Name: improved uplc-uv method for the quantification of vitamin c in lettuce varieties (lactuca sativa l.) and crop wild relatives (lactuca spp.)
Uploaded: 2020-06-30T13:00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp. at JoVE.com

Riconosciamo con gratitudine la Vegetable Germplasm Bank di Saragozza (BGHZ-CITA, Spagna) e il Centre for Genetic Resources (CNG, Wageningen, Paesi Bassi) per aver fornito le sementi necessarie per questo lavoro. Ringraziamo J. A. Aranjuelo, A. Castellanos e "laboratorio de valoración nutritiva" del CITA per il supporto tecnico e D. L. Goodchild per aver esaminato la lingua inglese. Questo lavoro è stato finanziato dai progetti RTA2017-00093-00-00 dell'Istituto Nazionale per la Ricerca e la Tecnologia Agricola e Alimentare (INIA) e LMP164_18 dal Governo dell'Aragona; e dal Programma Operativo FEDER Aragona 2014-2020 e dal Fondo Sociale Europeo dell'Unione Europea [Grupos Consolidados A12-17R: "Grupo de investigación en fruticultura: caracterización, adaptación y mejora genéica" e A14-17R: "Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles" (SAGAS)]. I.M.L. è stato sostenuto da un contratto pre-dottorato per la formazione dei medici del Ministero spagnolo della scienza, dell'innovazione e delle università (MCIU) e dell'Agenzia statale spagnola per la ricerca (AEI).

1. Preparazione del materiale vegetale
<ol><li>Campionare almeno due foglie per pianta in tubi di polipropilene da 50 ml, una esterna (più vecchia) e una interna (più giovane) per rappresentare più accuratamente l'intera pianta. Raccogliere almeno tre repliche biologiche per ogni campione.</li>
	<li>Congelarli immediatamente usando azoto liquido e conservarli a -80 °C fino all'uso. Assicurarsi che l'azoto liquido non entra nei tubi; altrimenti potrebbero esplodere quando rimossi a causa dell'espansione del gas durante la vaporizzazione. ATTENZIONE: Guanti e uno scudo facciale sono necessari a causa dei potenziali pericoli associati all'uso di azoto liquido.</li>
	<li>Rimuovere i tappi dai tubi e posizionarli sui vassoi all'interno della camera di liofilizzatore del liofilizzatore (Tabella deimateriali)programmata come segue: -25 °C per 72 h, -10 °C per 10 h, 0 °C per 10 h e 20 °C per almeno 4 ore. Mantenere la temperatura del condensatore e la costante di vuoto durante il processo di liofilizzazione rispettivamente a -80,2 °C e 112 mTorr.</li>
	<li>Quando il materiale è completamente asciutto (tra 4 e 7 giorni a seconda della pianta e del grado di compattazione nel tubo), conservare rispettivamente a 4 °C, -20 °C o -80 °C per lo stoccaggio breve (da giorni a settimane), medio (mesi) o lungo (anni). Si raccomanda l'inclusione di sacchetti contenenti perline di gel di silice nei tubi contenenti campioni.</li>
	<li>Posizionare i campioni liofilizzati in tubi in polipropilene da 20 ml insieme a sfere di acciaio inossidabile di 10 mm di diametro e macinarli con un vortice multitubo utilizzando l'intensità e il tempo necessari per ottenere una polvere fine. NOTA: Durante l'intero processo, proteggere i campioni dall'esposizione alla luce diretta.</li>
</ol>2. Reagente e preparazione della soluzione
<ol><li>Preparare la soluzione di estrazione del solvente: 8% acido acetico (v/v), 1% MPA (acido meta-fosforico) (w/v), 1 mM EDTA (acido etilendiamminatetraacetico).<ol>
<li>Calcolare il volume totale di solvente necessario per elaborare l'intero insieme di campioni tenendo conto del fatto che verranno aggiunti 5 mL a ciascuno di essi. Per preparare 1 L della soluzione, aggiungere a un pallone: 30 g di MPA, 0,372 g di disidratazione EDTA, 80 ml di acido acetico e 500 ml di acqua ultrapura (scalare volumi e quantità di conseguenza). Sigillare la bocca del pallone con pellicola di plastica.</li>
		<li>Una volta sciolto con l'aiuto di un agitatore magnetico, utilizzare un pallone volumetrico per misurare con precisione 1 L, aggiungendo l'acqua ultrapura necessaria.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare il tampone di reazione di riduzione (0,5 M Tris (2-ammino-2-(idrossimetil)-1,3-propanodiolo) pH 9.0) e la soluzione riducente (40 mM DTT (1,4-ditiothreitol) con 0,5 M Tris pH 9.0).<ol>
<li>Calcolare il volume totale della soluzione riducente necessaria per elaborare l'intero insieme di campioni tenendo conto del fatto che verranno aggiunti 200 μL a ciascuno di essi. Per preparare 100 mL del tampone, aggiungere ad un bicchiere: 6.055 g di Tris e 90 mL di acqua ultrapura (scalare volumi e quantità di conseguenza). Sigillare la bocca del becher con pellicola di plastica.</li>
		<li>Una volta sciolto con l'aiuto di un agitatore magnetico, regolare la soluzione in pH 9.0 aggiungendo 2 M HCl e utilizzare un pallone volumetrico per misurare con precisione 100 mL, aggiungendo l'acqua ultrapura necessaria.</li>
		<li>Per preparare 100 mL della soluzione riducente, aggiungere ad un bicchiere: 0,629 g di DTT (purezza: 98%) e 90 mL del tampone (0,5 M Tris pH 9.0) precedentemente preparato (da 2.2.1 a 2.2.2). Ridimensionare i volumi e le quantità di conseguenza. Sigillare la bocca del becher con pellicola di plastica.</li>
		<li>Una volta sciolto con l'aiuto di un agitatore magnetico, utilizzare un pallone volumetrico per misurare con precisione 100 mL, aggiungendo il volume necessario di tampone 0,5 M Tris pH 9.0. NOTA: La soluzione riducente è molto instabile. Ecco perché si consiglia vivamente una soluzione appena fatta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Acido solforico (0,4 M H2SO4)<ol>
<li>Calcolare il volume totale di acido solforico di 0,4 M necessario per elaborare l'insieme dei campioni tenendo conto del fatto che a ciascuno di essi saranno aggiunti 200 μL. Per preparare 100 mL della soluzione, aggiungere ad un bicchiere: 80 mL di acqua ultrapura e poi 2,22 mL di H2SO4 (purezza: 96%, densità: 1,84 g mL-1). Utilizzare un pallone volumetrico per misurare con precisione 100 ml, aggiungendo l'acqua ultrapura necessaria. ATTENZIONE: L'acido solforico è molto corrosivo, quindi deve essere maneggiato con dispositivi di protezione e sotto il cofano. Inoltre, l'acido deve essere aggiunto all'acqua ultrapura, e non all'acqua all'acido, per ridurre i fumi ed evitare incidenti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Acido cloridrico (2 M HCl).<ol>
<li>Per preparare 100 mL di acido cloridrico 2 M, aggiungere ad un bicchiere: 80 mL di acqua ultrapura e poi 6,13 mL di HCl (purezza: 37%, densità: 1,19 g mL-1). Sigillare la bocca del becher con pellicola di plastica. Utilizzare un pallone volumetrico per misurare con precisione 100 ml, aggiungendo l'acqua ultrapura necessaria. Ridimensionare i volumi di conseguenza. ATTENZIONE: L'acido cloridrico è molto corrosivo, quindi deve essere maneggiato utilizzando dispositivi di protezione e sotto il cofano. Inoltre, l'acido deve essere aggiunto all'acqua ultrapura, e non all'acqua all'acido, per ridurre i fumi ed evitare incidenti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Standard AA (stock e diluizioni)<ol>
<li>Pesare esattamente 10 mg di standard AA (purezza: 99%) utilizzando un bilanciere di precisione e aggiungere 90 mL di fase mobile (pH d'acqua ultrapura 2.0 con acido formico).</li>
		<li>Una volta sciolto con l'aiuto di un agitatore magnetico, utilizzare un pallone volumetrico per misurare con precisione 100 mL, aggiungendo il volume necessario di acqua ultrapura pH 2.0 con acido formico. NOTA: Proteggere questa soluzione stock dall'esposizione alla luce.</li>
		<li>Preparare cinque diluizioni dal materiale della norma AA per ottenere una curva di taratura seguendo le istruzioni della tabella 1 e procedere con il passaggio 5.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Standard</td>
			<td>[AA] (μg mL-1)</td>
			<td>Soluzione AA (100 μg mL-1)(μL)</td>
			<td>Fase mobile (μL)a</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>5</td>
			<td>995</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>2.5</td>
			<td>25</td>
			<td>975</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>50</td>
			<td>950</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>900</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>250</td>
			<td>750</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">
A Acqua ultrapura pH 2.0 acidificata dall'acido formico.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Protocollo per la preparazione di cinque norme di AA (acido ascorbico). Sono indicati volumi di soluto e solvente per preparare ciascuna delle diverse concentrazioni delle norme.
3. Estrazione di AA e DHAA
NOTA: Si consiglia di lavorare in condizioni di bassa intensità luminosa durante le fasi di estrazione.
<ol><li>Ad un tubo di centrifuga in polipropilene da 15 ml aggiungere 50 mg di campione macinato llyofilizzato e 5 ml del solvente da estrazione (fase 2.1).</li>
	<li>Agitare la miscela usando un vortice per 5 s e quindi uno shaker orbitale per 10 minuti a 2000 giri/min.</li>
	<li>Introdurre il tubo in un bagno ad ultrasuoni per 10 minuti a temperatura ambiente con ultrasuoni attivati.</li>
	<li>Centrifuga a 4.000 x g per 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Prendi il supernatante, passalo attraverso un filtro di cellulosa rigenerata da 0,22 μm e conservalo in una fiala ambrata da 5 mL. Questo è l'estratto 1, che contiene AA e DHAA. NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui congelando gli estratti a -80 °C e proteggendoli dall'esposizione alla luce in quanto AA e DHAA sono molto instabili e si degradano facilmente in presenza di luce, ad alte temperature o in atmosfere ossidanti(File supplementare 1).</li>
</ol>4. Riduzione del DHAA ad AA per l'estrazione del TAA
<ol><li>Trasferire 200 μL di estratto 1 in una fiala ambrata da 2 mL per la cromatografia liquida e aggiungere 200 μL della soluzione riducente (fase 2.2). Chiudere il flaconcino con un tappo in PTFE-silicone con preapertura e scuoterlo con un vortice per 5 s.</li>
	<li>Lasciare riposare la soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente e proteggere dalla luce.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di 0,4 M H2SO4 per fermare la reazione e stabilizzare L'AA nel pH acido. La soluzione risultante è l'estratto 2, che contiene solo AA ed è in realtà TAA.</li>
</ol>5. Determinazione
<ol><li>Preparazione UPLC-UV<ol>
<li>Preparare le soluzioni di lavoro descritte nella tabella 2, opportunamente filtrate attraverso filtri da 0,22 μm, sonicate per almeno 10 minuti e posizionarle nel sistema UPLC.</li>
		<li>Accendere i tre moduli UPLC e attendere il termine del processo di calibrazione interno.</li>
		<li>Aprire il software (ad esempio Empower 3) e caricare il programma strumentale descritto nella tabella 2: Empower 3 | Esecuzione di esempi | Metodo della vitamina C | UPLC_PDA | Utilizzare guida introduttiva.</li>
		<li>Una volta caricato il software con il programma corretto, accedere alla console di gestione UPLC: Quaternary Solvent Manager | Fare clic con il pulsante destro del mouse | Console di avvio.</li>
		<li>Procedere alla preparazione e stabilizzazione dello strumento UPLC: Sistema | Proprietà Control | Avvio.<ol>
<li>Eliminare tutte le linee UPLC per almeno 5 min: Prime Solvents | | Controllare A, B, C, D e Lavaggio guarnizione | Durata di prime > 5 min.</li>
			<li>Spurgo e pulizia dell'iniettore: Solventi Primi | | Controllare il solvente wash (> 45 s) e controllare il solvente di spurgo (> 35 cicli).</li>
			<li>Equilibrare UPLC in base alle condizioni del metodo: Equilibrare al metodo | | Flusso (0,3 mL min-1) | Solvente A (2%) | Solvente B (0%) | Solvente C (98%) | Solvente D (0%); Equilibrate al metodo | | Campione (5 °C) | Colonna (30 °C) ed Equilibrato al metodo | | Controlla lampada attiva | Premere Start.</li>
			<li>Attendere almeno 1 h (si consiglia ancora più tempo) per stabilizzare l'apparecchiatura. La stabilità può essere verificata controllando la pressione nella colonna nella console di lancio: Sistema | Gestore dei solventi quaternari | Pressione del sistema QSM. Assicurarsi che non vi siano tendenze identificabili nelle variazioni di pressione (aumenti o diminuzioni) e che il valore delta sia inferiore a 10 psi.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nella schermata Guida introduttiva riempire la matrice con i nomi degli standard e degli esempi da analizzare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinazione AA negli standard<ol>
<li>Trasferire 1 mL di ciascuna delle cinque norme AA precedentemente preparate (fase 2.5.3) a flaconcini ambrati da 2 mL per la cromatografia liquida. Chiudere il flaconcino con un tappo in silicone PTFE con preapertura e iniettare 5 μL nello strumento UPLC.</li>
		<li>Effettuare la cromatografia seguendo la procedura descritta nella tabella 2 a partire dalla più diluita alla più concentrata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinazione AA nei campioni<ol>
<li>Pipetta 200 μL di Estratto 1 in una fiala ambrata da 2 mL per cromatografia liquida e aggiungere 800 μL di acqua ultrapura. Chiudere il flaconcino con un tappo in silicone PTFE con preapertura e iniettare 5 μL nello strumento UPLC.</li>
		<li>Effettuare la cromatografia secondo la procedura descritta nella tabella 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinazione del TAA nei campioni<ol>
<li>Aggiungere 400 μL di acqua ultrapura all'estratto 2. Chiudere il flaconcino con un tappo in silicone PTFE con preapertura e iniettare 5 μL nello strumento UPLC.</li>
		<li>Effettuare la cromatografia secondo la procedura descritta nella tabella 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componenti e parametri</td>
			<td>Descrizione</td>
		</tr>
<tr>
<td>Strumento</td>
			<td>Acquity UPLC Classe H</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rivelatore</td>
			<td>Rilevatore PDA eλ λabs per AA=245 nm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Software</td>
			<td>Empower 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colonna</td>
			<td>Acquity UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 μm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Canale A</td>
			<td>CH3OH</td>
		</tr>
<tr>
<td>Canale B/Lavaggio</td>
			<td>H2O:CH3OH (50:50 v:v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Canale C</td>
			<td>Acqua ultrapura pH 2.0 acidificata dall'acido formicoa
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Canale D/Lavaggio guarnizione</td>
			<td>Acqua ultrapura:acetonitrile (90:10 v:v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fase mobile</td>
			<td>0,3 mL min-1 di 2%A + 98%C (modalità isocratica)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatura colonna</td>
			<td>30 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatura autocampionatore</td>
			<td>5 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume di iniezione</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo di conservazione AA</td>
			<td>1.874 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo di esecuzione</td>
			<td>3 min</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
A Volume indeterminato di acido formico utilizzato fino alla regolazione del pH</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Procedura cromatografica ottimizzata per determinare l'AA (acido ascorbico) negli estratti di lattuga e parenti selvatici. Descrizione dei componenti, delle condizioni e delle soluzioni impiegate.
6. Quantificazione di AA e DHAA
<ol><li>Analisi statistica<ol>
<li>Determinare i parametri analitici del metodo cromatografico descritti da Bertolín etal. NOTA: I valori dei parametri presentati nella tabella 3 dovranno essere definiti in condizioni sperimentali specifiche.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parametri analitici del metodo</td>
			<td>Valori</td>
		</tr>
<tr>
<td>Intervallo lineare (μg mL-1)</td>
			<td>0.5-25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Equazione lineare</td>
			<td>y=53.143,03x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R2
</td>
			<td>0.99998</td>
		</tr>
<tr>
<td>Limiti di rivelazione (mg AA g-1 di sostanza secca)</td>
			<td>0.013</td>
		</tr>
<tr>
<td>Limiti di quantificazione (mg AA g-1 di sostanza secca)</td>
			<td>0.045</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ripetibilità (CV, %)a
</td>
			<td>1.75</td>
		</tr>
<tr>
<td>Precisione intermedia (CV,%)
</td>
			<td>4.22</td>
		</tr>
<tr>
<td>Recupero (Reg, %)b
</td>
			<td>95.6±2.4</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
A CV: coefficiente di variazione</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
b Il saggio di recupero è stato eseguito con 10 aliquote contenenti 50 mg dello stesso campione, 5 chiodate con 2 mg di AA g-1 di sostanza secca e 5 non chiodate. %Rec=([AA]campione con picco-[AA]sample)/([AA]spiked)x100.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: Parametri analitici ottimizzati per l'individuazione e la quantificazione di AA (acido ascorbico) e TAA (acido ascorbico totale). L'intervallo lineare, l'equazione e il coefficiente di determinazione della curva di taratura (R2),nonché i limiti di rivelazione e quantificazione di AA (lo stesso per TAA), e la ripetibilità, la precisione intermedia e il recupero sono stati ottenuti con un volume di iniezione del campione di 5 μL.
<ol start="2"><li>Calcolare la concentrazione di AA e TAA.<ol>
<li>Aprire i cromatogrammi standard ed esempio: Guida introduttiva | Proprietà Browse Project | I canali | "nome dello standard o del campione" | PDA Ch1 245 nm@1,2 nm.</li>
		<li>Integrare il picco corrispondente (AA o TAA) negli standard e nei campioni cliccando sul suo punto di partenza (circa 1.790 min) e trascinandolo con il mouse fino al punto finale (circa 1.910 min).</li>
		<li>Costruire una curva di taratura che rappresenti i valori di assorbanza determinati cromatograficamente (fase 5.2.) rispetto alla concentrazione delle cinque norme AA sopra preparate(tabella 1).</li>
		<li>Interpolare i valori di assorbanza dei campioni determinati nei passaggi 5.3 e 5.4 e ottenere rispettivamente la concentrazione di AA e TAA con la seguente formula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61440/61440equ01.jpg"> dove y è l'area di picco integrata, x è la concentrazione AA o TAA in ppm e m e n sono rispettivamente la pendenza e l'intercetta ydella linea di regressione ottenuta.</li>
		<li>Per calcolare la concentrazione di DHAA, applicare la seguente formula: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61440/61440equ02.jpg"> NOTA: Per ottenere le concentrazioni totali di DHAA, AA e TAA in mg g-1 di peso secco, i valori ottenuti interpolando direttamente nella curva di taratura dovranno essere moltiplicati per il volume totale dell'estratto e il fattore di diluizione applicato, e quindi divisi per il peso del campione utilizzato per effettuare l'estrazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Llorach, R., Mart&#237;nez-S&#225;nchez, A., Tom&#225;s-Barber&#225;n, F. A., Gil, M. I., Ferreres, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+polyphenols+and+antioxidant+properties+of+five+lettuce+varieties+and+escarole.">Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole.</a> Food Chemistry. 108 (3), 1028-1038 (2008).</li><li>Carr, A. C., Frei, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+new+recommended+dietary+allowance+for+vitamin+C+based+on+antioxidant+and+health+effects+in+humans.">Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 69 (6), 1086-1107 (1999).</li><li>Carr, A. C., Vissers, M. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+or+food-derived+vitamin+C-Are+they+equally+bioavailable.">Synthetic or food-derived vitamin C-Are they equally bioavailable.</a> Nutrients. 5 (11), 4284-4304 (2013).</li><li>Lee, S. K., Kader, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preharvest+and+postharvest+factors+influencing+vitamin+C+content+of+horticultural+crops.">Preharvest and postharvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops.</a> Postharvest Biology and Technology. 20 (3), 207-220 (2000).</li><li>Shekhovtsova, T. N., Muginova, S. V., Luchinina, J. A., Galimova, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+methods+in+food+analysis:+determination+of+ascorbic+acid.">Enzymatic methods in food analysis: determination of ascorbic acid.</a> Analytica Chimica Acta. 573-574, 125-132 (2006).</li><li>Zhan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+exposure+during+storage+preserving+soluble+sugar+and+L-ascorbic+acid+content+of+minimally+processed+romaine+lettuce+(Lactuca+sativa+L.var.+longifolia).">Light exposure during storage preserving soluble sugar and L-ascorbic acid content of minimally processed romaine lettuce (Lactuca sativa L.var. longifolia).</a> Food Chemistry. 136 (1), 273-278 (2013).</li><li>Malejane, D. N., Tinyani, P., Soundy, P., Sultanbawa, Y., Sivakumar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficit+irrigation+improves+phenolic+content+and+antioxidant+activity+in+leafy+lettuce+varieties.">Deficit irrigation improves phenolic content and antioxidant activity in leafy lettuce varieties.</a> Food Science and Nutrition. 6 (2), 334-341 (2017).</li><li>Tarrago-Trani, M. T., Phillips, K. M., Cotty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-specific+method+validation+for+quantitative+analysis+of+vitamin+C+in+diverse+foods.">Matrix-specific method validation for quantitative analysis of vitamin C in diverse foods.</a> Journal of Food Composition and Analysis. 26 (1-2), 12-25 (2012).</li><li>Klimczak, I., Gliszczy&#324;ska-&#346;wig&#322;o, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+UPLC+and+HPLC+methods+for+determination+of+vitamin+C.">Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C.</a> Food Chemistry. 175, 100-105 (2015).</li><li>Z&#322;otek, U., &#346;wieca, M., Jakubczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+abiotic+elicitation+on+main+health-promoting+compounds,+antioxidant+activity+and+commercial+quality+of+butter+lettuce+(Lactuca+sativa+L.).">Effect of abiotic elicitation on main health-promoting compounds, antioxidant activity and commercial quality of butter lettuce (Lactuca sativa L.).</a> Food Chemistry. 148, 253-260 (2014).</li><li>Koh, E., Charoenprasert, S., Mitchell, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+organic+and+conventional+cropping+systems+on+ascorbic+acid,+vitamin+C,+flavonoids,+nitrate,+and+oxalate+in+27+varieties+of+spinach+(Spinacia+oleracea+L).">Effect of organic and conventional cropping systems on ascorbic acid, vitamin C, flavonoids, nitrate, and oxalate in 27 varieties of spinach (Spinacia oleracea L).</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (12), 3144-3150 (2012).</li><li>Ka&#322;uzewicz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+short-term+storage+on+the+content+of+flavonoids+and+vitamin+C+in+Broccoli.">The influence of short-term storage on the content of flavonoids and vitamin C in Broccoli.</a> European Journal of Horticultural Science. 77 (3), 137-143 (2012).</li><li>van Treuren, R., van Eekelen, H. D. L. M., Wehrens, R., de Vos, R. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+variation+in+the+lettuce+gene+pool:+towards+healthier+crop+varieties+and+food.">Metabolite variation in the lettuce gene pool: towards healthier crop varieties and food.</a> Metabolomics. 14 (11), 1-14 (2018).</li><li>Swartz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPLC:+An+introduction+and+review.">UPLC: An introduction and review.</a> Journal of Liquid Chromatography &amp; Related Technologies. 28 (7), 1253-1263 (2005).</li><li>Sp&#237;nola, V., Mendes, B., C&#226;mara, J. S., Castilho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+and+fast+UHPLC-PDA+methodology+for+determination+of+L-ascorbic+and+dehydroascorbic+acids+in+fruits+and+vegetables.+Evaluation+of+degradation+rate+during+storage.">An improved and fast UHPLC-PDA methodology for determination of L-ascorbic and dehydroascorbic acids in fruits and vegetables. Evaluation of degradation rate during storage.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (4), 1049-1058 (2012).</li><li>Ball, G. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Water-soluble vitamin assays in human nutrition. , (1994).</li><li>Bertol&#237;n, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+carotenoids,+tocopherols,+retinol+and+cholesterol+in+ovine+lyophilised+samples+of+milk,+meat,+and+liver+and+in+unprocessed/raw+samples+of+fat.">Simultaneous determination of carotenoids, tocopherols, retinol and cholesterol in ovine lyophilised samples of milk, meat, and liver and in unprocessed/raw samples of fat.</a> Food Chemistry. 257, 182-188 (2018).</li><li>Sp&#237;nola, V., Llorent-Mart&#237;nez, E. J., Castilho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+vitamin+C+in+foods:+Current+state+of+method+validation.">Determination of vitamin C in foods: Current state of method validation.</a> Journal of Chromatography A. 1369, 2-17 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=radiation+is+beneficial+for+yield+and+quality+of+indoor+cultivated+lettuce.">radiation is beneficial for yield and quality of indoor cultivated lettuce.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1-10 (2019).</li><li>Damerum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+genetic+basis+of+antioxidant+status+in+lettuce+(Lactuca+sativa).">Elucidating the genetic basis of antioxidant status in lettuce (Lactuca sativa).</a> Horticulture Research. 2 (15055), 1-13 (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La vitamina C è un nutriente molto importante, ma è anche un composto molto labile, quindi la sua quantificazione UPLC-UV dipende da molteplici fattori, come la conservazione e la preparazione del campione, il metodo di estrazione e le condizioni cromatografiche. Pertanto, era necessaria una procedura rapida e semplice per prevenire l'ossidazione dell'AA (con potere antiossidante) al DHAA (senza proprietà antiossidanti). Era anche fondamentale evitare condizioni di pH e temperatura elevate, nonché luce intensa e un'atmosfera ossidante durante il trattamento del campione per promuovere la stabilità del composto.
Per ridurre al minimo l'ossidazione dell'AA, sono state adottate le seguenti misure. Prima di tutto, i campioni sono stati liofilizzati come materiale di partenza per entrambi i protocolli per garantire un'accurata quantificazione del contenuto di vitamina C e manipolare facilmente i campioni. Questa opzione è stata preferita rispetto alla rettifica fine, comunemente trovata in tutta laletteratura 19, poiché la polvere si scongela molto rapidamente in modo che l'acqua diventi nuovamente disponibile. Durante la procedura di estrazione, un volume maggiore di una soluzione più acida (8% acido acetico e 1% MPA) è stato utilizzato come estrattore nel protocollo ottimizzato (File supplementare 2), che ha anche agito come stabilizzatore prevenendo la degradazione AA. Questa soluzione conteneva anche EDTA come agente chelating per aumentare lastabilizzazione 16, a differenza dell'estrattore nel protocollo non ottimizzato (File supplementare 2). Inoltre, abbiamo testato se la procedura di estrazione potesse essere migliorata utilizzando due estrazioni consecutive con 2,5 mL di estrattore invece di una singola con 5 mL e sottoun'atmosfera N 2 invece delle condizioni atmosferiche standard. I migliori risultati sono stati raggiunti utilizzando una sola estrazione in un'atmosfera non modificata, che ha semplificato il protocollo effettuando passaggi aggiuntivi non necessari (dati non mostrati). Altre modifiche minori sono state introdotte nel protocollo al fine di migliorare l'estrazione (cioè la sonicazione), ottenere un estratto più chiaro (filtrazione più fine) e ridurre la durata del protocollo(File supplementare 2). Per quanto riguarda le condizioni cromatografiche, la convalida del metodo è stata effettuata come riportatoprima delle 18,garantendo buoni parametri analitici(tabella 3). Inoltre, l'uso di acqua ultrapura con acido formico (pH 2.0) e metanolo (98:2 v:v) con un flusso di 0,3 mL min-1, invece di fosfato monopotassio 30 mM (pH 3.0) a 1 mL min-1 come fase mobile(File supplementare 2),ha portato a un metodo migliorato. Il progresso più importante è stato probabilmente l'utilizzo di un sistema UPLC al posto di un HPLC, che ci ha permesso un maggiore controllo delle condizioni di impatto (come la temperatura) e con conseguente risoluzione dei picchi AA senza interferenze da parte di composti sconosciuti, in un tempo più breve e consumando meno volume di estratto(File supplementare 2).
Tuttavia, ci sono due limitazioni principali di questo metodo. Il primo è che il DHAA non può essere misurato direttamente utilizzando un rivelatore UV a causa della sua bassa assorbibilità nell'intervallo UV dello spettro. È importante quantificare il contenuto di DHAA perché presenta una certa attività biologica ed è facilmente convertibile in AA nel corpo umano5. A tal fine, è necessaria una reazione aggiuntiva per ridurre il DHAA all'AA, insieme a una seconda esecuzione cromatografica al fine di misurare il TAA e quindi determinare indirettamente il DHAA sottraendo contenuto AA da TAA (Figura 3). In questo senso, il passaggio di riduzione è stato ottimizzato utilizzando una maggiore concentrazione dell'agente riducente (DTT), aumentando il tempo di reazione da 5 a 30 minuti e fermando la reazione con acido solforico(File supplementare 2). La bassa stabilità di AA costituisce la seconda limitazione del metodo. Quando AA inizia a degradarsi 4 ore dopo l'estrazione (File supplementare 1), è necessario quantificarlo in questo intervallo di tempo. Quindi, il numero di campioni da estrarre è condizionato dalla procedura cromatografica. Ecco perché proponiamo di congelarli in quella fase di questo protocollo, anche se in tal caso non tutti potrebbero essere inseriti nell'autocampionatore UPLC per essere misurati automaticamente. Fortunatamente, l'RT ridotto per AA ci ha permesso di ottenere cromatogrammi da 3 minuti, molto più brevi dei cromatogrammi da 7 minuti ottenuti utilizzando HPLC(File supplementare 2). Pertanto, il contenuto di vitamina C potrebbe essere determinato in un numero elevato di campioni in una finestra di 4 ore.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig03.jpg"> Figura 3: Flusso di lavoro della quantificazione della vitamina C nella lattuga e di alcuni parenti selvatici. Diagramma schematico del protocollo ottimizzato che mostra due rami per la determinazione solo di AA o AA + DHAA (TAA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Poiché la vitamina C è un nutriente essenziale per l'uomo e a causa dei suoi importanti benefici per la salute, è diventata oggetto di molti studi. Pertanto, è stato quantificato in una grande varietà di colture, tra cui la lattuga, una delle verdure più consumate in tutto il mondo. Semplici metodi classici sono stati gradualmente sostituiti da tecniche di cromatografia liquida perché sono più specifici e accurati10. Tuttavia, a causa della necessità di una reazione aggiuntiva per quantificare entrambi, AA e DHAA tramite HPLC, in alcuni studi sulla lattuga, sono stati misurati solo AA14 o solo TAA11 (senza quantificare AA prima della riduzione del DHAA in AA). Inoltre, solo pochi autori hanno quantificato AA e DHAA, nonostante il contributo di entrambe le molecole all'attività antiossidante della vitamina C2. Tuttavia, la tecnica UPLC è diventata più importante negli ultimi tempi a causa delle sue prestazioni più elevate quando misura la vitamina C in diversecolture 16. Confrontando i risultati ottenuti in questo studio con le due metodologie, UPLC e HPLC, questi vantaggi sono stati confermati: sono stati raggiunti picchi AA ben definiti grazie a una maggiore sensibilità, e in tempi molto brevi, che implica anche meno risorse consumate. Nonostante l'efficienza dell'UPLC, solo Chen etal.
In sintesi, questo lavoro rappresenta il primo tentativo riuscito di determinare il contenuto totale di vitamina C non solo in diverse varietà di lattuga, ma anche in alcuni dei loro parenti selvatici. La quantificazione della vitamina C è anche essenziale per selezionare lattughe con una maggiore attività antiossidante all'interno dei programmi di allevamento. In questo senso, l'aumento del contenuto totale di vitamina C nei parenti selvatici di lattuga trovato qui e l'aumento del contenuto di AA riportato negli studiprecedenti 14, così come altri compostiantiossidanti 21, amplia i candidati adatti per migliorare il valore nutrizionale delle lattughe.
In conclusione, anche con alcune limitazioni inerenti alla natura della vitamina C, come la sua graduale degradazione poche ore dopo l'estrazione o la necessità di una reazione di riduzione dovuta alla bassa assorbibilità UV DHAA, offre un metodo meno laborioso e meno dispendioso in termini di tempo per misurare il contenuto di vitamina C. Inoltre, è anche molto robusto e mostra un'alta sensibilità e potenza di risoluzione. Inoltre, è facilmente trasferibile non solo ad altri materiali vegetali con lievi o nessuna modifica, ma anche a prodotti trasformati che forniscono l'assunzione alimentare di vitamina C all'uomo, il che dà origine a una vasta gamma di applicazioni future nel campo emergente dei test per una qualità alimentare affidabile.

La lattuga coltivata(Lactuca sativa L.) è una delle verdure a foglia più prodotte e consumate al mondo, con una produzione totale di circa 27,3 milioni di tonnellate nel 20181. La lattuga è percepita come sana dai consumatori. Le proprietà nutrizionali sono principalmente attribuite alla fonte di composti antiossidanti nella coltura, come la vitamina C, tra gli altri come polifenoli e vitamina E2. La vitamina C è un micronutriente essenziale per l'uomo a differenza di molti altri vertebrati, in quanto non siamo in grado di produrlo a causa di mutazioni presenti nel gene che codifica per l'enzima dell'ultimo passo nella via biosintetica3. È necessario per un normale metabolismo cellulare e svolge anche un ruolo importante nelle risposte immunitarie principalmente a causa della sua attivitàantiossidante 3,4.
La vitamina C totale è composta da acido ascorbico (AA) e acido deidroascorbico (DHAA). L'AA è la forma biologicamente più attiva della vitamina, ma il DHAA (il suo prodotto di ossidazione) mostra anche attività biologica e può essere facilmente convertito in AA nel corpo umano5. Pertanto, quantificare entrambe le forme è importante per determinare il contenuto totale di vitamina C di qualsiasi coltura orticola, lattuga inclusa.
Un'ampia varietà di approcci basati su diverse tecniche analitiche sono stati utilizzati per misurare la vitamina C nelle verdure, come metodi enzimatici, spettrofotometrici e titrimetrici6,7,8. Sebbene questi metodi siano semplici, non sono chimicamente specifici per AA9. Di conseguenza, i metodi cromatografici sono preferiti, in particolare la tecnica ad alte prestazioni della cromatografia liquida-ultravioletta (HPLC-UV), a causa della loro maggioreprecisione 10. HPLC-UV è stato utilizzato per determinare la vitamina C in una grande varietà di colture, come broccoli, spinaci e lattuga11,12,13. Tuttavia, la quantificazione simultanea di AA e DHAA è complicata a causa della bassa assorbibilità del DHAA nell'intervallo UV dello spettro. In alternativa, il DHAA può essere determinato indirettamente utilizzando un agente riducente che converte il DHAA in AA, misurando l'acido ascorbico totale (TAA), e quindi calcolando la differenza tra TAA e AA. A causa della necessità di una reazione di riduzione, in alcuni studi, solo AA è stato quantificato14, il che potrebbe effettivamente rappresentare una sottovalutazione dell'attività della vitamina C. Tale reazione di riduzione aggiuntiva è necessaria anche per determinare indirettamente il DHAA anche quando viene utilizzato l'ultimo progresso nelle tecniche di cromatografia liquida, cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC). Questo passaggio beneficia anche dei vantaggi che UPLC mostra rispetto all'HPLC: maggiore efficienza e risoluzione, maggiore sensibilità, analisi del tempo più breve e minor consumo disolventi 15. Di conseguenza, la tecnica UPLC-UV è stata utilizzata per quantificare la vitamina C in diverse colture16.
Inoltre, L'AA è una molecola molto labile; pertanto, è importante sviluppare un protocollo che ne prevenga la degradazione durante la conservazione della lattuga e l'analisi della vitamina C9. In questo contesto, il seguente protocollo offre una quantificazione rapida e migliorata del contenuto di vitamina C nella lattuga da parte di UPLC-UV, nonché una procedura di estrazione efficiente. Non solo le cultivar d'élite sono state incluse nel presente studio, ma anche le razze terrestri tradizionali e alcuni parenti selvatici a causa del loro potenziale interesse per l'allevamento delle colture, in particolare nel miglioramento del valore nutrizionale della lattuga.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT) &#8805;98% (Ellman&#8242;s reagent)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm f stainless steel ball</td>
			<td>Euro Aznar Supplies S.L.</td>
			<td>20112100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube for centrifuge</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>429946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL HPLC amber vial</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL syringe with needle</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>JS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Dealtalab</td>
			<td>202840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) &#8805;99.9% (titration)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene tube</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>429951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (CH3COOH) &#8805;99% purity glacial, ReagentPlus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrilo, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 &#181;m filtrated)</td>
			<td>Chem-lab</td>
			<td>CL00.0189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 &#181;m)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 1 L, 200 mL</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>191725, 191722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>766384</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15549004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>5438040100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer VirTis genesis 25EL</td>
			<td>VirTis</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph Multi Reax mixer</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph Reax top mixer</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an e&#955; Detector</td>
			<td>Hewlett Packard</td>
			<td>na</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid &#8805;99%, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol &#8805;99.9% (HPLC supergradient grade)</td>
			<td>ChemLab</td>
			<td>CL00.0189.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 10-1000 &#956;L</td>
			<td>Socorex</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 &#181;m)</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>54919</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE-silicone cap with preaperture</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R</td>
			<td>Gyrozen</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose filters 0.22 &#181;m (13 mm)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1015190-5108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose filters 0.45-&#181;m (13 mm)</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>SFCA-145-100</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer He&#955;ios &#946;</td>
			<td>Thermo Scientific Corporation</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4) 95.0-98.0% purity, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>WasserLab</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasons H-D</td>
			<td>Selecta</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks 1 L, 100 mL</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>191489, 191486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA e&#955; Detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved uplc-uv method for the quantification of vitamin c in lettuce varieties (lactuca sativa l.) and crop wild relatives (lactuca spp.)

Le vitamine, in particolare la vitamina C, sono importanti micronutrienti presenti in frutta e verdura. La vitamina C è anche uno dei principali contributori alla loro capacità antiossidante. La lattuga è una delle verdure più popolari tra i consumatori di tutto il mondo. Un protocollo accurato per misurare il contenuto di vitamina C nella lattuga e in altre specie correlate è fondamentale. Descriviamo qui un metodo utilizzando la tecnica uplc-UV (liquid chromatography-ultravioletto) ad altissime prestazioni, in cui sono state ottimizzate la preparazione del campione, l'estrazione di vitamine e le condizioni cromatografiche.
Sono stati raccolti campioni per rappresentare l'intera pianta, congelati a -80 °C e liofilizzati per prevenire l'ossidazione indesiderabile e facilitarne la manipolazione. L'estrazione della vitamina C è stata effettuata in mezzi acidi, che hanno anche contribuito alla sua stabilità. Poiché la vitamina C può essere presente in due diverse forme interconvertibili, l'acido ascorbico (AA) e l'acido deidroascorbico (DHAA), entrambi i composti devono essere misurati per una quantificazione accurata. Il DHAA è stato quantificato indirettamente dopo la sua riduzione ad AA perché L'AA mostra un'assorbibilità più elevata rispetto al DHAA nell'intervallo UV dello spettro. Dallo stesso estratto sono state effettuate due misurazioni, una prima e una dopo quella reazione di riduzione. Nel primo caso, stavamo quantificando il contenuto di AA, e nel secondo abbiamo quantificato la somma di AA e DHAA (TAA: acido ascorbico totale) sotto forma di AA. Quindi, la quantità di DHAA è stata ottenuta indirettamente sottraendo AA proveniente dalla prima misurazione dal TAA. Sono stati determinati da UPLC-UV, utilizzando uno standard AA commerciale per costruire una curva di calibrazione e ottimizzare la procedura cromatografica, per ottenere picchi AA che sono stati completamente risolti in breve tempo. Questo protocollo potrebbe essere facilmente estrapolato a qualsiasi altro materiale vegetale con lievi o nessuna modifica. La sua accuratezza ha rivelato differenze statisticamente significative altrimenti non percepite. Altri punti di forza e limitazioni sono discussi più approfonditamente nel manoscritto.

La quantificazione della vitamina C nelle matrici di Lactuca richiede lo sviluppo di un approccio cromatografico in grado di garantire risultati affidabili. La figura 1A mostra un cromatogramma risultante da un protocollo non ottimizzato (File supplementare 2), che presenta un picco AA insieme a una "spalla" minore non identificata. Tuttavia, dopo aver migliorato le condizioni di estrazione e cromatografiche, è stato raggiunto un picco AA risolto senza interferenze di composti sconosciuti (Figura 1B). Inoltre, l'utilizzo di apparecchiature UPLC-UV al posto di HPLC-UV ci ha permesso di ridurre il tempo di ritenzione (RT) per AA: 1.874 min nei cromatogrammi ottimizzati rispetto a 2.980 min in quelli non ottimizzati(Figura 1),nonché i tempi di esecuzione, rispettivamente 3 e 7 minuti per i protocolli ottimizzati e non ottimizzati.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig01.jpg"> Figura 1: Cromatogrammi di AA nello stesso campione di lattuga (cultivar commerciale «Begoña»). (A) Cromatogramma HPLC-UV risultante da un protocollo non ottimizzato (condizioni descritte nel file supplementare 2). (B) Cromatogramma UPLC-UV ottenuto con il protocollo ottimizzato (condizioni descritte nella tabella 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Le interferenze nei picchi AA, come quelle osservate nella figura 1A, hanno costantemente portato a una sottovalutazione del contenuto di vitamina C (AA, DHAA e TAA)(figura 2)a causa di una separazione insufficiente durante il processo cromatografico in quanto le aree di picco sovrapposte sono state integrate da una caduta verticale nel punto più profondo tra di esse. Questa distorsione è particolarmente evidente nel caso dei parenti selvatici delle colture, in particolare nel contenuto di DHAA e TAA(figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig2v2.jpg"> Figura 2: Distribuzione del contenuto di vitamina C. Trame per violino diviso di contenuto di DHAA, AA e TAA (mg g-1 di peso secco) in varietà di lattuga commerciali e tradizionali e alcuni parenti selvatici utilizzando protocolli non ottimizzati e ottimizzati. Le linee nere mostrano i valori medi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Inoltre, l'uso di un protocollo non ottimizzato ci ha impedito di estrarre qualsiasi conclusione utile dai risultati in quanto mostravano tutti i campioni, sia tipi di lattughe che parenti selvatici, con un contenuto di vitamina C simile. Al contrario, il protocollo ottimizzato ci ha permesso di rilevare differenze statisticamente significative tra loro per il contenuto di DHAA e TAA(tabella 4),le più ricche sono le specie selvatiche (Figura 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Non ottimizzato</td>
			<td colspan="2">Ottimizzato</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Rapporto F</td>
			<td>
p-valore</td>
			<td>Rapporto F</td>
			<td>
p-valore</td>
		</tr>
<tr>
<td>DHAA</td>
			<td>0.460</td>
			<td>0,637ns
</td>
			<td>5.613</td>
			<td>0.009**</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aa</td>
			<td>0.070</td>
			<td>0,932ns
</td>
			<td>1.020</td>
			<td>0,374ns
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taa</td>
			<td>0.015</td>
			<td>0,985ns
</td>
			<td>4.438</td>
			<td>0.022*</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
ns, * e ** indicano non significativi e significativi rispettivamente a p<0,05 e 0,01.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 4: Variazione del contenuto di vitamina C. Rapporti F (quozienti di due varianze, la varianza tra gruppi e la varianza all'interno del gruppo) e valori significativi dall'ANOVA unidirezionali considerando il tipo di Lactuca (varietà di lattuga commerciale, varietà di lattuga tradizionali e parenti selvatici delle colture) per il contenuto di DHAA, AA e TAA in protocolli non ottimizzati e ottimizzati.
File supplementare 1: stabilità AA e TAA a 5 °C su 24 h. (A) Zone di picco AA e TAA in 24 h. (B) Contenuto di AA e TAA (mg g-1 di peso secco) in 24 ore. Le barre rappresentano le deviazioni standard di due repliche tecniche (n=2) conservate nell'autocampionatore a 5 °C e protette dall'esposizione alla luce. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61440/Supplemental_File_1_.pptx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: Principali differenze tra il protocollo ottimizzato e il protocollo non ottimizzato per l'estrazione e la quantificazione TAA, AA e DHAA. I campioni utilizzati erano gli stessi in entrambi i casi. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61440/Supplemental__File_2_.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp. at JoVE.com

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp.

Presentiamo un metodo rapido e affidabile per quantificare la vitamina C in Lactuca spp. I passaggi chiave sono la preparazione del campione e l'estrazione della vitamina C in condizioni stabili, la riduzione dell'acido deidroascorbico in acido ascorbico e l'ottimizzazione della procedura cromatografica.

Metodo UPLC-UV migliorato per la quantificazione della vitamina C nelle varietà di lattuga(Lactuca sativa L.) e nei parenti selvatici delle colture(Lactuca spp.)

Vitamins, especially vitamin C, are important micronutrients found in fruits and vegetables. Vitamin C is also a major contributor to their antioxidant ...

La vitamina C è un indicatore del valore nutrizionale di frutta e verdura. Abbiamo bisogno di un metodo semplice e affidabile per quantificarlo, specialmente nella lattuga, la verdura a foglia più consumata al mondo. Questo metodo previene la degradazione della vitamina C e fornisce un'estrazione migliorata e una quantificazione rapida e affidabile degli acidi ascorbico e deidroascorbico, grazie alla sua accuratezza e sensibilità.Questo metodo può essere utilizzato nella tecnologia alimentare per creare etichette di fatti nutrizionali, in medicina per studiare gli effetti alimentari sulla salute e nell'allevamento delle piante, per aumentare il contenuto di vitamina C in diverse specie. A dimostrare la procedura con Ines Medina Lozano, ci saranno Jose Angel Aranjuelo e Arantzazu Castellanos, due analisti del mio laboratorio. Per preparare i campioni vegetali, raccogliere almeno una foglia esterna e una interna per pianta e congelare immediatamente le foglie in azoto liquido, prima di metterle in meno 80 gradi Celsius.Per liofilizzare i campioni vegetali congelati, posizionare i tubi campione non conciati sui vassoi all'interno della camera di liofilizzazione del liofilizzatore e programmare il liofilizzatore come indicato. Mantenere la temperatura del condensatore a meno 80,2 gradi Celsius e la costante di vuoto a 112 Quando il materiale è completamente asciutto, aggiungere sfere di acciaio inossidabile di 10 millimetri di diametro ai campioni lyophilizzati, in tubi in polipropilene da 20 millilitri. E utilizzare un vortice multitubo, al momento e nell'intensità appropriati, per macinare i campioni in polvere fine.Per preparare soluzioni standard di stock di acido ascorbico e diluizione, pesare esattamente 10 milligrammi di standard di acido ascorbico su un bilancino di precisione. E a 90 millilitri di fase mobile al campione. Utilizzare un agitatore magnetico per sciogliere il campione e utilizzare un pallone volumetrico per misurare con precisione 100 millilitri della soluzione risultante.Aggiunta di acqua ultrapura aggiuntiva, acidificata a pH due con acido formico, se necessario. Quindi preparare cinque diluizioni dal materiale, per ottenere una curva di calibrazione. Lavorando a bassa intensità luminosa, aggiungere un campione macinato lyophilizzato da 50 milligrammi e cinque millilitri di solvente da estrazione, a un tubo di centrifuga in polipropilene da 15 millilitri e vortice la soluzione per cinque secondi.Dopo aver agitato il campione per 10 minuti su uno shaker orbitale a 2000 giri al minuto, trasferire il tubo in un bagno ad ultrasuoni per 10 minuti, a temperatura ambiente e raccogliere il campione per centrifugazione. Quindi filtrare il supernatante attraverso un filtro di cellulosa rigenerata da 0,22 micron, in una fiala ambrata da cinque millilitri, per estrarre sia gli acidi ascorbico che deidroascorbico nell'estratto uno. Per preparare la diluizione per determinare la concentrazione di acido ascorbico nei campioni fogliari, aggiungere 200 microlitri di estratto uno e 800 microlitri di acqua ultrapura in una fiala liquido liquido a due millilitri e chiudere il flaconcino con un tappo PTFE/silicone.Per l'estrazione totale dell'acido ascorbico, trasferire 200 microlitri dell'estratto uno, in una fiala cromatografica liquida ambrata a due millilitri e aggiungere 200 microlitri di soluzione riducente al flaconcino. Chiudere il flaconcino con una spina e vortice la soluzione per cinque secondi. Dopo un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente, protetta dalla luce, utilizzare 200 microlitri di acido solforico molare 0,4, per fermare la reazione e stabilizzare l'acido ascorbico, in un pH acido.Per preparare la diluizione per determinare la concentrazione totale di acido ascorbico nei campioni, aggiungere 400 microlitri di acqua ultrapura, all'estratto totale di acido ascorbico due. Chiudere il flaconcino con una spina. Almeno un'ora prima di iniziare l'esperimento, confermare che tutte le soluzioni di lavoro sono state caricate nel sistema UPLC e accendere i tre moduli UPLC.Al termine del processo di calibrazione interno, aprire il software e caricare il programma strumentale. Una volta caricato il software, fare clic su Quaternary Solvent Manager e fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare Avvia console, per accedere alla console di gestione UPLC. Fare clic su Sistema, Controllo e Avvio, per procedere alla preparazione e stabilizzazione dello strumento UPLC, e fare clic su Prime Solvents, QSM, controllare A, B, C, D, Seal Wash e Duration of Prime, maggiore di cinque minuti, per eliminare tutte le linee UPLC, per almeno cinque minuti.Fare clic su SM, controllare Lavare solvente superiore a 45 secondi. Controllare il solvente di spurgo e 35 cicli per eliminare e pulire l'iniettore. Per equilibrare l'UPLC in base alle condizioni del metodo, controllare Equilibrate su Method e QSM e impostare il flusso su 0,3 millilitri al minuto.Solvente da A al 2%solvente B a 0%solvente C 98% e solvente D a 0%Ancora in equilibrato su Metodo e SM e impostare il campione a 5 gradi Celsius, e la colonna a 30 gradi Celsius. Sempre in Equilibrare su Metodo e altro, selezionare Luce su e fare clic su Avvia. Lasciare stabilizzare l'apparecchiatura per almeno un'ora.Per verificare la stabilità, fate clic su Avvia sistema console (Launch Console System) e QSM e selezionate Pressione sistema QSM (QSM System Pressure), solo per controllare la pressione nella colonna. Se non ci sono tendenze identificabili nelle variazioni di pressione e il valore delta è inferiore a 10 libbre per pollice quadrato di pressione, nella schermata di avvio rapido, riempire la matrice con i nomi degli standard e dei campioni da analizzare. Per determinare la concentrazione di acido ascorbico negli standard, iniettare cinque microlitri di ciascuna diluizione nello strumento UPLC ed effettuare la cromatografia, a partire dalla più diluita, alla soluzione più concentrata come indicato nella tabella.Per determinare l'acido ascorbico e la concentrazione totale di acido ascorbico nei campioni fogliari, iniettare cinque microlitri dell'estratto diluito uno ed estrarne due rispettivamente nello strumento UPLC per l'analisi cromatografica. Per calcolare le concentrazioni di acido ascorbico e acido ascorbico totale, nel software fare clic su Quickstart, Sfoglia progetto, Canali, il nome dello standard o del campione e del canale PDA uno, 245 nanometri a 1,2 nanometri. Per aprire i cromatogrammi standard e campione, fare clic sul punto iniziale del cromatogramma e trascinarlo nel punto finale, per integrare il picco corrispondente negli standard e nei campioni.Utilizzare quindi i dati delle diluizioni standard dell'acido ascorbico, per costruire una curva di calibrazione, per rappresentare i valori di assorbanza determinati cromatograficamente e interpolare i valori di assorbanza del campione, per ottenere l'acido ascorbico e la concentrazione totale di acido ascorbico, secondo la formula. La quantificazione della vitamina C nelle matrici di Lactuca, richiede lo sviluppo di un approccio cromatografico in grado di garantire risultati affidabili. Qui, si può osservare un cromatogramma risultante da un protocollo non ottimizzato che presenta e un picco di acido ascorbico, insieme a un non identificato alla spalla del minatore.Tuttavia, dopo aver migliorato le condizioni di estrazione e cromatografiche, è possibile ottenere un picco di acido ascorbico risolto senza interferenze di composti sconosciuti. Inoltre, l'uso di apparecchiature ultraviolette UPLC, invece dell'ultravioletto HPLC, riduce i tempi di ritenzione e di corsa. Le interferenze nei picchi di acido ascorbico, si traducono costantemente in una sottovalutazione del contenuto di vitamina C, a causa di una separazione insufficiente durante il processo cromatografico.Poiché le aree di picco sovrapposte sono integrate da una caduta verticale nel punto più profondo tra di esse. Inoltre, l'utilizzo di un protocollo non ottimizzato impedisce l'estrazione di qualsiasi conclusione utile, dai risultati. Poiché tutti i campioni sembrano avere un contenuto simile di vitamina C, in una qualsiasi delle sue forme.Al contrario, l'utilizzo del protocollo ottimizzato consente il rilevamento di differenze statisticamente significative tra i diversi tipi di campioni. Assicurarsi di raccogliere più campioni, di conservare correttamente i campioni, di ridurre al minimo l'esposizione del campione ad agenti ossidanti e di quantificare entrambe le forme di vitamina C.Il contenuto totale di vitamina C può essere quantificato non solo in qualsiasi specie vegetale ma anche, in qualsiasi frutto in qualsiasi frutta e verdura, o anche negli alimenti trasformati con poche modifiche tecniche.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.)

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Isolamento di lipoproteine ​​ad alta densità per non codificante Piccolo RNA Quantificazione

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Ricerca

Biochimica

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

Un metodo efficiente per la sintesi di peptoids con monomeri misto Lisina-tipo / Arginina-tipo e valutazione della loro attività anti-Leishmania

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

Un metodo di cultura alternativa per mantenere l'ipometilazione genomica delle cellule staminali embrionali del Mouse utilizzando PD0325901 inibitore MEK e vitamina C

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Un metodo colorimetrico per la misurazione del ferro contenuto nelle piante

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polisoma Profiling nel testicolo di topo, cellule umane e di Leishmania

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Rilevamento di attività della fosfolipasi C in omogeneato del cervello dall'ape

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Quantificazione di tutto il proteoma di etichettatura omogeneità a livello di singola molecola

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Quantificazione delle dinamiche della rete di interazione proteica mediante co-immunoprecipitazioni multiplexate

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Ottenere dati trascrittomi di alta qualità dai semi di cereali con un metodo modificato per la profilazione dell'espressione genica

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

RNA Blot Analisi per il rilevamento e la quantificazione dei microRNA vegetali

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...