Name: improved uplc-uv method for the quantification of vitamin c in lettuce varieties (lactuca sativa l.) and crop wild relatives (lactuca spp.)
Uploaded: 2020-06-30T13:00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp. at JoVE.com

Agradecemos o Banco de Germoplasma Vegetal de Zaragoza (BGHZ-CITA, Espanha) e o Centro de Recursos Genéticos (GNV, Wageningen, Holanda) por fornecer as sementes necessárias para este trabalho. Agradecemos a J. A. Aranjuelo, A. Castellanos e "laboratorio de valoración nutritiva" da CITA pelo suporte técnico e D. L. Goodchild por revisar a língua inglesa. Este trabalho foi financiado pelos projetos RTA2017-00093-00-00-00 do Instituto Nacional de Pesquisa e Tecnologia Agropecuária e Alimentícia (INIA) e LMP164_18 do Governo de Aragão; e pelo Programa Operacional FEDER Aragón 2014-2020 e pelo Fundo Social Europeu da União Europeia [Grupos Consolidados A12-17R: "Grupo de investigação en fruticultura: caracterización, adaptación y mejora genéica" e A14-17R: "Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles" (SAGAS)]. I.M.L. foi apoiado por um contrato pré-doutorado para formação de médicos do Ministério da Ciência, Inovação e Universidades da Espanha (MCIU) e da Agência estatal espanhola de Pesquisa (AEI).

1. Preparação do material vegetal
<ol><li>Prove pelo menos duas folhas por planta em tubos de polipropileno de 50 mL, um externo (mais antigo) e um interno (mais jovem) a fim de representar com mais precisão toda a planta. Colete pelo menos três réplicas biológicas para cada amostra.</li>
	<li>Congele-os imediatamente usando nitrogênio líquido e armazene-os a -80 °C até usar. Certifique-se de que o nitrogênio líquido não entre nos tubos; caso contrário, eles poderiam explodir quando removidos devido à expansão do gás durante a vaporização. ATENÇÃO: Luvas e um escudo facial são necessários devido aos perigos potenciais associados ao uso de nitrogênio líquido.</li>
	<li>Retire as tampas dos tubos e coloque-as nas bandejas dentro da câmara de secador congelante do liofilizador(Tabela de Materiais)programada da seguinte forma: -25 °C para 72 h, -10 °C para 10h, 0 °C por 10 h e 20 °C por pelo menos 4h. Mantenha a temperatura do condensador e a constante de vácuo durante o processo de secagem congelante a -80,2 °C e 112 mTorr, respectivamente.</li>
	<li>Quando o material estiver completamente seco (entre 4 e 7 dias, dependendo da planta e do grau de compactação no tubo), preserve a 4 °C, -20 °C ou -80 °C para armazenamento curto (dias a semanas), médio (meses) ou longo (anos), respectivamente. Recomenda-se a inclusão de sacos contendo contas de gel de sílica nos tubos contendo amostras.</li>
	<li>Coloque as amostras liofilizadas em tubos de polipropileno de 20 mL juntamente com bolas de aço inoxidável de 10 mm de diâmetro e triture-as com um vórtice multitube usando a intensidade e o tempo necessários para obter uma poeira fina. NOTA: Durante todo o processo, proteja as amostras da exposição à luz direta.</li>
</ol>2. Reagente e preparação de soluções
<ol><li>Preparar a solução de extração de solventes: 8% ácido acético (v/v), 1% MPA (ácido metafosfórico) (w/v), 1 mM EDTA (ácido etilenodiaminetetraacético).<ol>
<li>Calcule o volume total de solvente necessário para processar todo o conjunto de amostras levando em conta que 5 mL serão adicionados a cada um. Para preparar 1 L da solução, adicione a um frasco: 30 g de MPA, 0,372 g de desidratação EDTA, 80 mL de ácido acético e 500 mL de água ultrauso (volumes de escala e quantidades em conformidade). Sele a boca de frasco com filme plástico.</li>
		<li>Uma vez dissolvido com a ajuda de um agitador magnético, use um frasco volumoso para medir com precisão 1 L, adicionando a água ultrapura necessária.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o tampão de reação de redução (0,5 M Tris (2-amino-2-(hidroximetol)-1,3-propanediol) pH 9.0) e solução redutora (40 mM DTT (1,4-Dithiothreitol) com 0,5 M Tris pH 9.0).<ol>
<li>Calcule o volume total de solução redutor necessária para processar todo o conjunto de amostras levando em conta que 200 μL serão adicionados a cada uma delas. Para preparar 100 mL do tampão, adicione a um béquer: 6,055 g de Tris e 90 mL de água ultrauso (volumes de escala e quantidades em conformidade). Sele a boca de béquer com filme de plástico.</li>
		<li>Uma vez dissolvido com a ajuda de um agitador magnético, ajuste a solução para pH 9.0 adicionando 2 M HCl e use um frasco volumoso para medir com precisão 100 mL, adicionando a água ultrapura necessária.</li>
		<li>Para preparar 100 mL da solução redutor, adicione a um béquer: 0,629 g de DTT (pureza: 98%) e 90 mL do buffer (0,5 M Tris pH 9.0) previamente preparado (2.2.1 a 2.2.2). Dimensione volumes e quantidades em conformidade. Sele a boca de béquer com filme de plástico.</li>
		<li>Uma vez dissolvido com a ajuda de um agitador magnético, use um frasco volumoso para medir com precisão 100 mL, adicionando o volume necessário de tampão 0,5 M Tris pH 9.0. NOTA: A solução redutor é muito instável. É por isso que uma solução recém-feita é fortemente recomendada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ácido sulfúrico (0,4 M H2SO4)<ol>
<li>Calcule o volume total de ácido sulfúrico de 0,4 M necessário para processar todo o conjunto de amostras levando em conta que 200 μL serão adicionados a cada um. Para preparar 100 mL da solução, adicione a um béquer: 80 mL de água ultrauso e depois 2,22 mL de H2SO4 (pureza: 96%, densidade: 1,84 g mL-1). Use um frasco volumoso para medir com precisão 100 mL, adicionando a água ultrapura necessária. ATENÇÃO: O ácido sulfúrico é muito corrosivo, por isso deve ser manuseado usando equipamento de proteção e sob capô. Além disso, o ácido deve ser adicionado à água ultrauso, e não à água para o ácido, para reduzir a fumaça e evitar acidentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ácido clorídrico (2 M HCl).<ol>
<li>Para preparar 100 mL de ácido clorídrico de 2 M, adicione a um béquer: 80 mL de água ultrauso e depois 6,13 mL de HCl (pureza: 37%, densidade: 1,19 g mL-1). Sele a boca de béquer com filme de plástico. Use um frasco volumoso para medir com precisão 100 mL, adicionando a água ultrapura necessária. Dimensione os volumes de acordo. ATENÇÃO: O ácido clorídrico é muito corrosivo, por isso tem que ser manuseado usando equipamentos de proteção e sob a capa. Além disso, o ácido deve ser adicionado à água ultrauso, e não à água para o ácido, para reduzir a fumaça e evitar acidentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Padrão AA (estoque e diluições)<ol>
<li>Pesar exatamente 10 mg de padrão AA (pureza: 99%) utilizando uma balança de precisão e adicionar 90 mL de fase móvel (pH de água ultrauso 2.0 com ácido fórmico).</li>
		<li>Uma vez dissolvido com a ajuda de um agitador magnético, use um frasco volumoso para medir com precisão 100 mL, adicionando o volume necessário de água ultrauso pH 2.0 com ácido fórmico. NOTA: Proteja esta solução de estoque da exposição à luz.</li>
		<li>Prepare cinco diluições do estoque do padrão AA para obter uma curva de calibração seguindo as instruções na Tabela 1 e proceda com a etapa 5.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Padrão</td>
			<td>[AA] (μg mL-1)</td>
			<td>Solução AA (100 μg mL-1) (μL)</td>
			<td>Fase móvel (μL)a</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>5</td>
			<td>995</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>2.5</td>
			<td>25</td>
			<td>975</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>50</td>
			<td>950</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>900</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>250</td>
			<td>750</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">
um PH de água ultrauso 2.0 acidificado por ácido fórmico.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Protocolo para preparar cinco padrões de AA (ácido ascórbico). São indicados volumes de soluto e solvente para preparar cada uma das diferentes concentrações das normas.
3. Extração de AA e DHAA
NOTA: Recomenda-se trabalhar em condições de baixa intensidade de luz durante as etapas de extração.
<ol><li>Para um tubo de centrífugo de polipropileno de 15 mL, adicione 50 mg de amostra moída liofilizada e 5 mL do solvente de extração (etapa 2.1).</li>
	<li>Agite a mistura usando um vórtice para 5 s e, em seguida, um agitador orbital por 10 min a 2000 rpm.</li>
	<li>Introduza o tubo em um banho ultrassônico por 10 minutos à temperatura ambiente com ultrassom ativado.</li>
	<li>Centrifugar a 4.000 x g por 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Pegue o supernasce, passe por um filtro de celulose regenerado de 0,22 μm e armazene-o em um frasco âmbar de 5 mL. Este é o Extrato 1, que contém AA e DHAA. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui congelando os extratos a -80 °C e protegendo-os da exposição à luz como AA e DHAA são muito instáveis e degradam-se facilmente na presença de luz, em altas temperaturas ou em atmosferas oxidantes(Arquivo Suplementar 1).</li>
</ol>4. Redução de DHAA para AA para extrair TAA
<ol><li>Transfira 200 μL do Extrato 1 para um frasco âmbar de 2 mL para cromatografia líquida e adicione 200 μL da solução redutora (etapa 2.2). Feche o frasco com um plugue PTFE-silicone com pré-abertura e agite-o com um vórtice para 5 s.</li>
	<li>Deixe a solução ficar por 30 minutos à temperatura ambiente e proteger da luz.</li>
	<li>Adicione 200 μL de 0,4 M H2SO4 para parar a reação e estabilizar a AA em pH ácido. A solução resultante é o Extrato 2, que contém apenas AA e é na verdade TAA.</li>
</ol>5. Determinação
<ol><li>Preparação UPLC-UV<ol>
<li>Prepare as soluções de trabalho descritas na Tabela 2, devidamente filtradas através de filtros de 0,22 μm, sonicadas por pelo menos 10 minutos e coloque-as no sistema UPLC.</li>
		<li>Ligue os três módulos UPLC e aguarde o término do processo de calibração interna.</li>
		<li>Abra o software (por exemplo, Empower 3) e carregue o programa instrumental descrito na Tabela 2: Empower 3 | Executar amostras | Método de vitamina C | UPLC_PDA | Use QuickStart.</li>
		<li>Uma vez que o software esteja carregado com o programa correto, acesse o console de gerenciamento UPLC: Quaternary Solvent Manager | Clique no botão direito do mouse | Console de lançamento.</li>
		<li>Proceda à preparação e estabilização do instrumento UPLC: Sistema | Controle | Startup.<ol>
<li>Purgue todas as linhas UPLC por pelo menos 5 min: Prime Solventes | QSM | Verificar A, B, C, D e Lacre | Duração do prime > 5 min.</li>
			<li>Purgue e limpe o injetor: Prime Solventes | SM | Verifique o solvente Wash (> 45 s) e verifique o solvente do Purpuro (> 35 ciclos).</li>
			<li>Equilibre UPLC às condições do método: Equilibre-se ao Método | QSM | Fluxo (0,3 mL min-1) | Solvente A (2%) | Solvente B (0%) | Solvente C (98%) | Solvente D (0%); Equilíbrio ao Método | SM | Amostra (5 °C) | Coluna (30 °C) e Equilibre ao Método | Outros | Verifique a lâmpada acesa | Pressione Start.</li>
			<li>Aguarde pelo menos 1h (ainda mais tempo é recomendado) para que o equipamento se estabilize. Estabilidade pode ser verificada verificando a pressão na coluna no Console de Lançamento: Sistema | Gerente de Solventes Quaternário | Pressão do sistema QSM. Certifique-se de que não há tendências identificáveis em mudanças de pressão (ou aumenta ou diminui) e o valor delta é inferior a 10 psi.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Na tela QuickStart, preencha a matriz com os nomes dos padrões e amostras a serem analisados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinação AA nas normas<ol>
<li>Transfira 1 mL de cada uma das cinco normas AA previamente preparadas (etapa 2.5.3) para frascos âmbar de 2 mL para cromatografia líquida. Feche o frasco com um plugue PTFE-silicone com pré-abertura e injete 5 μL no instrumento UPLC.</li>
		<li>Realize a cromatografia seguindo o procedimento descrito na Tabela 2, começando da maioria diluída para a mais concentrada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinação AA nas amostras<ol>
<li>Pipeta 200 μL de Extrato 1 em um frasco âmbar de 2 mL para cromatografia líquida e adicionar 800 μL de água ultrauso. Feche o frasco com um plugue PTFE-silicone com pré-abertura e injete 5 μL no instrumento UPLC.</li>
		<li>Realizar a cromatografia seguindo o procedimento descrito na Tabela 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinação do TAA nas amostras<ol>
<li>Adicione 400 μL de água ultrauso ao Extrato 2. Feche o frasco com um plugue PTFE-silicone com pré-abertura e injete 5 μL no instrumento UPLC.</li>
		<li>Realizar a cromatografia seguindo o procedimento descrito na Tabela 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componentes e parâmetros</td>
			<td>Descrição</td>
		</tr>
<tr>
<td>Instrumento</td>
			<td>Absolvição UPLC Classe H</td>
		</tr>
<tr>
<td>Detector</td>
			<td>PDA eλλ Detector λabs para AA=245 nm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Software</td>
			<td>Empoderamento 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Coluna</td>
			<td>Absolvição UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 μm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Canal A</td>
			<td>CH3OH</td>
		</tr>
<tr>
<td>Canal B/Lavagem</td>
			<td>H2O:CH3OH (50:50 v:v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Canal C</td>
			<td>PH de água ultrauso 2.0 acidificado por ácido fórmicoa
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lavagem do Canal D/Seal</td>
			<td>Água ultrauso:acetonitrilo (90:10 v:v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fase móvel</td>
			<td>0,3 mL min-1 de 2%A + 98%C (modo isocrático)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatura da coluna</td>
			<td>30 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatura do autosampler</td>
			<td>5 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume de injeção</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo de retenção de AA</td>
			<td>1.874 min.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo de execução</td>
			<td>3 min.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
um Volume indeterminado de ácido fórmico usado até ajuste de pH</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Procedimento cromatográfico otimizado para determinar AA (ácido ascórbico) em extratos de alface e parentes selvagens. Descrição dos componentes, condições e soluções empregadas.
6. Quantificação de AA e DHAA
<ol><li>Análise estatística<ol>
<li>Determinar os parâmetros analíticos do método cromatográfico descrito por Bertolín et al.18 (Tabela 3). NOTA: Os valores dos parâmetros apresentados na Tabela 3 deverão ser definidos em condições experimentais específicas.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parâmetros analíticos do método</td>
			<td>Valores</td>
		</tr>
<tr>
<td>Faixa linear (μg mL-1)</td>
			<td>0.5-25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Equação linear</td>
			<td>y=53.143,03x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R2
</td>
			<td>0.99998</td>
		</tr>
<tr>
<td>Limite de detecção (mg AA g-1 de matéria seca)</td>
			<td>0.013</td>
		</tr>
<tr>
<td>Limite de quantificação (mg AA g-1 de matéria seca)</td>
			<td>0.045</td>
		</tr>
<tr>
<td>Repetibilidade (CV, %)a
</td>
			<td>1.75</td>
		</tr>
<tr>
<td>Precisão intermediária (CV, %)a
</td>
			<td>4.22</td>
		</tr>
<tr>
<td>Recuperação (Rec, %)b
</td>
			<td>95,6±2,4</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
um CV: coeficiente de variação</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
b O ensaio de recuperação foi realizado com 10 alíquotas contendo 50 mg da mesma amostra, 5 cravadas com 2 mg de AA g-1 de matéria seca e 5 não-cravadas. %Rec=([AA]amostra-[AA])/([AA]spiked)x100.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: Parâmetros analíticos otimizados para detecção e quantificação de AA (ácido ascórbico) e TAA (ácido ascórbico total). A faixa linear, a equação e o coeficiente de determinação da curva de calibração (R2),bem como os limites de detecção e quantificação de AA (o mesmo para TAA), e a repetibilidade, precisão intermediária e recuperação foram obtidos com um volume de injeção amostral de 5 μL.
<ol start="2"><li>Calcule a concentração de AA e TAA.<ol>
<li>Abra o padrão e prove cromatgramas: QuickStart | Projeto Browse | Canais | "nome do padrão ou amostra" | PDA Ch1 245 nm@1,2 nm.</li>
		<li>Integre o pico correspondente (AA ou TAA) nos padrões e amostras clicando em seu ponto de partida (aproximadamente 1.790 min) e arrastando-o com o mouse até seu ponto final (aproximadamente 1.910 min).</li>
		<li>Construa uma curva de calibração representando os valores de absorção determinados cromatograficamente (etapa 5.2.) contra a concentração das cinco normas AA elaboradas acima(Tabela 1).</li>
		<li>Interpolar os valores de absorção das amostras determinados nas etapas 5.3 e 5.4 e obter a concentração de AA e TAA, respectivamente, com a seguinte fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61440/61440equ01.jpg"> onde y é a área de pico integrada, x é a concentração de AA ou TAA em ppm e m e n são a inclinação e a y-interceptaçãoda linha de regressão obtida, respectivamente.</li>
		<li>Para calcular a concentração de DHAA, aplique a seguinte fórmula: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61440/61440equ02.jpg"> NOTA: Para obter as concentrações totais do DHAA, AA e TAA em mg g-1 de peso seco, os valores obtidos diretamente interpolados na curva de calibração terão de ser multiplicados pelo volume total do extrato e pelo fator de diluição aplicado, e depois divididos pelo peso da amostra utilizada para a realização da extração.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Llorach, R., Mart&#237;nez-S&#225;nchez, A., Tom&#225;s-Barber&#225;n, F. A., Gil, M. I., Ferreres, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+polyphenols+and+antioxidant+properties+of+five+lettuce+varieties+and+escarole.">Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole.</a> Food Chemistry. 108 (3), 1028-1038 (2008).</li><li>Carr, A. C., Frei, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+new+recommended+dietary+allowance+for+vitamin+C+based+on+antioxidant+and+health+effects+in+humans.">Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 69 (6), 1086-1107 (1999).</li><li>Carr, A. C., Vissers, M. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+or+food-derived+vitamin+C-Are+they+equally+bioavailable.">Synthetic or food-derived vitamin C-Are they equally bioavailable.</a> Nutrients. 5 (11), 4284-4304 (2013).</li><li>Lee, S. K., Kader, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preharvest+and+postharvest+factors+influencing+vitamin+C+content+of+horticultural+crops.">Preharvest and postharvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops.</a> Postharvest Biology and Technology. 20 (3), 207-220 (2000).</li><li>Shekhovtsova, T. N., Muginova, S. V., Luchinina, J. A., Galimova, A. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+carotenoids,+tocopherols,+retinol+and+cholesterol+in+ovine+lyophilised+samples+of+milk,+meat,+and+liver+and+in+unprocessed/raw+samples+of+fat.">Simultaneous determination of carotenoids, tocopherols, retinol and cholesterol in ovine lyophilised samples of milk, meat, and liver and in unprocessed/raw samples of fat.</a> Food Chemistry. 257, 182-188 (2018).</li><li>Sp&#237;nola, V., Llorent-Mart&#237;nez, E. J., Castilho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+vitamin+C+in+foods:+Current+state+of+method+validation.">Determination of vitamin C in foods: Current state of method validation.</a> Journal of Chromatography A. 1369, 2-17 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=radiation+is+beneficial+for+yield+and+quality+of+indoor+cultivated+lettuce.">radiation is beneficial for yield and quality of indoor cultivated lettuce.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1-10 (2019).</li><li>Damerum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+genetic+basis+of+antioxidant+status+in+lettuce+(Lactuca+sativa).">Elucidating the genetic basis of antioxidant status in lettuce (Lactuca sativa).</a> Horticulture Research. 2 (15055), 1-13 (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A vitamina C é um nutriente muito importante, mas é um composto muito labile também, por isso sua quantificação UPLC-UV depende de múltiplos fatores, como armazenamento e preparação de amostras, método de extração e condições cromatográficas. Por isso, foi necessário um procedimento rápido e simples para evitar a oxidação de AA (com poder antioxidante) para DHAA (sem propriedades antioxidantes). Também foi crucial evitar altas condições de pH e temperatura, bem como luz intensa e atmosfera oxidante durante o tratamento amostral para promover a estabilidade do composto.
Para minimizar a oxidação de AA, foram tomadas as seguintes medidas. Em primeiro lugar, as amostras foram liofilizadas como material inicial para ambos os protocolos para garantir a quantificação precisa do conteúdo de vitamina C e manipular facilmente amostras. Essa opção foi preferida em vez de moagem fina, comumente encontrada ao longo da literatura19,à medida que a poeira descongela muito rapidamente para que a água volte a ficar disponível. Durante o procedimento de extração, foi utilizado um maior volume de uma solução mais ácida (8% de ácido acético e 1% mpa) como extrator no protocolo otimizado(Arquivo Suplementar 2),que também atuou como estabilizador, impedindo a degradação da AA. Esta solução também continha o EDTA como um agente quelaante para aumentar a estabilização16, ao contrário do extrator no protocolo não otimizado (Arquivo Suplementar 2). Além disso, testamos se o procedimento de extração poderia ser aprimorado usando duas extrações consecutivas com 2,5 mL de extrator em vez de uma única com 5 mL e sob uma atmosfera N2 em vez das condições atmosféricas padrão. Os melhores resultados foram alcançados utilizando-se apenas uma extração em uma atmosfera não modificada, o que simplificou o protocolo, fazendo etapas adicionais desnecessárias (dados não mostrados). Outras pequenas alterações também foram introduzidas no protocolo, a fim de melhorar a extração (ou seja, sônica), obter um extrato mais claro (filtração mais fina) e reduzir a duração do protocolo(Arquivo Suplementar 2). Quanto às condições cromatográficas, a validação do método foi realizada conforme relatado antesdo dia 18, garantindo bons parâmetros analíticos(Tabela 3). Além disso, o uso de água ultrauso com ácido fórmico (pH 2.0) e metanol (98:2 v:v) com um fluxo de 0,3 mL min-1, em vez de fosfato monopotássio 30 mM (pH 3.0) a 1 mL min-1 como fase móvel(Arquivo Suplementar 2),resultou em um método melhorado. O avanço mais importante foi provavelmente usar um sistema UPLC em vez de um HPLC, o que nos permitiu maior controle das condições de impacto (como a temperatura) e resultando em picos AA resolvidos sem interferências por compostos desconhecidos, em um menor tempo e consumindo menos volume de extrato(Arquivo Suplementar 2).
No entanto, existem duas limitações principais desse método. A primeira é que o DHAA não pode ser medido diretamente usando um detector UV devido à sua baixa absortividade na faixa UV do espectro. É importante quantificar o conteúdo DHAA porque apresenta determinada atividade biológica e é facilmente conversível para AA no corpo humano5. Para isso, é necessária uma reação adicional para reduzir o DHAA para AA, juntamente com uma segunda execução cromatográfica para medir o TAA e, em seguida, determinar indiretamente o DHAA subtraindo o conteúdo AA do TAA(Figura 3). Nesse sentido, a etapa de redução foi otimizada utilizando-se uma maior concentração do agente redutor (DTT), aumentando o tempo de reação de 5 para 30 minutos, e interrompendo a reação com ácido sulfúrico(Arquivo Suplementar 2). A baixa estabilidade do AA constitui a segunda limitação do método. À medida que o AA começa a degradar 4h após a extração(Arquivo Suplementar 1), é necessário quantificá-lo neste intervalo de tempo. Assim, o número de amostras para extrair é condicionado pelo procedimento cromatógrafo. É por isso que propomos congelá-los nessa etapa deste protocolo, embora, nesse caso, nem todos eles possam ser colocados no autosampler uplc a ser medido automaticamente. Felizmente, o RT reduzido para AA nos permitiu obter cromatogramas de 3 min, muito mais curtos do que os cromogramas de 7 min obtidos usando HPLC (Arquivo Suplementar 2). Assim, o teor de vitamina C poderia ser determinado em um alto número de amostras em uma janela de 4h.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig03.jpg"> Figura 3: Fluxo de trabalho da quantificação da vitamina C na alface e alguns parentes selvagens. Diagrama esquemático do protocolo otimizado mostrando dois ramos para a determinação de apenas AA ou AA + DHAA (TAA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Como a vitamina C é um nutriente essencial para os seres humanos e devido aos seus importantes benefícios para a saúde, tornou-se objeto de muitos estudos. Portanto, foi quantificado em uma grande variedade de culturas, incluindo alface, um dos vegetais mais consumidos em todo o mundo. Métodos clássicos simples têm sido gradualmente substituídos por técnicas de cromatografia líquida, pois são mais específicos e precisos10. No entanto, devido à necessidade de uma reação adicional para quantificar ambos, AA e DHAA via HPLC, em alguns estudos sobre alface, apenas AA14 ou apenas TAA11 (sem quantificar AA antes da redução do DHAA para AA) foram medidos. Além disso, apenas alguns autores quantificaram AA e DHAA, apesar da contribuição de ambas as moléculas para a atividade antioxidante de vitamina C2. No entanto, a técnica UPLC tornou-se mais importante nos últimos tempos devido ao seu maior desempenho ao medir a vitamina C em várias culturas16. Comparando os resultados obtidos neste estudo com as duas metodologias, UPLC e HPLC, essas vantagens foram confirmadas: picos de AA bem definidos graças a uma sensibilidade maior, e em tempos muito curtos, foram alcançados, o que também implica menos recursos consumidos. Apesar da eficiência da UPLC, apenas Chen et al.20 aplicaram essa técnica para medir o teor de vitamina C na alface, o que ainda levou a uma subestimação, pois apenas a forma AA foi quantificada.
Em resumo, este trabalho representa a primeira tentativa bem sucedida de determinar o teor total de vitamina C não apenas em diferentes variedades de alface, mas também em alguns de seus parentes selvagens. A quantificação da vitamina C também é essencial para selecionar alface com maior atividade antioxidante dentro de programas de reprodução. Nesse sentido, o aumento do teor total de vitamina C em parentes selvagens de alface encontrado aqui e o aumento do teor de AA relatado em estudos anteriores14, bem como outros compostos antioxidantes21, amplia os candidatos adequados para melhorar o valor nutricional das alface.
Em conclusão, mesmo com algumas limitações inerentes à natureza da vitamina C, como sua degradação gradual poucas horas após ser extraída ou a necessidade de uma reação de redução devido à baixa absortividade dhaa UV, oferece um método menos intenso e menos demorado para medir o conteúdo de vitamina C. Além disso, também é muito robusto e mostra alta sensibilidade e poder de resolução. Além disso, é facilmente transferível não apenas para outros materiais vegetais com pequenas ou nenhuma mudança, mas também para produtos processados que fornecem a ingestão dietética de vitamina C para humanos, o que dá origem a uma ampla gama de aplicações futuras no campo emergente de testes para qualidade alimentar confiável.

Alface cultivada (Lactuca sativa L.) é uma das hortaliças folhosas mais produzidas e consumidas em todo o mundo, com uma produção total de cerca de 27,3 milhões de toneladas em 20181. A alface é percebida como saudável pelos consumidores. As propriedades nutricionais são atribuídas principalmente à fonte de compostos antioxidantes na cultura, como a vitamina C, entre outras como polifenóis e vitamina E2. A vitamina C é um micronutriente essencial para os seres humanos ao contrário de muitos outros vertebrados, pois somos incapazes de produzi-la devido a mutações presentes na codificação genética para a enzima de última etapa na via biossintética3. É necessário para um metabolismo celular normal e também desempenha um papel importante nas respostas imunológicas principalmente devido à sua atividade antioxidante3,4.
A vitamina C total é composta de ácido ascórbico (AA) e ácido dehidroascórbico (DHAA). AA é a forma mais biologicamente ativa da vitamina, mas a DHAA (seu produto de oxidação) também mostra atividade biológica e pode ser facilmente convertida em AA no corpo humano5. Portanto, quantificar ambas as formas é importante para determinar o teor total de vitamina C de qualquer cultura horticultural, incluída na alface.
Uma grande variedade de abordagens baseadas em diferentes técnicas analíticas têm sido utilizadas para medir a vitamina C em vegetais, como métodos enzimáticos, espectrofotométricos e titrimétricos6,7,8. Embora esses métodos sejam simples, eles não são quimicamente específicos para AA9. Consequentemente, os métodos cromatográficos são preferidos, especialmente a técnica de cromatografia líquida-ultravioleta líquida de alto desempenho (HPLC-UV), devido à sua maior precisão10. O HPLC-UV tem sido usado para determinar a vitamina C em uma grande diversidade de culturas, como brócolis, espinafre e alface11,12,13. No entanto, a quantificação simultânea de AA e DHAA é complicada devido à baixa absortividade de DHAA na faixa UV do espectro. Alternativamente, o DHAA pode ser determinado indiretamente usando um agente redutor que converte DHAA em AA, medindo ácido ascórbico total (TAA) e, em seguida, calculando a diferença entre TAA e AA. Devido à necessidade de uma reação de redução, em alguns estudos, apenas a AA foi quantificada14, o que poderia realmente representar uma subestimação da atividade de vitamina C. Essa reação de redução adicional também é necessária para determinar indiretamente o DHAA mesmo quando o último avanço nas técnicas de cromatografia líquida, cromatografia líquida de alto desempenho (UPLC), é usado. Essa etapa também se beneficia das vantagens que a UPLC apresenta quando comparada ao HPLC: maior eficiência e resolução, maior sensibilidade, análise de menor tempo e menor consumo de solventes15. Em consequência, a técnica UPLC-UV tem sido utilizada para quantificar a vitamina C em diferentes culturas16.
Além disso, a AA é uma molécula muito labile; assim, é importante desenvolver um protocolo que previne sua degradação durante o armazenamento de alface e a análise de vitamina C9. Neste contexto, o protocolo a seguir oferece uma quantificação rápida e aprimorada do teor de vitamina C na alface pela UPLC-UV, bem como um procedimento de extração eficiente. Não apenas cultivares de elite foram incluídas no presente estudo, mas também corridas terrestres tradicionais e alguns parentes selvagens devido ao seu potencial interesse na criação de culturas, especificamente na melhoria do valor nutricional da alface.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT) &#8805;98% (Ellman&#8242;s reagent)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm f stainless steel ball</td>
			<td>Euro Aznar Supplies S.L.</td>
			<td>20112100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube for centrifuge</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>429946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL HPLC amber vial</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL syringe with needle</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>JS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Dealtalab</td>
			<td>202840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) &#8805;99.9% (titration)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene tube</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>429951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (CH3COOH) &#8805;99% purity glacial, ReagentPlus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrilo, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 &#181;m filtrated)</td>
			<td>Chem-lab</td>
			<td>CL00.0189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 &#181;m)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 1 L, 200 mL</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>191725, 191722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>766384</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15549004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>5438040100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer VirTis genesis 25EL</td>
			<td>VirTis</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph Multi Reax mixer</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph Reax top mixer</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an e&#955; Detector</td>
			<td>Hewlett Packard</td>
			<td>na</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid &#8805;99%, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol &#8805;99.9% (HPLC supergradient grade)</td>
			<td>ChemLab</td>
			<td>CL00.0189.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 10-1000 &#956;L</td>
			<td>Socorex</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 &#181;m)</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>54919</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE-silicone cap with preaperture</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R</td>
			<td>Gyrozen</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose filters 0.22 &#181;m (13 mm)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1015190-5108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose filters 0.45-&#181;m (13 mm)</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>SFCA-145-100</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer He&#955;ios &#946;</td>
			<td>Thermo Scientific Corporation</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4) 95.0-98.0% purity, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>WasserLab</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasons H-D</td>
			<td>Selecta</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks 1 L, 100 mL</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>191489, 191486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA e&#955; Detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved uplc-uv method for the quantification of vitamin c in lettuce varieties (lactuca sativa l.) and crop wild relatives (lactuca spp.)

Vitaminas, especialmente vitamina C, são micronutrientes importantes encontrados em frutas e vegetais. A vitamina C também é um dos principais contribuintes para sua capacidade antioxidante. A alface é um dos vegetais mais populares entre os consumidores em todo o mundo. Um protocolo preciso para medir o teor de vitamina C na alface e outras espécies relacionadas é crucial. Descrevemos aqui um método utilizando a técnica de cromatografia-ultravioleta líquida de alto desempenho (UPLC-UV), na qual as condições de preparação da amostra, extração de vitaminas e cromatografia foram otimizadas.
Foram coletadas amostras para representar toda a planta, congelada a -80 °C e liofilizada para evitar oxidação indesejável e facilitar sua manipulação. A extração de vitamina C foi realizada em meio ácido, o que também contribuiu para sua estabilidade. Como a vitamina C pode estar presente em duas formas interconversíveis diferentes, ácido ascórbico (AA) e ácido dehidroascórbico (DHAA), ambos os compostos devem ser medidos para quantificação precisa. O DHAA foi quantificado indiretamente após sua redução para AA porque a AA apresenta uma absortividade maior do que a DHAA na faixa UV do espectro. A partir do mesmo extrato, foram realizadas duas medições, uma antes e outra após essa reação de redução. No primeiro caso, estávamos quantificando o conteúdo AA, e no segundo, quantificamos a soma de AA e DHAA (TAA: ácido ascórbico total) na forma de AA. Em seguida, a quantidade DHAA foi obtida indiretamente pela subtração de AA proveniente da primeira medição do TAA. Eles foram determinados pelo UPLC-UV, utilizando um padrão AA comercial para construir uma curva de calibração e otimizando o procedimento cromatográfico, para obter picos AA que foram completamente resolvidos em pouco tempo. Este protocolo pode ser facilmente extrapolado para qualquer outro material vegetal com pequenas ou nenhuma alteração. Sua precisão revelou diferenças estatisticamente significativas de outra forma não concebidas. Outros pontos fortes e limitações são discutidos mais profundamente no manuscrito.

A quantificação de vitamina C nas matrizes de Lactuca requer o desenvolvimento de uma abordagem cromatográfica que possa garantir resultados confiáveis. A Figura 1A mostra um cromatógrafo resultante de um protocolo não otimizado(Arquivo Suplementar 2),que apresenta um pico AA juntamente com um pequeno "ombro" não identificado. No entanto, após a melhoria das condições de extração e cromatográficas, foi alcançado um pico AA resolvido sem interferências de compostos desconhecidos(Figura 1B). Além disso, o uso de equipamentos UPLC-UV em vez de HPLC-UV nos permitiu reduzir o tempo de retenção (RT) para AA: 1.874 min nos cromatgramas otimizados versus 2.980 min nos não otimizados(Figura 1),bem como os tempos de execução, 3 e 7 minutos para os protocolos otimizados e não otimizados, respectivamente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig01.jpg"> Figura 1: Cromogramas de AA na mesma amostra de alface (cultivar comercial 'Begoña'). (A) Cromatografia HPLC-UV resultante de um protocolo não otimizado (condições descritas no Arquivo Suplementar 2). (B) CROmatograma UPLC-UV obtido com o protocolo otimizado (condições descritas na Tabela 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Interferências nos picos de AA, como as observadas na Figura 1A,resultaram consistentemente na subestimação do teor de vitamina C (AA, DHAA e TAA)(Figura 2)devido a uma separação insuficiente durante o processo cromatográfico, pois as áreas de pico sobrepostas foram integradas por uma queda vertical no ponto mais profundo entre eles. Esse viés é especialmente perceptível no caso dos parentes silvestres da cultura, particularmente no teor dhaa e TAA(Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig2v2.jpg"> Figura 2: Distribuição do conteúdo de vitamina C. Parcelas de violino divididas de conteúdo DHAA, AA e TAA (mg g-1 de peso seco) em variedades comerciais e tradicionais de alface e alguns parentes selvagens usando protocolos não otimizados e otimizados. Linhas pretas mostram os valores médios. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Além disso, o uso de um protocolo não otimizado nos impediu de extrair qualquer conclusão útil dos resultados, pois eles mostraram todas as amostras, tanto tipos de alface quanto os parentes selvagens, com conteúdo semelhante de vitamina C. Em contrapartida, o protocolo otimizado permitiu detectar diferenças estatisticamente significativas entre eles para o conteúdo DHAA e TAA(Tabela 4),sendo os mais ricos as espécies silvestres(Figura 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Não otimizado</td>
			<td colspan="2">Otimizado</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>F-ratio</td>
			<td>
p-valor</td>
			<td>F-ratio</td>
			<td>
p-valor</td>
		</tr>
<tr>
<td>DHAA</td>
			<td>0.460</td>
			<td>0,637ns
</td>
			<td>5.613</td>
			<td>0.009**</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aa</td>
			<td>0.070</td>
			<td>0,932ns
</td>
			<td>1.020</td>
			<td>0,374ns
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taa</td>
			<td>0.015</td>
			<td>0,985ns
</td>
			<td>4.438</td>
			<td>0.022*</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
ns, * e ** indicam não significativo e significativo em p<0,05 e 0,01, respectivamente.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 4: Variação no teor de vitamina C. F-ratios (quocientes de duas variâncias, a variância entre grupos e a variância dentro do grupo) e valores de significância da ANOVA unidirecional considerando o tipo de Lactuca (variedades comerciais de alface, variedades tradicionais de alface e parentes selvagens de cultura) para o teor de DHAA, AA e TAA em protocolos não otimizados e otimizados.
Arquivo suplementar 1: Estabilidade AA e TAA a 5 °C acima de 24 h. (A) Áreas de pico AA e TAA ao longo de 24 h. (B) Conteúdo AA e TAA (mg g-1 de peso seco) ao longo de 24 horas. As barras representam os desvios padrão de duas réplicas técnicas (n=2) mantidas no autosampler a 5 °C e protegidas da exposição à luz. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61440/Supplemental_File_1_.pptx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 2: Principais diferenças entre o protocolo otimizado e o não otimizado para extração e quantificação de TAA, AA e DHAA. As amostras utilizadas foram as mesmas em ambos os casos. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61440/Supplemental__File_2_.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp. at JoVE.com

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp.

Apresentamos um método rápido e confiável para quantificar a vitamina C em Lactuca spp. usando UPLC-UV, potencialmente transferível para outras plantas. Os principais passos são a preparação da amostra e a extração de vitamina C em condições estáveis, a redução do ácido dehidroascórbico ao ácido ascórbico e a otimização do procedimento cromatográfico.

Método UPLC-UV aprimorado para quantificação de vitamina C em variedades de alface (Lactuca sativa L.) e Parentes Silvestres de Cultura(Lactuca spp.)

Vitamins, especially vitamin C, are important micronutrients found in fruits and vegetables. Vitamin C is also a major contributor to their antioxidant ...

A vitamina C é um indicador do valor nutricional de frutas e hortaliças. Precisamos de um método fácil e confiável para quantificá-lo, especialmente na alface, o vegetal folhoso mais consumido em todo o mundo. Este método previne a degradação da vitamina C, e fornece uma extração aprimorada e uma quantificação rápida e confiável de ácidos ascóbicos e dehidroascóbicos, graças à sua precisão e sensibilidade.Este método pode ser usado na tecnologia de alimentos para criar rótulos de fatos nutricionais, na medicina para estudar os efeitos alimentares na saúde e na reprodução de plantas, para aumentar o teor de vitamina C em diferentes espécies. Demonstrando o procedimento com Ines Medina Lozano, estarão José Angel Aranjuelo e Arantzazu Castellanos, dois analistas do meu laboratório. Para preparar as amostras da planta, colher pelo menos uma folha externa e uma folha interna por planta e congelar imediatamente as folhas em nitrogênio líquido, antes de colocá-las em armazenamento de menos 80 graus Celsius.Para liofilizar as amostras de plantas congeladas, coloque os tubos de amostra não tampados nas bandejas dentro da câmara de secador congelante do liofilizador, e programe o liofilizador conforme indicado. Mantenha a temperatura do condensador a menos 80,2 graus Celsius, e a constante de vácuo em 112 Quando o material estiver completamente seco, adicione bolas de aço inoxidável de 10 milímetros de diâmetro às amostras liofilizadas, em tubos de polipropileno de 20 mililitros. E use um Vórtice Multi-Tubo, no momento e intensidade apropriados, para moer as amostras em uma poeira fina.Para preparar o estoque padrão de ácido ascórbico e soluções de diluição, pesar exatamente 10 miligramas de ácido ascórbico padrão em uma balança de precisão. E a 90 mililitros de fase móvel para a amostra. Use um agitador magnético para dissolver a amostra e use um frasco volumoso para medir com precisão 100 mililitros da solução resultante.Adicionando água ultrauso adicional, acidificada no pH dois com ácido fórmico, conforme necessário. Em seguida, prepare cinco diluições do estoque, para obter uma curva de calibração. Trabalhando sob baixa intensidade de luz, adicione 50 miligramas de amostra moída liofilizada e cinco mililitros de solvente de extração, a um tubo de centrífugo de polipropileno de 15 mililitros e vórtice da solução por cinco segundos.Depois de agitar a amostra por 10 minutos em um agitador orbital a 2000 rotações por minuto, transfira o tubo para um banho ultrassônico por 10 minutos, em temperatura ambiente e colete a amostra por centrifugação. Em seguida, coe o supernaente através de um filtro de celulose regenerada de 0,22 mícrons, em um frasco âmbar de cinco mililitros, para extrair os ácidos ascórbicos e dehidroascóbicos no extrato um. Para preparar a diluição para determinar a concentração de ácido ascórbico nas amostras de folhas, adicione 200 microliters de extrato um, e 800 microliters de água ultrapura em um frasco de cromatografia líquida âmbar de dois mililitros, e feche o frasco com um plugue PTFE/silicone.Para extração total de ácido ascórbico, transfira 200 microlitadores do extrato um, em um frasco de cromatografia líquida âmbar de dois mililitros, e adicione 200 microliters de solução redutora ao frasco. Feche o frasco com um plugue e o vórtice da solução por cinco segundos. Após uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, protegido da luz, use 200 microliters de ácido sulfúrico molar de 0,4 molar, para parar a reação e estabilizar o ácido ascórbico, a um pH ácido.Para preparar a diluição para determinar a concentração total de ácido ascórbico nas amostras, adicione 400 microliters de água ultrauso, para extrato total de ácido ascórbico dois. Feche o frasco com um plugue. Pelo menos uma hora antes de iniciar o experimento, confirme que todas as soluções de trabalho foram carregadas no sistema UPLC e ligue os três módulos UPLC.Quando o processo de calibração interna estiver concluído, abra o software e carregue o programa instrumental. Uma vez que o software é carregado clique em Quaternary Solvent Manager e clique no botão do mouse direito para selecionar o Console de lançamento, para acessar o console de gerenciamento UPLC. Clique em Sistema, Controle e Inicialização, para prosseguir com a preparação e estabilização do instrumento UPLC, e clique em Prime Solventes, QSM, verifique A, B, C, D, Seal Wash e Duração do Prime, maior que cinco minutos, para limpar todas as linhas UPLC, por pelo menos cinco minutos.Clique em SM, verifique Wash Solvent superior a 45 segundos. Verifique o Solvente de purga e 35 ciclos para limpar e limpar o injetor. Para equilibrar o UPLC às condições do método, verifique Equilibrate ao Método e QSM e defina o fluxo para 0,3 mililitros por minuto.Solvente A a 2% solvente B a 0%solvente C 98% e solvente D a 0%Ainda em Equilíbrio com Método e SM e definir a amostra para 5 graus Celsius, e a coluna a 30 graus Celsius. Ainda em Equilibre para Método e Outros, selecione Lamp On e clique em Iniciar. Deixe o equipamento estabilizar por pelo menos uma hora.Para verificar a estabilidade, clique em Iniciar o Sistema de Console e QSM e selecione QSM System Pressure, apenas para verificar a pressão na coluna. Se não houver tendências identificáveis nas mudanças de pressão, e o valor delta for inferior a 10 libras por polegada quadrada de pressão, na tela de início rápido, preencha a matriz com os nomes dos padrões e amostras a serem analisados. Para determinar a concentração de ácido ascórbico nas normas, injete cinco microlitadores de cada diluição no instrumento UPLC e realize a cromatografia, a partir da maioria diluída, até a solução mais concentrada, conforme indicado na tabela.Para determinar o ácido ascórbico e a concentração total de ácido ascórbico nas amostras de folhas, injete cinco microliters do extrato diluído um e extraia dois, respectivamente, no instrumento UPLC para análise cromatóbica. Para calcular o ácido ascórbico e as concentrações totais de ácido ascórbico, no software clique quickstart, Browse Project, Channels, o nome do padrão ou da amostra e canal PDA um, 245 nanômetros a 1,2 nanômetros. Para abrir o padrão e provar cromatogramas, clique no ponto de partida do cromatograma e arraste-o até o ponto final, para integrar o pico correspondente nos padrões e amostras.Em seguida, utilize os dados das diluições padrão de ácido ascórbico, para construir uma curva de calibração, para representar os valores de absorção cromatograficamente determinados e interpolar os valores de absorção da amostra, para obter o ácido ascórbico e a concentração total de ácido ascórbico, de acordo com a fórmula. A quantificação de vitamina C nas matrizes de Lactuca requer o desenvolvimento de uma abordagem cromatográfica que possa garantir resultados confiáveis. Aqui, um cromatograma resultante de um protocolo não otimizado apresentando e pico de ácido ascórbico, juntamente com um ombro de mineiro não identificado pode ser observado.No entanto, após melhorar a extração e as condições cromatográficas, um pico de ácido ascórbico resolvido sem interferências de compostos desconhecidos pode ser alcançado. Além disso, o uso de equipamentos ultravioleta UPLC, em vez de ultravioleta HPLC, reduz o tempo de retenção e de funcionamento. Interferências nos picos de ácido ascórbico, resultam consistentemente na subestimação do teor de vitamina C, devido a uma separação insuficiente durante o processo cromatográfico.À medida que as áreas de pico sobrepostas são integradas por uma queda vertical no ponto mais profundo entre elas. Além disso, o uso de um protocolo não otimizado impede a extração de qualquer conclusão útil, dos resultados. Como todas as amostras parecem ter um teor de vitamina C semelhante, em qualquer uma de suas formas.Em contrapartida, o uso do protocolo otimizado permite a detecção de diferenças estatisticamente significativas entre os diferentes tipos de amostras. Certifique-se de coletar várias amostras, preservar as amostras corretamente, minimizar a exposição da amostra a agentes oxidantes e quantificar ambas as formas de vitamina C.O teor total de vitamina C pode ser quantificado não apenas em qualquer espécie de planta, mas também, em qualquer fruta em qualquer fruta e vegetal, ou mesmo alimentos processados com poucas modificações técnicas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.)

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

O isolamento de lipoproteínas de alta densidade para não codificante pequeno ARN Quantificação

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Bioquímica

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

Um método eficiente para a Síntese de Peptóides com Monómeros Mixed tipo de lisina / arginina-tipo e avaliação da sua actividade anti-leishmaniose

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

Um método alternativo de cultura para manter Hypomethylation genômico das células-tronco embrionárias Mouse usando MEK inibidor PD0325901 e vitamina C

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Um método colorimétrico para medir o teor de ferro nas plantas

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Deteção da fosfolipase C atividade no cérebro Homogenate da abelha

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Quantificação da dinâmica da rede de interação de proteínas usando co-imunoprecipitação multiplexada

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Obtenção de dados de transcriptome de alta qualidade de sementes de cereal por um método modificado para criação de perfil de expressão genética

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

Análise de blot de RNA para detecção e quantificação de MicroRNAs vegetais

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...