Name: improved uplc-uv method for the quantification of vitamin c in lettuce varieties (lactuca sativa l.) and crop wild relatives (lactuca spp.)
Uploaded: 2020-06-30T13:00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp. at JoVE.com

Мы с благодарностью признаем Банк зародышевой плазмы Сарагосы (БГХЗ-СИТА, Испания) и Центр генетических ресурсов (СПГ, Вагенинген, Нидерланды) за поставку семян, необходимых для этой работы. Мы благодарим J. A. Aranjuelo, A. Castellanos и "laboratorio de valoraci'n nutritiva" от CITA за техническую поддержку и Д. Л. Гудчайлда за изучение английского языка. Эта работа финансировалась за счет проектов RTA2017-00093-00-00 от Национального института сельскохозяйственных и продовольственных исследований и технологий (INIA) и LMP164_18 от правительства Арагона; и оперативной программой ФЕДЕР Арагон 2014-2020 и Европейским социальным фондом от Европейского Союза (Grupos Consolidados A12-17R: "Grupo de investigaci'en fruticultura: caracterizaci'n, адаптацион у mejora gen'ica" и A14-17R: "Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles" (SAGAS) . I.M.L. был поддержан додокторантным контрактом на подготовку врачей от Министерства науки, инноваций и университетов Испании (MCIU) и Испанского государственного исследовательского агентства (AEI).

<ol>
	<li>Llorach, R., Mart&#237;nez-S&#225;nchez, A., Tom&#225;s-Barber&#225;n, F. A., Gil, M. I., Ferreres, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+polyphenols+and+antioxidant+properties+of+five+lettuce+varieties+and+escarole.">Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole.</a> Food Chemistry. 108 (3), 1028-1038 (2008).</li><li>Carr, A. C., Frei, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+new+recommended+dietary+allowance+for+vitamin+C+based+on+antioxidant+and+health+effects+in+humans.">Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 69 (6), 1086-1107 (1999).</li><li>Carr, A. C., Vissers, M. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+or+food-derived+vitamin+C-Are+they+equally+bioavailable.">Synthetic or food-derived vitamin C-Are they equally bioavailable.</a> Nutrients. 5 (11), 4284-4304 (2013).</li><li>Lee, S. K., Kader, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preharvest+and+postharvest+factors+influencing+vitamin+C+content+of+horticultural+crops.">Preharvest and postharvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops.</a> Postharvest Biology and Technology. 20 (3), 207-220 (2000).</li><li>Shekhovtsova, T. N., Muginova, S. V., Luchinina, J. A., Galimova, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+methods+in+food+analysis:+determination+of+ascorbic+acid.">Enzymatic methods in food analysis: determination of ascorbic acid.</a> Analytica Chimica Acta. 573-574, 125-132 (2006).</li><li>Zhan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+exposure+during+storage+preserving+soluble+sugar+and+L-ascorbic+acid+content+of+minimally+processed+romaine+lettuce+(Lactuca+sativa+L.var.+longifolia).">Light exposure during storage preserving soluble sugar and L-ascorbic acid content of minimally processed romaine lettuce (Lactuca sativa L.var. longifolia).</a> Food Chemistry. 136 (1), 273-278 (2013).</li><li>Malejane, D. N., Tinyani, P., Soundy, P., Sultanbawa, Y., Sivakumar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficit+irrigation+improves+phenolic+content+and+antioxidant+activity+in+leafy+lettuce+varieties.">Deficit irrigation improves phenolic content and antioxidant activity in leafy lettuce varieties.</a> Food Science and Nutrition. 6 (2), 334-341 (2017).</li><li>Tarrago-Trani, M. T., Phillips, K. M., Cotty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-specific+method+validation+for+quantitative+analysis+of+vitamin+C+in+diverse+foods.">Matrix-specific method validation for quantitative analysis of vitamin C in diverse foods.</a> Journal of Food Composition and Analysis. 26 (1-2), 12-25 (2012).</li><li>Klimczak, I., Gliszczy&#324;ska-&#346;wig&#322;o, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+UPLC+and+HPLC+methods+for+determination+of+vitamin+C.">Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C.</a> Food Chemistry. 175, 100-105 (2015).</li><li>Z&#322;otek, U., &#346;wieca, M., Jakubczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+abiotic+elicitation+on+main+health-promoting+compounds,+antioxidant+activity+and+commercial+quality+of+butter+lettuce+(Lactuca+sativa+L.).">Effect of abiotic elicitation on main health-promoting compounds, antioxidant activity and commercial quality of butter lettuce (Lactuca sativa L.).</a> Food Chemistry. 148, 253-260 (2014).</li><li>Koh, E., Charoenprasert, S., Mitchell, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+organic+and+conventional+cropping+systems+on+ascorbic+acid,+vitamin+C,+flavonoids,+nitrate,+and+oxalate+in+27+varieties+of+spinach+(Spinacia+oleracea+L).">Effect of organic and conventional cropping systems on ascorbic acid, vitamin C, flavonoids, nitrate, and oxalate in 27 varieties of spinach (Spinacia oleracea L).</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (12), 3144-3150 (2012).</li><li>Ka&#322;uzewicz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+short-term+storage+on+the+content+of+flavonoids+and+vitamin+C+in+Broccoli.">The influence of short-term storage on the content of flavonoids and vitamin C in Broccoli.</a> European Journal of Horticultural Science. 77 (3), 137-143 (2012).</li><li>van Treuren, R., van Eekelen, H. D. L. M., Wehrens, R., de Vos, R. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+variation+in+the+lettuce+gene+pool:+towards+healthier+crop+varieties+and+food.">Metabolite variation in the lettuce gene pool: towards healthier crop varieties and food.</a> Metabolomics. 14 (11), 1-14 (2018).</li><li>Swartz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPLC:+An+introduction+and+review.">UPLC: An introduction and review.</a> Journal of Liquid Chromatography &amp; Related Technologies. 28 (7), 1253-1263 (2005).</li><li>Sp&#237;nola, V., Mendes, B., C&#226;mara, J. S., Castilho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+and+fast+UHPLC-PDA+methodology+for+determination+of+L-ascorbic+and+dehydroascorbic+acids+in+fruits+and+vegetables.+Evaluation+of+degradation+rate+during+storage.">An improved and fast UHPLC-PDA methodology for determination of L-ascorbic and dehydroascorbic acids in fruits and vegetables. Evaluation of degradation rate during storage.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (4), 1049-1058 (2012).</li><li>Ball, G. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Water-soluble vitamin assays in human nutrition. , (1994).</li><li>Bertol&#237;n, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+carotenoids,+tocopherols,+retinol+and+cholesterol+in+ovine+lyophilised+samples+of+milk,+meat,+and+liver+and+in+unprocessed/raw+samples+of+fat.">Simultaneous determination of carotenoids, tocopherols, retinol and cholesterol in ovine lyophilised samples of milk, meat, and liver and in unprocessed/raw samples of fat.</a> Food Chemistry. 257, 182-188 (2018).</li><li>Sp&#237;nola, V., Llorent-Mart&#237;nez, E. J., Castilho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+vitamin+C+in+foods:+Current+state+of+method+validation.">Determination of vitamin C in foods: Current state of method validation.</a> Journal of Chromatography A. 1369, 2-17 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=radiation+is+beneficial+for+yield+and+quality+of+indoor+cultivated+lettuce.">radiation is beneficial for yield and quality of indoor cultivated lettuce.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1-10 (2019).</li><li>Damerum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+genetic+basis+of+antioxidant+status+in+lettuce+(Lactuca+sativa).">Elucidating the genetic basis of antioxidant status in lettuce (Lactuca sativa).</a> Horticulture Research. 2 (15055), 1-13 (2015).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Витамин С является очень важным питательным веществом, но это очень лабиновое соединение тоже, так что его UPLC-UV количественной оценки зависит от нескольких факторов, таких как хранение образцов и подготовки, метод извлечения и хроматографических условиях. Поэтому необходима быстрая и простая процедура предотвращения окисления АА (с антиоксидантной силой) до DHAA (без антиоксидантных свойств). Кроме того, крайне важно избегать высокого рН и температурных условий, а также интенсивного света и окисления атмосферы во время обработки образцов для содействия стабильности соединения.
Для сведения к минимуму окисления АА были приняты следующие меры. Прежде всего, образцы были лиофилизированы в качестве исходного материала для обоих протоколов для обеспечения точной количественной оценки содержания витамина С и легко манипулировать образцами. Этот вариант был предпочтительнее мелкой шлифовки, обычно встречается вовсей литературе 19, как пыль тает очень быстро, так что вода становится доступной снова. Во время процедуры экстракции, более высокий объем более кислого раствора (8% уксусной кислоты и 1% MPA) был использован в качестве экстрактанта в оптимизированномпротоколе (Дополнительный файл 2), который также выступал в качестве стабилизатора, предотвращая деградацию АА. Это решение также содержало EDTA в качестве хелатирующего агентадля увеличения стабилизации 16,в отличие от экстрактанта в неоптимизированномпротоколе (дополнительный файл 2). Кроме того, мы проверили, можно ли усовершенствовать процедуру извлечения с помощью двух последовательных извлечений с 2,5 мл экстрактанта вместо одного с 5 мл и в атмосфере N2 вместо стандартных атмосферных условий. Наилучшие результаты были достигнуты с использованием только одной экстракции в неизмененной атмосфере, что упростило протокол, сделав ненужные дополнительные шаги (данные не показаны). Другие незначительные изменения были также внесены в протокол для того, чтобы увеличить добычу (т.е. sonication), получить более четкий экстракт (тонкая фильтрация) и уменьшитьпродолжительность протокола (Дополнительный файл 2). Что касается хроматографических условий, то проверка метода была проведена, каксообщалось до 18года, гарантируя хорошие аналитические параметры(таблица 3). Кроме того, использование ультрачистой воды с мякотью кислотой (рН 2.0) и метанолом (98:2 v:v) с потоком 0,3мл мин -1, вместо монопотассий фосфата 30 мМ (pH 3.0) при 1 млмин -1 в качестве мобильной фазы(дополнительный файл 2),привело к улучшению метода. Наиболее важным достижением, вероятно, было использование системы UPLC вместо HPLC, что позволило нам больше контролировать условия воздействия (например, температуру) и в результате решены пики АА без помех неизвестных соединений, в более короткое время и потребляющих меньше объема экстракта(Дополнительный файл 2).
Тем не менее, существует два основных ограничения этого метода. Первая заключается в том, что DHAA не может быть измерена непосредственно с помощью УФ-детектора из-за его низкой абсорбции в УФ-диапазоне спектра. Важно количественно содержание DHAA, поскольку он представляет определенную биологическую активность и легко кабриолет АА в организме человека5. Для этого необходима дополнительная реакция на сокращение DHAA до АА, а также второй хроматографический запуск для того, чтобы измерить TAA, а затем определить DHAA косвенно, вычитая содержание АА из TAA (Рисунок 3). В этом смысле, шаг сокращения был оптимизирован с помощью более высокой концентрации уменьшая агента (DTT), увеличивая время реакции от 5 до 30 минут, и останавливая реакцию с серной кислотой(Дополнительный файл 2). Низкая стабильность АА представляет собой второе ограничение метода. Как А. А. начинает деградировать 4 ч послеизвлечения (дополнительный файл 1), необходимо количественно его в этот промежуток времени. Таким образом, количество образцов для извлечения обусловлено хроматографической процедурой. Поэтому мы предлагаем заморозить их на этом этапе в этом протоколе, хотя в этом случае не все из них могут быть помещены в автоамплеер UPLC для автоматического измерений. К счастью, уменьшенный RT для АА позволил нам получить 3 мин хроматограммы, гораздо короче, чем 7 мин хроматограммы, полученные с помощью HPLC (Дополнительный файл 2). Таким образом, содержание витамина С может быть определено в большом количестве образцов в окне 4 ч.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig03.jpg"> Рисунок 3: Рабочий процесс количественной оценки витамина С в салате и некоторых диких родственников. Схематическая диаграмма оптимизированного протокола, показывающая две ветви для определения только АА или АА й DHAA (TAA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Поскольку витамин С является важным питательным веществом для человека и из-за его важных преимуществ для здоровья, он стал объектом многих исследований. Таким образом, он был количественно в большое разнообразие культур, в том числе салат, один из самых потребляемых овощей во всем мире. Простые классические методы были постепенно заменены жидкими методами хроматографии, потому что они более специфичны и точны10. Однако, в связи с необходимостью дополнительной реакции для количественной оценки как, А. А. и DHAA через HPLC, в некоторых исследованиях на салат,только АА 14 или только TAA11 (без количественной оценки АА до сокращения DHAA в АА) были измерены. Кроме того, лишь немногие авторы количественно АА и DHAA, несмотря на вклад обеих молекул в антиоксидантной активности витамина С2. Тем не менее, техника UPLC стала более важной в последнее время из-за его более высокой производительности при измерении витамина С в несколькихкультурах 16. Сравнивая результаты, полученные в этом исследовании, с двумя методологиями, UPLC и HPLC, эти преимущества были подтверждены: четко определенные пики АА благодаря более высокой чувствительности, и в очень короткие сроки, были достигнуты, что также подразумевает меньше ресурсов, потребляемых. Несмотря на эффективность UPLC, только Chen et al.20 применили этот метод для измерения содержания витамина С в салате, что все еще привело к недооценке, так как была количественно оценена только форма АА.
Таким образом, эта работа представляет собой первую успешную попытку определить общее содержание витамина С не только в различных сортах салата, но и в некоторых из их диких родственников. Количественная оценка витамина С также имеет важное значение для выбора салатов с более высокой антиоксидантной активностью в рамках программ разведения. В этом смысле, увеличение общего содержания витамина С в салат диких родственников найти здесь и увеличение содержанияАА сообщили в предыдущих исследованиях 14,а также других антиоксидантных соединений 21, расширяет подходящих кандидатов для улучшения питательной ценности салатов.
В заключение, даже с некоторыми ограничениями, присущими природе витамина С, как и его постепенная деградация через несколько часов после извлечения или необходимость снижения реакции из-за низкой DHAA УФ-абсорбции, он предлагает менее трудоемкий и менее трудоемкий метод для измерения содержания витамина С. Кроме того, он также очень надежный и показывает высокую чувствительность и мощность разрешения. Кроме того, он легко может передаваться не только другим растительным материалам с незначительными изменениями или без них, но и переработанным продуктам, которые поставляют диетическое потребление витамина С человеку, что приводит к широкому спектру будущих применений в новой области тестирования на надежное качество пищевых продуктов.

Культивируемыйсалат (Lactuca sativa L.) является одним из самых производимых и потребляемых листовых овощей во всем мире, с общим производством около 27,3 млн тонн в 2018году 1. Салат воспринимается потребителями как здоровый. Питательные свойства в основном связаны с источником антиоксидантных соединений в культуре, таких как витамин С, среди других, как полифенолы и витаминЕ 2. Витамин С является важным микроэлементом для человека в отличие от многих других позвоночных, так как мы не в состоянии производить его из-за мутаций, присутствующих в генном кодировании для последнего шага фермента в биосинтетическойпути 3. Это необходимо для нормального метаболизма клеток, а также играет важную роль в иммунной реакции в основном из-за егоантиоксидантной активности 3,4.
Общий витамин С состоит из аскорбиновой кислоты (АА) и дегидроаскорбиновой кислоты (DHAA). АА является наиболее биологически активной формой витамина, но DHAA (его продукт окисления) также показывает биологическую активность, и он может быть легко преобразован в АА в организмечеловека 5. Таким образом, количественная оценка обеих форм имеет важное значение для определения общего содержания витамина С любого садоводческого урожая, салат включены.
Для измерения витамина С в овощах используется широкий спектр подходов, основанных на различных аналитических методах, таких как энзиматические, спектрофотометрические и титриметрическиеметоды 6,7,8. Хотя эти методы просты, они не являются химически специфическими для AA9. Следовательно, предпочтительными являются хроматографические методы, особенно высокой производительности жидкой хроматографии-ультрафиолетовой (HPLC-UV) техника, из-за их более высокойточности 10. HPLC-UV был использован для определения витамина С в большом разнообразии культур, как брокколи, шпинат и салат11,12,13. Тем не менее, одновременная количественная оценка АА и DHAA осложняется из-за низкой абсорбции DHAA в ультрафиолетовом диапазоне спектра. Кроме того, DHAA может быть определена косвенно с помощью уменьшающий агент, который преобразует DHAA в АА, измерения общей аскорбиновой кислоты (TAA), а затем расчета разницы между TAA и АА. Из-за необходимости снижения реакции, в некоторых исследованиях, только АА была количественно14, которые могут фактически представляют собой недооценку активности витамина С. Эта дополнительная реакция сокращения также необходима для определения DHAA косвенно, даже когда последний прогресс в жидкой хроматографии методы, ультра-высокой производительности жидкой хроматографии (UPLC), используется. Этот шаг также выигрывает от преимуществ, которые UPLC проявляет по сравнению с HPLC: более высокая эффективность и разрешение, повышенная чувствительность, более короткий анализ времени и более низкоепотребление растворителя 15. В результате, UPLC-UV техника была использована для количественной оценки витамина С в различных культурах16.
Кроме того, АА является очень лабильной молекулой; Таким образом, важно разработать протокол, который предотвращает его деградацию во время хранения салата и анализа витаминаС 9. В этом контексте следующий протокол предлагает быструю и улучшенную количественную оценку содержания витамина С в салате UPLC-UV, а также эффективную процедуру экстракции. В настоящее исследование были включены не только элитные сорта, но и традиционные ландраки и некоторые дикие родственники из-за их потенциального интереса к разведению сельскохозяйственных культур, в частности, к повышению питательной ценности салата.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT) &#8805;98% (Ellman&#8242;s reagent)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm f stainless steel ball</td>
			<td>Euro Aznar Supplies S.L.</td>
			<td>20112100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube for centrifuge</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>429946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL HPLC amber vial</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL syringe with needle</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>JS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Dealtalab</td>
			<td>202840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) &#8805;99.9% (titration)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene tube</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>429951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (CH3COOH) &#8805;99% purity glacial, ReagentPlus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrilo, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 &#181;m filtrated)</td>
			<td>Chem-lab</td>
			<td>CL00.0189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 &#181;m)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 1 L, 200 mL</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>191725, 191722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>766384</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15549004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>5438040100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer VirTis genesis 25EL</td>
			<td>VirTis</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph Multi Reax mixer</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph Reax top mixer</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an e&#955; Detector</td>
			<td>Hewlett Packard</td>
			<td>na</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid &#8805;99%, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol &#8805;99.9% (HPLC supergradient grade)</td>
			<td>ChemLab</td>
			<td>CL00.0189.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 10-1000 &#956;L</td>
			<td>Socorex</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 &#181;m)</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>54919</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE-silicone cap with preaperture</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R</td>
			<td>Gyrozen</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose filters 0.22 &#181;m (13 mm)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1015190-5108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose filters 0.45-&#181;m (13 mm)</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>SFCA-145-100</td>
			<td>Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer He&#955;ios &#946;</td>
			<td>Thermo Scientific Corporation</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4) 95.0-98.0% purity, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>WasserLab</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasons H-D</td>
			<td>Selecta</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks 1 L, 100 mL</td>
			<td>DeltaLab</td>
			<td>191489, 191486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA e&#955; Detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved uplc-uv method for the quantification of vitamin c in lettuce varieties (lactuca sativa l.) and crop wild relatives (lactuca spp.)

Витамины, особенно витамин С, являются важными микроэлементами, содержащиеся во фруктах и овощах. Витамин С также является одним из основных факторов, способствующих их антиоксидантной способности. Салат является одним из самых популярных овощей среди потребителей во всем мире. Точный протокол для измерения содержания витамина С в салате и других смежных видах имеет решающее значение. Здесь описан метод, использующий сверхвысокую высокую производительность жидкой хроматографии-ультрафиолетовую (UPLC-UV) методику, при которой были оптимизированы методы подготовки образцов, экстракции витаминов и хроматографии.
Образцы были собраны, чтобы представлять все растение, замороженные при -80 градусов по Цельсию и лиофилизированы, чтобы предотвратить нежелательное окисление и сделать их манипуляции легче. Экстракция витамина С осуществлялась в кислых средствах массовой информации, что также способствовало его стабильности. Поскольку витамин С может присутствовать в двух различных межконвертируемых формах, аскорбиновой кислоте (АА) и дегидроаскорбиновой кислоте (DHAA), оба соединения должны быть измерены для точной количественной оценки. DHAA была количественно косвенно после его сокращения до АА, потому что АА показывает более высокую абсорбцию, чем DHAA в УФ-диапазоне спектра. Из одного и того же экстракта были проведены два измерения: одно до и одно после этой реакции на сокращение. В первом случае мы количественно оценивали содержание АА, а во втором мы количественно оценивали сумму АА и DHAA (TAA: общая аскорбиновая кислота) в виде АА. Затем, DHAA количество было косвенно получено путем вычитания АА Исходя из первого измерения от TAA. Они были определены UPLC-UV, используя коммерческий стандарт АА для построения кривой калибровки и оптимизации хроматографической процедуры, для получения пиков АА, которые были полностью решены в течение короткого времени. Этот протокол можно легко экстраполировать на любой другой растительный материал с небольшими изменениями или без них. Его точность выявила статистически значимые различия в противном случае непровереные. Другие сильные и сильные стороны более подробно обсуждаются в рукописи.

Количественная оценка витамина С в матрицах Lactuca требует разработки хроматографического подхода, который может обеспечить надежные результаты. На рисунке 1A показана хроматограмма, полученная в результате неоптимизировалипротокол (дополнительный файл 2), который представляет пик АА вместе с неопознанным незначительным "плечом". Тем не менее, после улучшения экстракции и хроматографических условий, был достигнут решенный пик АА без помех неизвестных соединений(рисунок 1B). Кроме того, использование УФ-оборудования UPLC вместо HPLC-UV позволило нам сократить время удержания (RT) для АА: 1,874 мин в оптимизированных хроматограммах против 2,980 мин в неоптимизированных(рисунок 1), а также времяработы, 3 и 7 минут для оптимизированных и неоптимизировали протоколы соответственно.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig01.jpg"> Рисунок 1: Хроматограммы АА в том же образце салата (коммерческий сорт 'Bego'a'). (A) HPLC-UV хроматограмма в результате неоптимизировали протокол (условия, описанные в дополнительном файле 2). (B)UPLC-UV хроматограмма, полученная с помощью оптимизированного протокола (условия, описанные в таблице 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Помехи в пиках АА, как и те, которые наблюдаются на рисунке 1А,постоянно приводили к недооценке содержания витамина С (АА, DHAA и TAA)(рисунок 2)из-за недостаточного разделения во время хроматографического процесса, поскольку перекрывающиеся пиковые области были интегрированы вертикальным падением в самой глубокой точке между ними. Эта предвзятость особенно заметна в случае урожая диких родственников, особенно в DHAA и TAA содержание (Рисунок 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig2v2.jpg"> Рисунок 2: Распределение содержания витамина С. Сплит скрипки участков DHAA, АА и TAA содержание (мг г-1 сухого веса) в коммерческих и традиционных сортов салата и некоторых диких родственников с использованием неоптимизированы и оптимизированы протоколы. Черные линии показывают средние значения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig2v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Кроме того, использование неоптимизировали протокол помешали нам извлечь какие-либо полезные выводы из результатов, как они показали все образцы, как виды салатов и диких родственников, имеющих аналогичное содержание витамина С. В отличие от этого, оптимизированный протокол позволил нам обнаружить статистически значимые различия между ними для DHAA и TAA содержание (Таблица 4), самые богатые из них диких видов(рисунок 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Не оптимизировано</td>
			<td colspan="2">Оптимизированные</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>F-коэффициент</td>
			<td>
p-значение</td>
			<td>F-коэффициент</td>
			<td>
p-значение</td>
		</tr>
<tr>
<td>ДХАА</td>
			<td>0.460</td>
			<td>0,637нс
</td>
			<td>5.613</td>
			<td>0.009**</td>
		</tr>
<tr>
<td>Аа</td>
			<td>0.070</td>
			<td>0,932нс
</td>
			<td>1.020</td>
			<td>0,374нс
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Таа</td>
			<td>0.015</td>
			<td>0,985нс
</td>
			<td>4.438</td>
			<td>0.022*</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
ns, и q указывают на неосвенимые и значимые на plt;0.05 и 0.01, соответственно.</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 4: Изменение содержания витамина С. F-коэффициенты (коэффициенты двух отклонений, дисперсия между группами и внутригрупповая дисперсия) и значения значимости от одной стороны ANOVA с учетом типа Lactuca (коммерческие сорта салата, традиционные сорта салата и дикие родственники урожая) для содержания DHAA, AA и TAA в неоптимизированных и оптимизированных протоколах.
Дополнительный файл 1: Стабильность АА и TAA при 5 градусов по Цельсию более 24 ч. (A) АА и TAA пиковых областях в течение 24ч.( B ) АА и TAA содержание (мг г-1 сухого веса) в течение 24 ч. Бары представляют собой стандартные отклонения двух технических репликаций (n'2), которые хранятся в автозамомплере при 5 градусов по Цельсию и защищены от воздействия света. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61440/Supplemental_File_1_.pptx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный файл 2: Основные различия между оптимизированным и неоптимизированным протоколом для извлечения и количественной оценки TAA, AA и DHAA. В обоих случаях образцы были одинаковыми. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61440/Supplemental__File_2_.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp. at JoVE.com

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp.

Мы представляем быстрый и надежный метод количественной оценки витамина С в Lactuca spp. с использованием UPLC-UV, потенциально перенесите его другим растениям. Ключевыми шагами являются подготовка образца и экстракция витамина С в стабильных условиях, снижение дегидроаскорбиновой кислоты до аскорбиновой кислоты и оптимизация хроматографической процедуры.

Улучшенный UPLC-UV метод количественной оценки витамина С в листьях салата(Lactuca sativa L.) и Crop Wild Relatives(Lactuca spp.)

Vitamins, especially vitamin C, are important micronutrients found in fruits and vegetables. Vitamin C is also a major contributor to their antioxidant ...

Витамин С является показателем питательной ценности фруктов и овощей. Нам нужен простой и надежный метод количественной оценки, особенно в салате, наиболее потребляемых листовых овощей во всем мире. Этот метод предотвращает деградацию витамина С, а также обеспечивает повышенную экстракции и быструю, надежную количественную оценку как аскорбийских, так и дегидроаскорбных кислот, благодаря своей точности и чувствительности.Этот метод может быть использован в пищевой технологии для создания питательных этикетки факт, в медицине для изучения воздействия пищи на здоровье и в растениеводства, для увеличения содержания витамина С в различных видах. Демонстрация процедуры с Инес Медина Лосано, будет Хосе Анхель Aranjuelo и Arantzazu Кастелланос, два аналитика из моей лаборатории. Чтобы подготовить образцы растений, собрать хотя бы один внешний и один внутренний лист на растение и немедленно заморозить листья в жидком азоте, прежде чем поместить их в минус 80 градусов по Цельсию хранения.Чтобы лиофилизовать замороженные образцы растений, поместите незакрытые пробные трубки на подносы в камере замораживания химчистки лиофилизатора, и запрограммируйте лиофилизатор, как указано. Поддержание температуры конденсата при температуре минус 80,2 градуса по Цельсию, а вакуумная константа на уровне 112 Когда материал полностью высохнет, добавьте 10 миллиметровых шариков из нержавеющей стали в лиофилизированные образцы, в 20 миллилитровых полипропилевых труб. И используйте Multi-Tube Vortexer, в соответствующее время и интенсивность, чтобы измельчить образцы в тонкую пыль.Для приготовления стандартных растворов аскорбиновой кислоты и разбавления весят ровно 10 миллиграммов стандарта аскорбиновой кислоты на точном балансе. И на 90 миллилитров мобильной фазы к образцу. Используйте магнитный мешалку, чтобы растворить образец, и использовать объемную колбу, чтобы точно измерить 100 миллилитров полученного раствора.Добавление дополнительной ультрапурной воды, подкисленной при рН 2 с кремовой кислотой, по мере необходимости. Затем приготовьте пять разбавлений из бульона, чтобы получить кривую калибровки. Работая при низкой интенсивности света, добавьте 50 миллиграммов лиофилинизированного грунтового образца и пять миллилитров растворителя экстракции в 15-миллилитровую полипропиленовую центрифугу и вихрем раствор в течение пяти секунд.После встряхивания образца в течение 10 минут на орбитальном шейкере при 2000 оборотов в минуту, перенесите трубку в ультразвуковую ванну на 10 минут, при комнатной температуре и соберите образец путем центрифугации. Затем процедите супернатант через 0,22 микрона регенерированный целлюлозный фильтр, в пять миллилитров янтарного флакона, чтобы извлечь как аскорбиновые и дегидроаскорбные кислоты в экстракте один. Чтобы подготовить разбавление для определения концентрации аскорбиновой кислоты в образцах листьев, добавьте 200 микролитров экстракта один, и 800 микролитров ультрапурной воды в два миллилитров янтарного жидкого хроматографического флакона, и закрыть флакон с PTFE / силиконовой вилкой.Для общей экстракции аскорбиновой кислоты перенесите 200 микролитров экстракта в двухми миллилитровый янтарный жидкий хроматографический флакон и добавьте 200 микролитров уменьшающих растворов к флакону. Закройте флакон вилкой и вихрем раствор в течение пяти секунд. После 30-минутной инкубации при комнатной температуре, защищенной от света, используйте 200 микролитров 0,4 моларной серной кислоты, чтобы остановить реакцию и стабилизировать аскорбиновую кислоту, до кислого рН.Для подготовки разбавления для определения общей концентрации аскорбиновой кислоты в образцах добавьте 400 микролитров ультрачистой воды, чтобы в общей сложности экстракт аскорбиновой кислоты два. Закройте флакон вилкой. По крайней мере за час до начала эксперимента подтвердите, что все рабочие решения были загружены в систему UPLC, и включите три модуля UPLC.Когда процесс внутренней калибровки закончится, откройте программное обеспечение и загрузите инструментальную программу. После загрузки программного обеспечения нажмите кнопку «Менеджер по работе с другими» и нажмите кнопку «Правая мышь», чтобы выбрать консоль запуска, чтобы получить доступ к консоли управления UPLC. Нажмите системы, управления и запуска, чтобы приступить к подготовке и стабилизации инструмента UPLC, и нажмите Премьер Solvents, ЗСМ, проверить A, B, C, D, Seal Wash и продолжительность премьер, более пяти минут, чтобы очистить все линии UPLC, по крайней мере пять минут.Нажмите SM, проверьте Wash Solvent более 45 секунд. Проверьте Очистка Solvent, и 35 циклов, чтобы очистить и очистить инжектор. Чтобы уравночные настройки UPLC к условиям метода, проверьте Equilibrate к методу и ЗСМ, и установите поток до 0,3 миллилитров в минуту.Solvent A до 2%solvent B до 0%solvent C 98%и растворитель D до 0%Все еще в Equilibrate к методу и SM и установить образец до 5 градусов по Цельсию, и столбец до 30 градусов по Цельсию. Все еще в Equilibrate к методу и другому, выберите лампу дальше, и щелкните старт. Разрешить оборудование стабилизировать, по крайней мере час.Чтобы проверить стабильность, щелкните Стартовая консольная система иSM и выберите давление системыSM, только чтобы проверить давление в столбце. Если нет идентифицируемых тенденций в изменении давления, и дельта значение составляет менее 10 фунтов на квадратный дюйм давления, в быстрый стартовый экран, заполнить матрицу с именами стандартов и образцов, которые будут проанализированы. Чтобы определить концентрацию аскорбиновой кислоты в стандартах, ввимите пять микролитров каждого разбавления в инструмент UPLC и провести хроматографию, начиная с наиболее разбавленного, до наиболее концентрированного раствора, как указано в таблице.Для определения аскорбиновой кислоты и общей концентрации аскорбиновой кислоты в образцах листьев, ввимите пять микролитров разбавленного экстракта один и извлечь два соответственно, в инструмент UPLC для хроматографического анализа. Для расчета концентрации аскорбиновой кислоты и общей концентрации аскорбиновой кислоты в программном обеспечении щелкните quickstart, Browse Project, Channels, название стандарта или образца и канал PDA One, 245 нанометров на 1,2 нанометров. Чтобы открыть стандартную и выборку хроматограмм, нажмите на отправную точку хроматограммы и перетащите ее до конечной точки, чтобы интегрировать соответствующий пик в стандарты и образцы.Затем используйте данные из стандартных разбавлений аскорбиновой кислоты, чтобы построить кривую калибровки, представить хроматографически определенные значения абсорбции и интерполировать значения абсорбции образца, чтобы получить аскорбиновую кислоту и общую концентрацию аскорбиновой кислоты, согласно формуле. Квантификация витамина С в матрицах Лактука требует разработки хроматографического подхода, который может обеспечить надежные результаты. Здесь можно наблюдать хроматограмму, полученную в результате неоптимизированного протокола представления и пика аскорбиновой кислоты, вместе с неопознанным на шахтером плече.Тем не менее, после улучшения экстракции и хроматографических условий, решен аскорбиновой кислоты пик без помех неизвестных соединений может быть достигнуто. Кроме того, использование ультрафиолетового оборудования UPLC, а не HPLC ультрафиолетового, сокращает время удержания и работы. Вмешательства в пики аскорбиновой кислоты, последовательно приводят к недооценке содержания витамина С, из-за недостаточного разделения во время хроматографического процесса.По мере того, как перекрывающиеся пиковые области интегрируются вертикальным падением в самой глубокой точке между ними. Кроме того, использование неоптимизировали протокол предотвращает извлечение любого полезного вывода, из результатов. Поскольку все образцы, как представляется, имеют аналогичное содержание витамина С, в любой из его форм.Напротив, использование оптимизированного протокола позволяет обнаруживать статистически значимые различия между различными типами образцов. Будьте уверены, чтобы собрать несколько образцов, чтобы сохранить образцы правильно, чтобы свести к минимуму воздействие образца на окисляющие агенты и количественно обе формы витамина С.Общее содержание витамина С может быть количественно не только в любых видов растений, но и, в любой плод в любых фруктов и овощей, или даже обработанные пищевые продукты с несколькими изменениями техники.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.)

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Выделение липопротеидов высокой плотности для Некодирующих малых РНК квантификации

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

Эффективный метод синтеза Пептоиды с мономерами смешанного типа Лизин / аргинин-типа и оценки их Анти-leishmanial деятельности

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

Метод альтернативной культуры для поддержания геномной Hypomethylation мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием MEK ингибитор PD0325901 и витамином С

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Колориметрический метод измерения содержания железа в растениях

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Полисома профилирование лейшманий, клетки человека и мыши яичка

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Определение активности фосфолипазы C в мозг огневки от пчелы

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Количественная оценка протеома общесистемной маркировки однородность на уровне одной молекулы

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Количественная оценка динамики взаимодействия белков с использованием мультиплексного со-иммунопрециации

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Получение высококачественных транскриптомных данных из зерновых семян с помощью модифицированного метода профилирования экспрессии генов

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

Анализ РНК-блотов для обнаружения и количественной оценки микроРНК растений

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...