Name: detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients
Uploaded: 2020-09-09T13:30:00
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Les auteurs tiennent à remercier les membres du Laboratoire de génomique du cancer et de bioincompétation des maladies complexes pour leurs contributions observationnelles et leur participation à de multiples discussions à différentes étapes de ce projet. Le soutien financier comprend l’Association israélienne contre le cancer (subvention de l’ICA pour M.F-M 2017-2019) et la subvention Kamin de l’Autorité israélienne de l’innovation (pour M.F-M.).

Avant la collecte de sang, le consentement éclairé des sujets participant à la recherche est nécessaire et doit être obtenu. Les recherches décrites dans ce manuscrit ont été effectuées conformément au Rabin Medical Center, au Comité éthique d’Israël (code éthique: 0039-17-RMC) et à la Faculté de médecine Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Comité éthique allemand (code éthique: D 405/14).
1. Collecte et stockage d’échantillons de sang dans des tubes de conserv...

La collecte du sang d’un patient dans un tube, l’expédition et le stockage sont des étapes initiales cruciales dans la biopsie liquide. Une mauvaise manipulation peut nuire à la qualité du plasma et, par conséquent, peut interférer avec les résultats de la biopsie liquide47. Si un échantillon de sang est prélevé dans un tube sanguin EDTA, le plasma doit être séparé dans les deux heures suivant la collecte de sang afin d’éviter la lyse des CWB et la libération de son ADN génom...

Les progrès technologiques ont conduit au séquençage de centaines de génomes de cancer et transcriptomes1. Cela a contribué à comprendre les paysages des changements moléculaires entre les différents types de cancer2. D’autres études sur ces paysages ont contribué à caractériser les altérations somatiques séquentielles et les fusionsgène-gène 3 qui sont impliquées dans le cancer ou la progression tumorale, en perturbant périodiquement les voies d’apoptose4. Par conséquent, les mutations somatiques et les fusions gène-gène peuvent fournir l’information au sujet des tumeurs en servant de biomarqueurs dans les patients individuels pour un type particulier de tumeur5,identifiant le pronostic primaire existant de tumeurs6,catégorisant des tumeurs secondaires basées sur des changements moléculaires7,et identifiant des cibles de tumeur druggable8. Ces informations peuvent faciliter la sélection d’un traitement personnalisé pour les patients atteints de cancer et dans la détermination des réponses positives et négatives autraitement 9. Cependant, obtenir le matériel de tumeur pour identifier le profilage génomique du tissu de tumeur est une procédureenvahissante 10. En outre, une biopsie de tumeur comprend seulement une petite partie d’une tumeur hétérogène ; et peut, par conséquent, ne pas être représentatif pour le profil moléculaire de la tumeur entière11. La surveillance périodique et le génotypage de tumeur exigent une collection répétée des tissus de tumeur, qui, habituellement, n’est pas faisable en raison de l’invasivité de la procédure de biopsie de tumeur et des issues de sûreté qui découlent de telles procédures12.
La technique de biopsie liquide, d’autre part, a gagné l’attention énorme dans l’oncologie de précision au cours dela dernière décennie 13,14. Elle est principalement due à la non-invasiveness de cette technique, et à la possibilité qu’elle soit répétée à plusieurs moments, permettant ainsi une technique de surveillance facile à utiliser et sûre pour les coursde la maladie 15,16. La biopsie liquide est basée sur un phénomène que les cellules tumorales se multiplient rapidement, et simultanément beaucoup d’entre elles subissent l’apoptose et la nécrose. Ceci mène à la libération des débris apoptotiques de cellules dans le sang des patients, avec les fragments d’ADN qui sont coupés à des tailles précises pendant l’apoptose17. L’apoptose des cellules non cancéreuses conduit également à la libération de ses débris cellulaires dans le sang, cependant, le taux d’apoptose dans ces cellules est relativement beaucoup plus faible que les cellules tumorales18. Le rationnel de la technique de biopsie liquide est de capturer les molécules tumeur-associées telles que l’ADN, l’ARN, les protéines, et les cellules de tumeur14,19 qui circulent continuellement dans le sang. Diverses techniques20 peuvent être utilisées pour l’analyse de ces molécules, y compris le séquençage de prochaine génération (NGS), la réaction en chaîne de polymése de gouttelette numérique (DdPCR), le PCR en temps réel et l’essai immunosorbent lié aux enzymes (ELISA). La technique de biopsie liquide permet d’identifier les biomarqueurs qui sont des caractéristiques des cellules tumorales. Ces molécules de biomarqueur ne sont pas seulement libérées des parties spécifiques d’une tumeur, mais plutôt de toutes les parties de latumeur 21. Par conséquent, les marqueurs identifiés dans la biopsie liquide représente le profilage moléculaire d’une tumeur hétérogène entière, en plus d’autres tumeurs dans le corps, ayant ainsi des avantages au-dessus de la technique basée sur la biopsie de tissu22.
Le cfDNA a une courte demi-vie dans le sang circulant allant de quelques minutes à 1-2 heures23. Cependant, le temps court de demi-vie de cfDNA facilite des analyses en temps réel en évaluant la réponse de traitement et les évaluations dynamiques de tumeur. Les niveaux de cfDNA tumeur-dérivés indiquent le pronostic du stade/taille de tumeur démontré par plusieurs études, qui ont montré une relation entre des niveaux de cfDNA et les résultats de survie24. En outre, les études ont prouvé que le cfDNA a une meilleure capacité de prévision que les marqueurs de tumeur existants25. Le pronostic de cfDNA est encore plus prononcé après traitement de cancer, les niveaux plus élevés de cfDNA suivant le traitement corrélé bien avec un taux réduit de survie, et la résistance au traitement. Attendu que les niveaux inférieurs de cfDNA suivant la thérapie correspondent généralement à la réponse positive de traitement. En outre, l’ADNfc facilite la détection précoce de la réponse au traitement que les méthodes de détection traditionnelles.
Le cfDNA augmente la possibilité de détection précoce des mutations associées au cancer : pendant la maladie à un stadeprécoce 15,l’apparition des symptômes26 et avant le diagnostic du cancer jusqu’à 2ans 27. Comme cfDNA est libéré de plusieurs régions tumorales ou foyers, son analyse fournit une vue complète du génome tumoral qu’il représente28. Par conséquent, le cfDNA permet de détecter des mutations somatiques qui auraient pu être manquées dans les échantillons de tissu29. Comme l’hétérogénéité intra-tumorale et les mutations subclonales peuvent être détectées par séquençage profond des régions génomiques couvrant des milliers de bases, d’où l’analyse de la CFDNA permet de découvrir des sous-types moléculaires spécifiques avec des signatures génomiques distinctes13. Pour obtenir un niveau similaire d’information par l’échantillon de tissu beaucoup de biopsies pleines aurait été nécessaire.
En outre, les niveaux de cfDNA dans les patients présentant une maladie localisée telle que le cancer du côlon, de l’ovaire, et du poumon après un traitement chirurgical et/ou une chimiothérapie, ont démontré pour être un marqueur pronostique puissant pour la répétition de cancer et les résultats detraitement 20. En outre, dans les patients présentant le cancer du côlon, du sein, et du poumon, les analyses de cfDNA du sang pourraient avec succès détecter les changements tumeur-spécifiques, qui ont mené à la prévision précise de répétition plusieurs mois àl’avance 13. En outre, les marqueurs de résistance au traitement, tels que les mutations KRAS chez les patients atteints de CRC recevant une thérapie anti-EGFR30; VAFs pour des gènes tels que PIK3CA, MED1 ou EGFR chez les patients atteints de cancer du sein après le traitement avec diverses thérapies31; et la mutation de résistance d’EGFR T790M dans les patients de cancer du poumon traités avec EGFR-ciblés TKIs32 peut également être identifiée par l’analyse de cfDNA.
En résumé, l’analyse cfDNA peut être utilisée pour identifier des biomarqueurs précis dans le domaine de l’oncologie13,33. Dans ce protocole, des échantillons de sang de 3 patients de glioma et de 3 contrôles sains ont été traités pour obtenir l’ADN génomique des WBCs et cfDNA du plasma. Dans le cancer de gliome, les mutations dans IDH, TERT, ATRX, EGFR, et TP53 sert de marqueurs diagnostiques aussi bien que pronostiques qui peuvent aider dans le diagnostic tôt des tumeurs de glioma, classant différents types de tumeurs de glioma, guidant le traitement précis pour le patient individuel et comprenant la réponsede traitement 34,35. L’état mutationnel de ces gènes peut être identifié à l’aide de cfDNA dérivé du sang. Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole détaillé de cfDNA plasma-dérivé qui a été employé pour étudier des changements mutationnels dans le cancer de gliome12. Un tel protocole de biopsie liquide basé sur cfDNA expliqué dans cet article peut être employé pour étudier des changements mutationnels dans beaucoup d’autres types de cancers. En outre, une étude récente a montré que la biopsie liquide à base de cfDNA peut détecter 50 différents types de cancers36.
La collecte, l’entreposage et l’expédition d’échantillons de sang sont des étapes cruciales de ce protocole, car la température incontrôlée pendant ces étapes provoque la lyse desWBCs, conduisant à la libération de l’ADN génomique du WBC dans le plasma et causant la contamination de l’échantillon cfDNA, qui affecte le reste de laprocédure 37. L’hémolyse due à une température incontrôlée peut nuire aux processus de préparation de l’échantillon en aval de cfDNA, tels que les étapesPCR 38. Le sérum contient une proportion élevée de germline cfDNA plutôt que de plasma, bien qu’il présente un grand bruit de fond pour cfDNA39 tumeur-associé. Par conséquent, pour isoler cfDNA tumeur-associée, le plasma est un échantillon approprié39. Le sang prélevé dans un tube anticoagulant contenant du sang doit être centrifugé immédiatement ou dans un délai de deux heures, afin de séparer le plasma et d’éviter la contamination par l’ADNfc. Dans ce protocole, des tubes commerciaux dédiés de collecte de sang de conservation de cfDNA sont employés (voir tableau des matériaux),qui sont une alternative à l’anticoagulant contenant des tubes de collecte de sang. Ces tubes dédiés à la collecte de sang préservent l’ADNfc et l’ARNfc, et empêchent la lyse des CCB jusqu’à 30 jours à température ambiante, et jusqu’à 8 jours à 37 °C. Cela facilite le maintien de la température appropriée lors d’une expédition d’échantillons de sang et jusqu’à ce que le plasma et wbc sontséparés 40.
Il existe actuellement trois types de méthodologies d’extraction cfDNA : l’isolement de phase, la colonne de spin à base de membrane de silicium et l’isolement magnétique à basede perles 41. La méthode de colonne de spin à base de silicium-membrane a donné une grande quantité de cfDNA avec l’intégrité élevée comparée à d’autres méthodes d’extraction de cfDNA42.
L’évaluation quantitative de l’ADN est une exigence fondamentale dans la biopsie liquide, il est nécessaire de développer une procédure simple, abordable et standardisée pour leur mise en œuvre facile et leur utilisation à grande échelle. Trois méthodes couramment utilisées pour la quantification de cfDNA sont spectrophotométriques, fluorimétriques, et qPCR. La méthode fluorimétrique s’avère meilleure que les autres méthodes concernant l’exactitude, le coût et la facilité de conducttion43.
L’intégrité et la pureté de la cfDNA peuvent être estimées soit par électrophoresis agarose ou électrophoresis capillaire. L’électrophoresis d’Agarose ne montre ni sensibilité à la faible concentration de cfDNA ni à haute résolution pour montrer la taille précise de fragment de cfDNA. D’autre part, l’électrophorèse capillaire a un avantage sur l’électrophoresis agarose en surmontant les défis associés et, par conséquent, largement utilisé par les chercheurs pour l’analyse de la taille des fragments cfDNA. Dans ce protocole, la distribution de la taille des fragments de cfDNA isolé a été estimée à l’aide d’un instrument automatisé d’électrophoresis capillaire (voir tableau des matériaux).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Clip for Priming Station</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5042-1398</td>
			<td>Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes</td>
			<td>Norgen Biotek Corp.</td>
			<td>63950</td>
			<td>Norgen&#39;s cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Priming Station</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5065-4401</td>
			<td>Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit&#8212; used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Cleaner Kit</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for Gel Matrix</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>185-5990</td>
			<td>Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Basic Chip Vortex</td>
			<td>IKA-Werke GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>MS-3-S36</td>
			<td>Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740952.5</td>
			<td>With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells 
			(e.g., bacteria), and many other sources.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp circulating nucleic acid kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td>The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac Connecting System</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19419</td>
			<td>In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Qubit assay tubes are 500 &#181;L thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/&#181;L to 100 ng/&#181;L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>84010</td>
			<td>used for vacuum processing of QIAGEN columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crushed ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (96&#8211;100%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block or similar at 56 &#176;C (capable of holding 2 ml collection tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (100%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (adjustable)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients

L’identification des mutations dans les tumeurs des patients cancéraux est une étape très importante dans la gestion de la maladie. Ces mutations servent de biomarqueurs pour le diagnostic tumoral ainsi que pour la sélection du traitement et sa réponse chez les patients atteints de cancer. La méthode actuelle d’étalon-or pour détecter des mutations de tumeur implique un essai génétique de l’ADN de tumeur au moyen des biopsies de tumeur. Cependant, cette méthode envahissante est difficile à effectuer à plusieurs reprises comme essai de suivi du répertoire mutationnel de tumeur. La biopsie liquide est une technique nouvelle et émergente pour détecter les mutations tumorales comme approche de biopsie facile à utiliser et non invasive.
Les cellules cancéreuses se multiplient rapidement. En parallèle, de nombreuses cellules cancéreuses subissent une apoptose. Les débris de ces cellules sont libérés dans le système circulatoire d’un patient, ainsi que des morceaux d’ADN finement fragmentés, appelés fragments d’ADN sans cellules (CFDNA), qui portent des mutations de l’ADN tumoral. Par conséquent, pour identifier les biomarqueurs basés sur cfDNA utilisant la technique liquide de biopsie, des échantillons de sang sont rassemblés des patients cancéraux, suivis de la séparation du plasma et du manteau buffy. Ensuite, le plasma est traité pour l’isolement de cfDNA, et la couche buffy respective est traitée pour l’isolement de l’ADN génomique d’un patient. Les deux échantillons d’acide nucléique sont ensuite vérifiés pour leur quantité et leur qualité; et analysé pour les mutations à l’aide de techniques de séquençage de prochaine génération (NGS).
Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole détaillé pour la biopsie liquide, y compris la collecte de sang, le plasma, et la séparation buffy de manteau, l’extraction de cfDNA et d’ADN de germline, la quantification de cfDNA ou d’ADN de germline, et l’analyse d’enrichissement de fragment de cfDNA.

Séparation plasmatique Le sang de 8,5-9 mL recueilli dans les tubes de conservation cfDNA ou cfRNA donne environ ~4 mL de plasma en volume. Le volume de plasma séparé du sang recueilli dans les tubes EDTA peut varier en fonction de la température. L’exposition de tubes EDTA contenant du sang à une température supérieure à 37 °C entraîne une diminution du volume plasmatiquede rendement 44.
Résultats de l’analyse fluoromètre</st...

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Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Dans cet article nous présentons un protocole détaillé pour la technique non invasive de biopsie liquide, y compris la collecte de sang, la séparation de manteau de plasma et de buffy, l’extraction de cfDNA et d’ADN de germline, la quantification de cfDNA ou d’ADN de germline, et l’analyse d’enrichissement de fragment de cfDNA.

Détection de l’ADN sans cellules dans les échantillons de plasma sanguin des patients atteints de cancer

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Liquid biopsy using cell-free DNA may identify tumor mutations and fusions to potentially diagnose the tumor type and its drug response. In contrast to tissue biopsy, cell-free DNA based liquid biopsy offers a non-invasive approach that can be performed multiple times to monitor cancer disease progression. To isolate circulating cell-free DNA from a patient plasma sample, add 100 microliters of Proteinase K and 800 microliters of lysis buffer supplemented with one microgram of carrier RNA to one milliliter of patient plasma.Thoroughly pulse vortex the solution for 30 seconds before incubating for 30 minutes at 60 degrees Celsius. At the end of the incubation, add 1.8 milliliters of binding buffer to the tube and thoroughly mix with 15 to 30 seconds of pulse vortexing. After a five minute incubation on ice, insert a silica membrane column into a vacuum apparatus connected to a vacuum pump and firmly insert a 20 milliliter tube extender into the open column to prevent sample leakage.At the end of the incubation, carefully pour the mixture into the tube extender and switch on the vacuum pump. When all of the lysate has completely run through the columns, switch off the vacuum pump, release the pressure to zero millibars and carefully discard the tube extender without contaminating the adjacent columns. Transfer the column into a collection tube for centrifugation to remove any residual lysate.After discarding the flow-through, add 600 microliters of wash buffer 1 to the column for a second centrifugation. After discarding the flow-through, centrifuge the column again with 750 microliters of wash buffer 2. After discarding the flow-through, add 750 microliters of 96 to 100%ethanol to the column for an additional centrifugation.Transfer the column into a new two milliliter collection tube for another centrifugation before placing the membrane column assembly into a new two milliliter collection tube at 56 degrees Celsius for 10 minutes. At the end of the incubation, transfer the column into a new 1.5 milliliter elution tube and add 50 microliters of elution buffer to the column for a three minute incubation at room temperature. Then, centrifuge the recovered solution for one minute at 20, 000 times G to elute the nucleic acids.To analyze the size of the DNA fragments, first secure the base plate to the chip priming station and adjust the clip at the lowest position. Place a new high sensitivity DNA chip onto the chip priming station and add nine microliters of gel dye mix to the bottom of the G chip well. Position the plunger at one milliliter and close the chip priming station.Close the lock of the latch until it clicks, set the timer to 60 seconds, and press down the plunger until it is held by the clip. After exactly 60 seconds, use the clip release mechanism to release the plunger. When the plunger retreats to at least the 300 microliter mark, wait for five seconds before slowly retracting the plunger to the one milliliter position.Open the chip priming station to remove nine microliters of the gel dye mix and transfer the gel to the bottom of the high sensitivity DNA chip G well. To load the DNA marker, dispense five microliters of DNA marker into the ladder well and to the 11 sample wells. To load the ladder and samples, add one microliter of the DNA ladder to the DNA ladder well, one microliter of sample to the used sample wells and one microliter of marker to the unused sample wells.Place the high sensitivity DNA chip horizontally in the adapter for 60 seconds of vortexing at 2, 400 revolutions per minute, taking care that the bulge that fixes the high sensitivity DNA chip is not damaged. After vortexing, confirm that the electrode cartridge is properly inserted and that the chip selector is positioned to double stranded high sensitivity DNA. Carefully mount the high sensitivity DNA chip into the receptacle and confirm that the electrode cartridge is fit exactly into the wells of the chip before closing the lid.The fragment analyzer software screen will display a chip icon to indicate that the chip has been inserted and the lid has been closed. To initiate the analysis, open the assay menu and select the double stranded DNA high sensitivity assay. Enter the sample names into the table and click start to initiate the chip run.At the end of the run, immediately remove and discard the chip according to good laboratory practice. Here are the expected cell-free DNA bioanalyzer graph from a representative glioma patient in which cell-free DNA fragments are enriched at 166 base pairs and there is no genomic DNA contamination in the sample can be observed. Here, the same fragment enrichment graph can be observed after next generation sequencing library preparation of the cell-free DNA.Note the fragment enrichment shift from 166 to 291 base pairs due to the attachment of 125 base pair indexes and adapters. For this second representative patient, a very slight enrichment of the cell-free DNA fragments can be observed. Despite the low cell-free DNA concentration, the addition of next generation sequencing adapters to the cell-free DNA and PCR amplification leads to a visible cell-free DNA library peak on the fragment enrichment graph, indicating that the library was prepared successfully from this low concentration cell-free DNA sample.For this third representative patient, the cell-free DNA fragments peaked near 166 base pairs, but genomic DNA contamination was also apparent near the 10, 380 base pair reference ladder peak. Plasma sample lysis is a crucial step in this protocol, as incomplete lysis will affect the cell-free DNA yield and the entire downstream process.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Cell-gratuit Analyse d&#39;intégrité de l&#39;ADN dans des échantillons d&#39;urine

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Sérum et Plasma copie numéro détection par PCR en temps réel

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Avec 22 3 anticorps Anti-PD-L1 se concentrent sur la biopsie et cytologie échantillons provenant de patients atteints de Cancer de poumon Non à petites cellules

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Méthodes permettant d’évaluer le rôle de c-Fos et Dusp1 dans la dépendance de l’oncogène

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Détection d’un Panel de micro-ARN Custom circulant chez les Patients atteints de Cancer Colorectal métastatique

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Évaluation du risque et de la prévalence du cancer colorectal par détection de l’intégrité de l’ADN des selles

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Analyse cytométrique de flux des espèces réactives d'oxygène mitochondrial dans les cellules hématopoïétiques de tige et de progéniture de Murine et la leucémie entraînée mLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Détection et surveillance de l'ADN circulant associé à la tumeur dans les biofluides des patients

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Simple and Fast Rolling Circle Amplification-Based Detection of Topoisomerase 1 Activity in Crude Biological Samples

Détection simple et rapide de l’activité de la topoisomérase 1 basée sur l’amplification du cercle roulant dans des échantillons biologiques bruts

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, ...

Diagnostic du lymphome vitréo-rétinien à l’aide de l’ADN acellulaire

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser le diagnostic de la VRL à l’aide de l’extraction d’ADN acellulaire de l’humeur vitrée 

Extraction d’ADN acellulaire d’échantillons d’humeur vitréenne et aqueuse pour le diagnostic et la surveillance du lymphome vitréo-rétinien

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...