Name: improved uplc-uv method for the quantification of vitamin c in lettuce varieties (lactuca sativa l.) and crop wild relatives (lactuca spp.)
Uploaded: 2020-06-30T13:00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp. at JoVE.com

אנו מכירים בהכרת תודה בבנק החיידקים ירקות של סרגוסה (BGHZ-CITA, ספרד) והמרכז למשאבים גנטיים (CNG, Wageningen, הולנד) לאספקת הזרעים הדרושים לעבודה זו. אנו מודים J.A. A. Aranjuelo, א. Castellanos ו "מעבדה דה valoración nutritiva" מ CITA לתמיכה טכנית D.L. גודצ'יילד לסקירת השפה האנגלית. עבודה זו מומנה על ידי הפרויקטים RTA2017-00093-00-00-00 מהמכון הלאומי לחקלאות ומזון מחקר וטכנולוגיה (INIA) LMP164_18 מ ממשלת אראגון; ועל ידי התוכנית התפעולית FEDER Aragón 2014-2020 והקרן החברתית האירופית מהאיחוד האירופי [Grupos Consolidados A12-17R: "Grupo de investigación en fruticultura: caracterización, adaptación y mejora genéica" ו- A14-17R: "סיסטמאס אגרוגנאדרו alimentarios sostenibles" (SAGAS)]. I.M.L. נתמך על ידי חוזה קדם-רופא להכשרת רופאים ממשרד המדע הספרדי, חדשנות ואוניברסיטאות (MCIU) וסוכנות המחקר הממלכתית הספרדית (AEI).

<ol>
	<li>Llorach, R., Mart&#237;nez-S&#225;nchez, A., Tom&#225;s-Barber&#225;n, F. A., Gil, M. I., Ferreres, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+polyphenols+and+antioxidant+properties+of+five+lettuce+varieties+and+escarole.">Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole.</a> Food Chemistry. 108 (3), 1028-1038 (2008).</li><li>Carr, A. C., Frei, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+new+recommended+dietary+allowance+for+vitamin+C+based+on+antioxidant+and+health+effects+in+humans.">Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 69 (6), 1086-1107 (1999).</li><li>Carr, A. C., Vissers, M. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+or+food-derived+vitamin+C-Are+they+equally+bioavailable.">Synthetic or food-derived vitamin C-Are they equally bioavailable.</a> Nutrients. 5 (11), 4284-4304 (2013).</li><li>Lee, S. K., Kader, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preharvest+and+postharvest+factors+influencing+vitamin+C+content+of+horticultural+crops.">Preharvest and postharvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops.</a> Postharvest Biology and Technology. 20 (3), 207-220 (2000).</li><li>Shekhovtsova, T. N., Muginova, S. V., Luchinina, J. A., Galimova, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+methods+in+food+analysis:+determination+of+ascorbic+acid.">Enzymatic methods in food analysis: determination of ascorbic acid.</a> Analytica Chimica Acta. 573-574, 125-132 (2006).</li><li>Zhan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+exposure+during+storage+preserving+soluble+sugar+and+L-ascorbic+acid+content+of+minimally+processed+romaine+lettuce+(Lactuca+sativa+L.var.+longifolia).">Light exposure during storage preserving soluble sugar and L-ascorbic acid content of minimally processed romaine lettuce (Lactuca sativa L.var. longifolia).</a> Food Chemistry. 136 (1), 273-278 (2013).</li><li>Malejane, D. N., Tinyani, P., Soundy, P., Sultanbawa, Y., Sivakumar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficit+irrigation+improves+phenolic+content+and+antioxidant+activity+in+leafy+lettuce+varieties.">Deficit irrigation improves phenolic content and antioxidant activity in leafy lettuce varieties.</a> Food Science and Nutrition. 6 (2), 334-341 (2017).</li><li>Tarrago-Trani, M. T., Phillips, K. M., Cotty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-specific+method+validation+for+quantitative+analysis+of+vitamin+C+in+diverse+foods.">Matrix-specific method validation for quantitative analysis of vitamin C in diverse foods.</a> Journal of Food Composition and Analysis. 26 (1-2), 12-25 (2012).</li><li>Klimczak, I., Gliszczy&#324;ska-&#346;wig&#322;o, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+UPLC+and+HPLC+methods+for+determination+of+vitamin+C.">Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C.</a> Food Chemistry. 175, 100-105 (2015).</li><li>Z&#322;otek, U., &#346;wieca, M., Jakubczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+abiotic+elicitation+on+main+health-promoting+compounds,+antioxidant+activity+and+commercial+quality+of+butter+lettuce+(Lactuca+sativa+L.).">Effect of abiotic elicitation on main health-promoting compounds, antioxidant activity and commercial quality of butter lettuce (Lactuca sativa L.).</a> Food Chemistry. 148, 253-260 (2014).</li><li>Koh, E., Charoenprasert, S., Mitchell, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+organic+and+conventional+cropping+systems+on+ascorbic+acid,+vitamin+C,+flavonoids,+nitrate,+and+oxalate+in+27+varieties+of+spinach+(Spinacia+oleracea+L).">Effect of organic and conventional cropping systems on ascorbic acid, vitamin C, flavonoids, nitrate, and oxalate in 27 varieties of spinach (Spinacia oleracea L).</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (12), 3144-3150 (2012).</li><li>Ka&#322;uzewicz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+short-term+storage+on+the+content+of+flavonoids+and+vitamin+C+in+Broccoli.">The influence of short-term storage on the content of flavonoids and vitamin C in Broccoli.</a> European Journal of Horticultural Science. 77 (3), 137-143 (2012).</li><li>van Treuren, R., van Eekelen, H. D. L. M., Wehrens, R., de Vos, R. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+variation+in+the+lettuce+gene+pool:+towards+healthier+crop+varieties+and+food.">Metabolite variation in the lettuce gene pool: towards healthier crop varieties and food.</a> Metabolomics. 14 (11), 1-14 (2018).</li><li>Swartz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPLC:+An+introduction+and+review.">UPLC: An introduction and review.</a> Journal of Liquid Chromatography &amp; Related Technologies. 28 (7), 1253-1263 (2005).</li><li>Sp&#237;nola, V., Mendes, B., C&#226;mara, J. S., Castilho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+and+fast+UHPLC-PDA+methodology+for+determination+of+L-ascorbic+and+dehydroascorbic+acids+in+fruits+and+vegetables.+Evaluation+of+degradation+rate+during+storage.">An improved and fast UHPLC-PDA methodology for determination of L-ascorbic and dehydroascorbic acids in fruits and vegetables. Evaluation of degradation rate during storage.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (4), 1049-1058 (2012).</li><li>Ball, G. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Water-soluble vitamin assays in human nutrition. , (1994).</li><li>Bertol&#237;n, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+carotenoids,+tocopherols,+retinol+and+cholesterol+in+ovine+lyophilised+samples+of+milk,+meat,+and+liver+and+in+unprocessed/raw+samples+of+fat.">Simultaneous determination of carotenoids, tocopherols, retinol and cholesterol in ovine lyophilised samples of milk, meat, and liver and in unprocessed/raw samples of fat.</a> Food Chemistry. 257, 182-188 (2018).</li><li>Sp&#237;nola, V., Llorent-Mart&#237;nez, E. J., Castilho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+vitamin+C+in+foods:+Current+state+of+method+validation.">Determination of vitamin C in foods: Current state of method validation.</a> Journal of Chromatography A. 1369, 2-17 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=radiation+is+beneficial+for+yield+and+quality+of+indoor+cultivated+lettuce.">radiation is beneficial for yield and quality of indoor cultivated lettuce.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1-10 (2019).</li><li>Damerum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+genetic+basis+of+antioxidant+status+in+lettuce+(Lactuca+sativa).">Elucidating the genetic basis of antioxidant status in lettuce (Lactuca sativa).</a> Horticulture Research. 2 (15055), 1-13 (2015).</li></ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

ויטמין C הוא חומר מומר חשוב מאוד, אבל זה תרכובת מאוד labile מדי, כך כימות UPLC-UV שלה תלוי בגורמים מרובים, כגון אחסון והכנה מדגם, שיטת החילוץ ותנאים כרומטוגרפיים. לכן, הליך מהיר ופשוט כדי למנוע חמצון AA (עם כוח נוגד חמצון) DHAA (ללא תכונות נוגדות חמצון) היה צורך. זה היה גם קריטי כדי למנוע pH גבוה ותנאי טמפרטורה, כמו גם אור אינטנסיבי ואווירה חמצון במהלך טיפול מדגם כדי לקדם את היציבות של המתחם.
כדי למזער חמצון AA, ננקטו הצעדים הבאים. קודם כל, הדגימות היו lyophilized כחומר התחלתי עבור שני הפרוטוקולים כדי להבטיח כימות מדויקת של תוכן ויטמין C ולטפל בקלות דגימות. אפשרות זו העדיפה על פני שחיקה עדינה, הנפוצהלאורך הספרות 19, כמו האבק מפשיר מהר מאוד כך המים הופכים זמינים שוב. במהלך הליך החילוץ, נפח גבוה יותר של פתרון חומצי יותר (8% חומצה אצטית ו-1% MPA) שימש כתמצית בפרוטוקול האופטימלי(קובץ משלים 2),שגם שימש כמייצב על ידי מניעת השפלה של AA. פתרון זה הכיל גם EDTA כסוכן chelating כדי להגדילאת ייצוב 16, בניגוד לחילוץ בפרוטוקול לא ממוטב (קובץ משלים 2). יתר על כן, בדקנו אם הליך החילוץ יכול להיות משופר באמצעות שתי עקירות רצופות עם 2.5 מ"ל של מיצוי במקום אחד עם 5 מ"ל ותחת אטמוספרה N2 במקום התנאים האטמוספריים הסטנדרטיים. התוצאות הטובות ביותר הושגו באמצעות חילוץ אחד בלבד תחת אטמוספרה לא שונה, אשר פישט את הפרוטוקול על ידי ביצוע שלבים נוספים מיותרים (הנתונים לא מוצגים). שינויים קלים אחרים הוכנסו גם בפרוטוקול כדי לשפר את החילוץ (כלומר, sonication), להשיג תמצית ברורה יותר (סינון חכם יותר) ולהפחית את משך הפרוטוקול(קובץ משלים 2). לגבי התנאים הכרומטוגרפיים, האימות של השיטה בוצע כפישדווח לפני 18, הבטחת פרמטרים אנליטיים טובים(טבלה 3). חוץ מזה, השימוש במים אולטרה-פוריים עם חומצה פורמית (pH 2.0) ומתנול (98:2 v:v) עם זרימה של 0.3 מ"למינימום -1, במקום מונופוטאסיום פוספט 30 מ"ר (pH 3.0) ב 1 מ"למינימום -1 כשידר נייד(קובץ משלים 2),הביא בשיטה משופרת. ההתקדמות החשובה ביותר הייתה ככל הנראה באמצעות מערכת UPLC במקום HPLC, אשר אפשרה לנו שליטה רבה יותר של תנאי השפעה (כמו הטמפרטורה) וכתוצאה מכך נפתרו פסגות AA ללא הפרעות על ידי תרכובות לא ידועות, בזמן קצר יותר וצריכת פחות נפח שלתמצית (קובץ משלים 2).
עם זאת, ישנן שתי מגבלות עיקריות של שיטה זו. הראשון הוא כי DHAA לא ניתן למדוד ישירות באמצעות גלאי UV בשל ספיגתו הנמוכה בטווח UV של הספקטרום. חשוב לכמת את תוכן DHAA כי הוא מציג פעילות ביולוגית מסוימת והוא בקלות להמרה AA בגוף האדם5. כך נדרשת תגובה נוספת לצמצום DHAA ל-AA, יחד עם ריצה כרומטוגרפית שנייה על מנת למדוד את ת"א ולאחר מכן לקבוע את DHAA בעקיפין על-ידי חיסור תוכן AAמת"א (איור 3). במובן זה, שלב ההפחתה כבר אופטימיזציה באמצעות ריכוז גבוה יותר של סוכן הפחתת (DTT), הגדלת זמן התגובה מ 5 כדי 30 דקות, ולעצור את התגובה עם חומצה גופרתית(קובץ משלים 2). היציבות הנמוכה של AA מהווה את המגבלה השנייה של השיטה. כמו AA מתחיל להשפיל 4 שעות לאחר החילוץ(קובץ משלים 1),יש צורך לכמת אותו במרווח זמן זה. לכן, מספר הדגימות לחלץ מותנה על ידי ההליך הכרומטוגרפי. לכן אנו מציעים להקפיא אותם בשלב זה בפרוטוקול זה, אם כי במקרה זה, לא כולם יכולים להיות ממוקמים בsampler האוטומטי UPLC להימדד באופן אוטומטי. למרבה המזל, RT מופחת עבור AA אפשרה לנו להשיג 3 דקות כרומטוגרם, הרבה יותר קצר מאשר 7 דקות כרומטוגרם שהושג באמצעות HPLC(קובץ משלים 2). לפיכך, ניתן לקבוע תכולת ויטמין C במספר גבוה של דגימות בחלון של 4 שעות.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig03.jpg"> איור 3: זרימת עבודה של כימות ויטמין C חסה וכמה קרובי משפחה פראיים. דיאגרמה סכמטית של הפרוטוקול הממוטב המציגה שני ענפים לקביעת AA או AA בלבד + DHAA (TAA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
כמו ויטמין C הוא חומר מתזונה חיוני עבור בני אדם בשל היתרונות הבריאותיים החשובים שלה, זה הפך להיות האובייקט של מחקרים רבים. לכן, הוא כבר מכמת במגוון רחב של יבולים, כולל חסה, אחד הירקות הנצרכים ביותר ברחבי העולם. שיטות קלאסיות פשוטות הוחלפו בהדרגה על ידי טכניקות כרומטוגרפיה נוזלית כי הם ספציפיים יותרומדויקים 10. עם זאת, בשל הצורך בתגובה נוספת לכמת את שניהם, AA ו DHAA באמצעות HPLC, במחקרים מסוימים על חסה, רק AA14 או רק TAA11 (מבלי לכמת AA לפני הפחתה של DHAA לתוך AA) נמדדו. יתר על כן, רק כמה מחברים יש לכמת AA ו DHAA, למרות התרומה של שתי מולקולות לפעילות נוגדת חמצון ויטמין C2. אף על פי כן, טכניקת UPLC הפכה חשובה יותר בתקופה האחרונה בשל הביצועים הגבוהים שלה בעת מדידת ויטמין C במספר יבולים16. השוואת התוצאות שהתקבלו במחקר זה עם שתי מתודולוגיות, UPLC ו- HPLC, יתרונות אלה אושרו: פסגות AA מוגדרות היטב הודות לרגישות גבוהה יותר, ובזמנים קצרים מאוד, הושגו, אשר גם מרמז על פחות משאבים נצרכו. למרות יעילות UPLC, רק חן ואח '.20 יישמו טכניקה זו כדי למדוד את תכולת ויטמין C חסה, אשר עדיין הוביל הערכה נמוכה כמו רק טופס AA היה לכמת.
לסיכום, עבודה זו מייצגת את הניסיון המוצלח הראשון לקבוע את תכולת ויטמין C הכוללת לא רק בזני חסה שונים, אלא גם בחלק מקרוביהם הפראיים. כימות ויטמין C חיונית גם לבחירת חסה עם פעילות נוגדת חמצון גבוהה יותר בתוך תוכניות רבייה. במובן זה, תכולת ויטמין C הכוללת המוגברת של קרובי משפחה פראיים חסה נמצא כאן ואת תוכן AA מוגברתשדווחה במחקרים קודמים 14, כמו גם תרכובות נוגדות חמצוןאחרות 21, מרחיב את המועמדים המתאימים כדי לשפר את הערך התזונתי של חסה.
לסיכום, אפילו עם כמה מגבלות הטמונות בטבעו של ויטמין C, כמו ההשפלה ההדרגתית שלה כמה שעות לאחר שחולץ או הצורך בתגובת הפחתה בשל DHAA נמוך UV-ספיגה, הוא מציע פחות עבודה אינטנסיבית ושיטה פחות זמן רב כדי למדוד תוכן ויטמין C. בנוסף, הוא גם חזק מאוד ומראה רגישות גבוהה וכוח של רזולוציה. יתר על כן, זה ניתן להעברה בקלות לא רק לחומרים צמחיים אחרים עם שינויים קלים או ללא שינויים, אלא גם מוצרים מעובדים המספקים את הצריכה התזונתית של ויטמין C לבני אדם, אשר גורם למגוון רחב של יישומים עתידיים בתחום המתעוררים של בדיקות לאיכות מזון אמינה.

חסה מעובדת(Lactuca sativa L.) הוא אחד הירקות העלים המיוצרים והנצרכים ביותר בעולם, עם ייצור כולל של כ-27.3 מיליון טון בשנת 20181. חסה נתפסת כבריאה על ידי הצרכנים. המאפיינים התזונתיים מיוחסים בעיקר למקור של תרכובות נוגדות חמצון ביבול, כגון ויטמין C, בין היתר כמו פוליפנולים וויטמין E2. ויטמין C הוא מיקרונוטרינט חיוני עבור בני אדם שלא כמו בעלי חוליות רבים אחרים, כפי שאנו לא יכולים לייצר אותו בשל מוטציות הנוכחי בקידוד הגן עבור אנזים השלב האחרון במסלול biosynthetic3. הוא נדרש עבור חילוף חומרים נורמלי של תאים וזה גם ממלא תפקיד חשוב בתגובות חיסוניות בעיקר בשל פעילות נוגדת חמצון שלה3,4.
סה"כ ויטמין C מורכב חומצה אסקורבית (AA) וחומצה dehydroascorbic (DHAA). AA היא הצורה הפעילה ביותר מבחינה ביולוגית של הוויטמין, אבל DHAA (מוצר החמצון שלה) גם מראה פעילות ביולוגית וזה יכול בקלות להמיר AA בגוף האדם5. לכן, לכמת את שתי הצורות חשוב לקבוע את התוכן הכולל של ויטמין C של כל יבול גננות, חסה כלולה.
מגוון רחב של גישות המבוססות על טכניקות אנליטיות שונות שימשו כדי למדוד ויטמין C בירקות, כגון אנזימטי, ספקטרופוטומטרי,ושיטות titrimetric 6,7,8. למרות שיטות אלה הן פשוטות, הם אינם ספציפיים מבחינה כימית עבור AA9. כתוצאה מכך, שיטות כרומטוגרפיות מועדפות, במיוחד את ביצועים גבוהים נוזל כרומטוגרפיה אולטרה סגול (HPLC-UV) טכניקה, בגלל הדיוק הגבוה שלהם10. HPLC-UV שימש כדי לקבוע ויטמין C במגוון גדול של יבולים, כמו ברוקולי, תרדוחסה 11,12,13. עם זאת, הכימות בו זמנית של AA ו DHAA מסובך בשל הספיגה הנמוכה של DHAA בטווח UV של הספקטרום. לחלופין, ניתן לקבוע DHAA בעקיפין באמצעות סוכן הפחתת הממיר DHAA ל- AA, מדידת חומצה אסקורבית מוחלטת (TAA), ולאחר מכן חישוב ההבדל בין TAA ו- AA. בשל הצורך של תגובת הפחתה, במחקרים מסוימים, רק AA כבר כמת14, אשר למעשה יכול לייצג הערכה נמוכה של פעילות ויטמין C. תגובה זו הפחתה נוספת יש צורך גם כדי לקבוע DHAA בעקיפין גם כאשר ההתקדמות האחרונה בטכניקות כרומטוגרפיה נוזלית, כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים במיוחד (UPLC), משמש. שלב זה נהנה גם מהיתרונות ש-UPLC מציגה בהשוואה ל-HPLC: יעילות ורזולוציה גבוהות יותר, רגישות מוגברת, ניתוח זמן קצר יותר וצריכת ממסים נמוכהיותר 15. כתוצאה מכך, טכניקת UPLC-UV נוצלה לכמת ויטמין C בגידוליםשונים 16.
בנוסף, AA היא מולקולה מאוד labile; לכן, חשוב לפתח פרוטוקול המונע את השפלה שלו במהלך אחסון חסה וניתוח ויטמין C9. בהקשר זה, הפרוטוקול הבא מציע כימות מהירה ומשופרת של תכולת ויטמין C חסה על ידי UPLC-UV, כמו גם הליך חילוץ יעיל. לא רק cultivars האליטה נכללו במחקר הנוכחי, אלא גם landraces מסורתיים וכמה קרובי משפחה פראיים בשל העניין הפוטנציאלי שלהם גידול יבול, במיוחד בשיפור הערך התזונתי של חסה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT) &#8805;98% (Ellman&#8242;s reagent)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm f stainless steel ball</td>
			<td>Euro Aznar Supplies S.L.</td>
			<td>20112100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube for centrifuge</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>429946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL HPLC amber vial</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL syringe with needle</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>JS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Dealtalab</td>
			<td>202840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) &#8805;99.9% (titration)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene tube</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>429951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (CH3COOH) &#8805;99% purity glacial, ReagentPlus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrilo, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 &#181;m filtrated)</td>
			<td>Chem-lab</td>
			<td>CL00.0189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 &#181;m)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 1 L, 200 mL</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>191725, 191722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>766384</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15549004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>5438040100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer VirTis genesis 25EL</td>
			<td>VirTis</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph Multi Reax mixer</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph Reax top mixer</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an e&#955; Detector</td>
			<td>Hewlett Packard</td>
			<td>na</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid &#8805;99%, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol &#8805;99.9% (HPLC supergradient grade)</td>
			<td>ChemLab</td>
			<td>CL00.0189.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 10-1000 &#956;L</td>
			<td>Socorex</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 &#181;m)</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>54919</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE-silicone cap with preaperture</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R</td>
			<td>Gyrozen</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose filters 0.22 &#181;m (13 mm)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1015190-5108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose filters 0.45-&#181;m (13 mm)</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>SFCA-145-100</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer He&#955;ios &#946;</td>
			<td>Thermo Scientific Corporation</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4) 95.0-98.0% purity, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>WasserLab</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasons H-D</td>
			<td>Selecta</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks 1 L, 100 mL</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>191489, 191486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA e&#955; Detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved uplc-uv method for the quantification of vitamin c in lettuce varieties (lactuca sativa l.) and crop wild relatives (lactuca spp.)

ויטמינים, במיוחד ויטמין C, הם מיקרונוטריינטים חשובים שנמצאו בפירות וירקות. ויטמין C הוא גם תורם מרכזי ליכולת נוגדת החמצון שלהם. חסה הוא אחד הירקות הפופולריים ביותר בקרב צרכנים ברחבי העולם. פרוטוקול מדויק למדיסת תכולת ויטמין C חסה ומינים קשורים אחרים הוא קריטי. אנו מתארים כאן שיטה באמצעות אולטרה ביצועים גבוהים נוזלי כרומטוגרפיה אולטרה סגול (UPLC-UV) טכניקה, שבו הכנת מדגם, מיצוי ויטמין ותנאי כרומטוגרפיה היו אופטימיזציה.
דגימות נאספו כדי לייצג את הצמח כולו, קפוא ב -80 מעלות צלזיוס וlyophilized כדי למנוע חמצון לא רצוי והפוך את המניפולציה שלהם קלה יותר. החילוץ של ויטמין C בוצע בתקשורת חומצית, אשר גם תרם ליציבותו. כמו ויטמין C יכול להיות נוכח בשתי צורות שונות interconvertible, חומצה אסקורבית (AA) וחומצה dehydroascorbic (DHAA), שתי התרכובות יש למדוד לכמת מדויק. DHAA היה לכמת בעקיפין לאחר ההפחתה שלה AA כי AA מראה ספיגה גבוהה יותר מאשר DHAA בטווח UV של הספקטרום. מאותה תמצית בוצעו שתי מדידות, אחת לפני והשנייה לאחר אותה תגובת הפחתה. במקרה הראשון, כימתנו את תוכן ה-AA, ובמקרה השני כימתנו את הסכום של AA ו-DHAA (TAA: חומצה אסקורבית מוחלטת) בצורה של AA. לאחר מכן, כמות DHAA הושגה בעקיפין על ידי חיסור AA מגיע מהמדידה הראשונה מת"א. הם נקבעו על ידי UPLC-UV, באמצעות תקן AA מסחרי כדי לבנות עקומת כיול ולייטוב ההליך הכרומטוגרפי, כדי להשיג פסגות AA שנפתרו לחלוטין בזמן קצר. פרוטוקול זה יכול להיות מוערך בקלות לכל חומר צמח אחר עם שינויים קלים או ללא שינויים. הדיוק שלו חשף הבדלים משמעותיים סטטיסטית שלא ניתן היה יהיה להם. חוזקות ומגבלות אחרות נדונים לעומק בכתב היד.

כימות ויטמין C במטריצות לקטוקה דורשת פיתוח של גישה כרומטוגרפית שיכולה להבטיח תוצאות אמינות. איור 1א מציג כרומטוגרמה הנובעת מפרוטוקול לא ממוטב(קובץ משלים 2),המציג שיא AA יחד עם "כתף" קטנה לא מזוהה. אף על פי כן, לאחר שיפור החילוץ ותנאים כרומטוגרפיים, שיא AA נפתר ללא הפרעות של תרכובות לא ידועות הושג(איור 1B). בנוסף, השימוש בציוד UPLC-UV במקום HPLC-UV אפשר לנו להפחית את זמן השמירה (RT) עבור AA: 1.874 דקות כרומטוגרמות ממוטבות לעומת 2.980 דקות בפרוטוקולים שאינם ממוטבים(איור 1), כמו גםאת זמני הריצה, 3 ו-7 דקות עבור הפרוטוקולים הממוטבים ולא ממוטבים, בהתאמה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig01.jpg"> איור 1: כרומטוגרמות של AA באותה דגימת חסה (cultivar מסחרי 'Begoña'). (A) כרומטוגרמה HPLC-UV הנובעת פרוטוקול לא ממוטב (תנאים המתוארים בקובץ משלים 2). (ב)כרומטוגרמה UPLC-UV שהושגה עם הפרוטוקול הממוטב (תנאים המתוארים בטבלה 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
הפרעות בפסגות AA, כמו אלה שנצפו בדמות 1A, גרמו באופן עקבי להמעיט בערך הוויטמין C (AA, DHAA ו-TAA) בשל הפרדה לא מספקתבמהלךהתהליך הכרומטוגרפי, כאשר אזורי השיא החופפים שולבו על ידי ירידה אנכית בנקודה העמוקה ביותר ביניהם. הטיה זו בולטת במיוחד במקרה של קרובי משפחה פראיים יבול, במיוחד בתוכן DHAA ו TAA (איור 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig2v2.jpg"> איור 2: הפצת תכולת ויטמין C. חלקות כינור מפוצלות של תוכן DHAA, AA ו-TAA(מ"ג-1 במשקל יבש) בזני חסה מסחריים ומסורתיים וכמה קרובי משפחה פראיים באמצעות פרוטוקולים לא ממוטבים וממוטבים. קווים שחורים מציגים את ערכי ממוצע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig2v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
יתר על כן, השימוש בפרוטוקול לא ממוטב מנע מאיתנו לחלץ כל מסקנה שימושית מהתוצאות כפי שהם הראו את כל הדגימות, שני סוגי חסה וקרובי משפחה פראיים, בעל תוכן ויטמין C דומה. לעומת זאת, הפרוטוקול הממוטב אפשר לנו לזהות הבדלים משמעותיים סטטיסטית ביניהם עבור תוכן DHAA ו-TAA(טבלה 4),העשירים ביותר הם מיני הבר (איור 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">לא ממוטב</td>
			<td colspan="2">ממוטב</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>יחס F</td>
			<td>
p- ערך</td>
			<td>יחס F</td>
			<td>
p- ערך</td>
		</tr>
<tr>
<td>תפריט: אה לה לה 4</td>
			<td>0.460</td>
			<td>0.637ns
</td>
			<td>5.613</td>
			<td>0.009**</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aa</td>
			<td>0.070</td>
			<td>0.932ns
</td>
			<td>1.020</td>
			<td>0.374ns
</td>
		</tr>
<tr>
<td>ת"א (ת"</td>
			<td>0.015</td>
			<td>0.985ns
</td>
			<td>4.438</td>
			<td>0.022*</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
ns, * ו- ** מציינים לא משמעותי ומשמעותי ב- p<0.05 ו- 0.01, בהתאמה.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 4: וריאציה בתוכן של ויטמין C. יחסי F (מנה של שתי שונות, השונות בין הקבוצה והשונות בתוך הקבוצה) וערכי משמעות מ- ANOVA חד-כיוון בהתחשב בסוג Lactuca (זני חסה מסחריים, זני חסה מסורתיים וקרובי משפחה פראיים) עבור תוכן DHAA, AA ו-TAA בפרוטוקולים לא ממוטבים וממוטבים.
קובץ משלים 1: יציבות AA ו-TAA ב- 5 °C מעל 24 שעות. (A) אזורי שיא AA ו- TAA לאורך 24 שעות (ב)AA ו- TAA תוכן (מ"גg -1 של משקל יבש) לאורך 24 שעות. מייצגים את סטיות התקן של שני משכפלים טכניים (n=2) השמורים במשכך האוטומטי ב- 5°C ומוגנים מפני חשיפה לאור. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61440/Supplemental_File_1_.pptx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: ההבדלים העיקריים בין הפרוטוקול הממוטב לפרוטוקול שאינו ממוטב עבור חילוץ מכמת מכמת של ת"א, AA ו-DHAA. הדגימות בהן נעשה שימוש היו זהות בשני המקרים. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61440/Supplemental__File_2_.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp. at JoVE.com

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp.

אנו מציגים שיטה מהירה ואמינה לכמת ויטמין C ב Lactuca spp. באמצעות UPLC-UV, פוטנציאל להעברה לצמחים אחרים. השלבים העיקריים הם הכנת המדגם וחילוץ ויטמין C בתנאים יציבים, הפחתה של חומצה דהידרואסקורבית לחומצה אסקורבית ואופטימיזציה של ההליך הכרומטוגרפי.

שיטת UPLC-UV משופרת לכימות ויטמין C בזני חסה(לקטוקה סאטיבה L.) וקרובי משפחה פראיים(Lactuca spp.)

Vitamins, especially vitamin C, are important micronutrients found in fruits and vegetables. Vitamin C is also a major contributor to their antioxidant ...

ויטמין C הוא אינדיקציה לערך התזונתי של פירות וירקות. אנחנו צריכים שיטה קלה ואמינה לכמת אותו, במיוחד חסה, הירק עלים הנצרך ביותר ברחבי העולם. שיטה זו מונעת השפלה של ויטמין C, ומספקת מיצוי משופר וכמות מהיר ואמין של חומצות אסקורביות ודהידרוסקרביות, הודות לדיוק ולרגישות שלו.שיטה זו יכולה לשמש בטכנולוגיית מזון כדי ליצור תוויות עובדות תזונתיות, ברפואה כדי ללמוד השפעות מזון על בריאות ועל הרבייה של צמחים, כדי להגדיל את התוכן ויטמין C במינים שונים. הדגמת ההליך עם Ines מדינה לוזאנו, יהיה חוזה אנג'ל Aranjuelo ו Arantzazu Castellanos, שני אנליסטים מהמעבדה שלי. כדי להכין את דגימות הצמח, לקצור לפחות אחד חיצוני עלה פנימי אחד לכל צמח מיד להקפיא את העלים בחנקן נוזלי, לפני הצבת אותם מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון.כדי lyophilize דגימות הצמח הקפוא, מניחים את צינורות מדגם לא מנוצל על המגשים בתוך תא מייבש ההקפאה של lyophilizer, ולתכנת את lyophilizer כפי שצוין. לשמור על טמפרטורת מעבה במינוס 80.2 מעלות צלזיוס, ואת קבוע ואקום ב 112 כאשר החומר יבש לחלוטין, להוסיף כדורי נירוסטה בקוטר 10 מילימטר לדגימות ליופילים, ב 20 צינורות פוליפרופילן מיליליטר. ולהשתמש Vortexer רב צינור, בזמן המתאים ובעוצמה, כדי לטחון את הדגימות לתוך אבק דק.כדי להכין פתרונות מלאי ודילול של חומצה אסקורבית, שקלו בדיוק 10 מיליגרם של תקן חומצה אסקורבית באיזון מדויק. וב-90 מיליליטר של שלב נייד לדגימה. השתמשו בערבב מגנטי כדי להמיס את הדגימה, ולהשתמש בבקבוק נפחי כדי למדוד במדויק 100 מיליליטר של הפתרון שנוצר.הוספת מים אולטרה-חמים נוספים, חומציים ב-pH 2 עם חומצה פורמית, לפי הצורך. לאחר מכן הכינו חמישה דילולים מהמלאי, כדי להשיג עקומת כיול. עובדים תחת עוצמת אור נמוכה, מוסיפים 50 מיליגרם של דגימת קרקע ליופילית וחמישה מיליליטר של ממס מיצוי, לצינור צנטריפוגה פוליפרופילן 15 מיליליטר ומערבולת הפתרון במשך חמש שניות.לאחר טלטול המדגם במשך 10 דקות על שייקר מסלולית ב 2000 מהפכות לדקה, להעביר את הצינור לאמבט קולי במשך 10 דקות, בטמפרטורת החדר ולאסוף את המדגם על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן מסננים את העל-טבעי באמצעות מסנן תאית מחדש של 0.22 מיקרון, לתוך בקבוקון ענבר של חמישה מיליליטר, כדי לחלץ הן את החומצות האסקרביות והן את החומצות הדהידרוסקורביות בתמצית אחת. כדי להכין את הדילול לקביעת ריכוז החומצה האסקרבית בדגימות העלים, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של תמצית אחת, ו-800 מיקרוליטרים של מים אולטרה-חמים לבקבוקון כרומטוגרפיה נוזלי ענבר של שני מיליליטר, וסגרו את הבקבוקון עם תקע PTFE/סיליקון.עבור מיצוי חומצה אסקורבית הכוללת, להעביר 200 microliters של תמצית אחד, לתוך בקבוקון כרומטוגרפיה נוזלי ענבר שני מיליליטר, ולהוסיף 200 microliters של פתרון הפחתת הבקבוקון. סגור את הבקבוקון עם תקע ומערבולת הפתרון במשך חמש שניות. לאחר דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנת מפני אור, השתמש 200 microliters של 0.4 חומצה גופרתית Molar, כדי לעצור את התגובה כדי לייצב את החומצה אסקורבית, ל- pH חומצי.כדי להכין את הדילול לקביעת ריכוז החומצה האסקרבית הכולל בדגימות, להוסיף 400 microliters של מים אולטרה חוץ, כדי תמצית חומצה אסקורבית הכוללת שתיים. סגור את הבקבוקון עם תקע. לפחות שעה לפני תחילת הניסוי, ודא שכל פתרונות העבודה נטענו למערכת UPLC והפעל את שלושת מודולי UPLC.לאחר סיום תהליך הכיול הפנימי, פתח את התוכנה וטען את התוכנית האינסטרומנטלית. לאחר שהתוכנה נטענת לחץ על מנהל ממס Quaternary ולחץ על לחצן העכבר הימני כדי לבחור מסוף הפעלה, כדי לגשת למסוף הניהול של UPLC. לחץ על מערכת, בקרה והפעלה, כדי להמשיך הכנה וייצוב של מכשיר UPLC, ולחץ על ממסים ראשוניים, QSM, לבדוק A, B, C, D, שטיפת חותם ומשך של פריים, יותר מחמש דקות, כדי לטהר את כל קווי UPLC, לפחות חמש דקות.לחץ על SM, לבדוק לשטוף ממס גדול מ 45 שניות. בדוק לטהר ממס, ו 35 מחזורים כדי לטהר ולנקות את המזרק. כדי לצייד את UPLC לתנאי פעולת שירות, בדוק את שיווי המשקל לשיטה ול- QSM והגדר את הזרימה ל- 0.3 מיליליטר לדקה.ממס A עד 2%ממס B עד 0%ממס C 98%ו- D ממס עד 0% עדיין ב- Equilibrate לשיטה ו- SM והגדר את המדגם ל- 5 מעלות צלזיוס, ואת העמודה ל- 30 מעלות צלזיוס. עדיין ב'שיווי משקל לפעולות שירות' ו'אחר', בחרו 'מנורה ב' ולחצו על 'התחל'. אפשר לציוד להתייצב לפחות שעה.כדי לאמת את היציבות, לחץ על הפעל מערכת מסוף ו- QSM ובחר לחץ מערכת QSM, רק כדי לבדוק את הלחץ בעמודה. אם אין מגמות הניתנות לזיהוי בשינויי הלחץ, וערך הדלתא הוא פחות מ -10 פאונד לאינץ 'מרובע של לחץ, במסך ההתחלה המהירה, מלא את המטריצה בשמות התקנים והדגימות שיש לנתח. כדי לקבוע את ריכוז החומצה האסקרבית בתקנים, להזריק חמישה microliters של כל דילול לתוך מכשיר UPLC, ולבצע את הכרומטוגרפיה, החל מדולל ביותר, כדי הפתרון המרוכז ביותר כפי שצוין בטבלה.כדי לקבוע את החומצה האסקוריבית ואת ריכוז החומצה האקורבית הכולל בדגימות העלים, להזריק חמישה microliters של תמצית מדולל אחד ולחלץ שניים בהתאמה, לתוך מכשיר UPLC לניתוח כרומטוגרפי. כדי לחשב את החומצה אסקורבית ואת ריכוזי חומצה אסקורבית הכוללת, בתוכנה לחץ Quickstart, עיון פרויקט, ערוצים, שם התקן או המדגם ואת ערוץ מחשב כף יד אחד, 245 ננומטר ב 1.2 ננומטר. כדי לפתוח את הכרומטוגרמות הסטנדרטיות והדוגמאות, לחץ על נקודת ההתחלה של הכרומטוגרמה וגרור אותה לנקודת הסיום, כדי לשלב את השיא המתאים בסטנדרטים ובדגימות.לאחר מכן השתמש בנתונים מהדילולים הסטנדרטיים של חומצה אסקורבית, כדי לבנות עקומת כיול, כדי לייצג את ערכי הספיגה שנקבעו כרומטוגרפית ולאינטרפולציה של ערכי הספיגה של המדגם, כדי להשיג את החומצה האסקוריבית ואת ריכוז החומצה האסקרבית הכולל, על פי הנוסחה. כימות ויטמין C במטריצות Lactuca, דורש פיתוח של גישה כרומטוגרפית שיכולה להבטיח תוצאות אמינות. כאן, ניתן לראות כרומטוגרמה הנובעת מפרוטוקול לא ממוטב המציג ופסגת חומצה אסקורבית, יחד עם כתף כורה לא מזוהה.עם זאת, לאחר שיפור החילוץ ואת התנאים הכרומטוגרפיים, שיא חומצה אסקורבית נפתרה ללא הפרעות של תרכובות לא ידועות ניתן להשיג. בנוסף, השימוש בציוד אולטרה סגול של UPLC, במקום HPLC אולטרה סגול, מפחית את זמני השמירה וההפעלה. הפרעות בפסגות חומצה אסקורבית, גורמות באופן עקבי להמעיט בערכו של תוכן ויטמין C, עקב הפרדה לא מספקת במהלך התהליך הכרומטוגרפי.כאשר אזורי השיא החופפים משולבים בירידה אנכית בנקודה העמוקה ביותר ביניהם. יתר על כן, השימוש בפרוטוקול לא אופטימיזציה מונע את החילוץ של כל מסקנה שימושית, מן התוצאות. כמו כל הדגימות נראה שיש תוכן ויטמין C דומה, בכל אחת מהצורות שלה.לעומת זאת, השימוש בפרוטוקול הממוטב מאפשר זיהוי של הבדלים מובהקים סטטיסטית בין סוגי הדגימות השונים. הקפד לאסוף דגימות מרובות, כדי לשמר את הדגימות כראוי, כדי למזער את החשיפה של המדגם לסוכני חמצון ולכומת את שתי הצורות של ויטמין C.The התוכן הכולל ויטמין C ניתן לכמת לא רק בכל מיני צמחים, אלא גם, בכל פרי בכל פרי וירקות, או אפילו מזון מעובד עם שינויים בטכניקה מעטים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.)

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה עבור Non-קידוד RNA קטנים כימות

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

שיטה יעילה עבור הסינתזה של Peptoids עם מעורב ליזין מסוג / ארגינין-סוג מונומרים וערכה של אנטי-leishmanial פעילותם

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

שיטת תרבות חלופית כדי לשמור על Hypomethylation גנומית של תאי גזע עובריים בעכבר באמצעות MEK מעכב PD0325901 וויטמין C

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

שיטה ערכי צבע מוחלטים למדידת תכולת ברזל צמחים

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

זיהוי של Phospholipase C פעילות Homogenate המוח של דבורת הדבש

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

קבלת נתונים באיכות גבוהה טראנסקריפט מזרעי דגנים על ידי שיטה שהשתנתה ליצירת פרופיל ביטוי גנים

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

ה-RNA ניתוח כתמי לזיהוי וכימות של מיקרורונאס הצמח

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...