Name: detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients
Uploaded: 2020-09-09T13:30:00
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Os autores gostariam de agradecer aos membros do Laboratório de Genômica do Câncer e Biocomumia de Doenças Complexas por seus agudos insumos observacionais e sua participação em múltiplas discussões em diferentes etapas deste projeto. O apoio ao financiamento inclui a Israel Cancer Association (bolsa ICA para m.F-M 2017-2019) e a bolsa Kamin da Israel Innovation Authority (para m.F-M.).

Antes da coleta de sangue, é necessário o consentimento informado dos sujeitos participantes da pesquisa e deve ser obtido. A pesquisa descrita neste manuscrito foi realizada de acordo com o Rabin Medical Center, o Comitê de Ética de Israel (código de ética: 0039-17-RMC) e a Faculdade de Medicina Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, comitê de ética da Alemanha (código de ética: D 405/14).
1. Coleta e armazenamento de amostras de sangue em tubos de conservante cfDNA ou cfRNA</p...

A coleta de sangue de um paciente em um tubo, embarque e armazenamento são etapas iniciais cruciais na biópsia líquida. O manuseio inadequado pode prejudicar a qualidade do plasma e, portanto, pode interferir nos resultados da biópsia líquida47. Se uma amostra de sangue for coletada em um tubo sanguíneo EDTA, o plasma deve ser separado dentro de duas horas de coleta de sangue para evitar a lise dos WBCs e liberar seu DNA genômico no plasma48. Os WBCs também podem so...

Os avanços tecnológicos levaram ao sequenciamento de centenas de genomas cancerígenos e transcritos1. Isso contribuiu para a compreensão das paisagens das mudanças moleculares em diferentes tipos de câncer2. Outros estudos sobre essas paisagens ajudaram a caracterizar as alterações sommáticas sequenciais e as fusões gene-gene3 que estão envolvidas na progressão do câncer ou tumor, interrompendo seriamente as vias de apoptose4. Portanto, mutações somáticas e fusões gene-gene podem fornecer informações sobre tumores servindo como biomarcadores em pacientes individuais para um determinado tumor tipo5, identificando o prognóstico de tumores primários existentes6,categorizando tumores secundários baseados em alterações moleculares7e identificando alvos tumorais drogados8. Essas informações podem facilitar na seleção do tratamento personalizado para pacientes com câncer e na determinação de respostas positivas e negativas ao tratamento9. No entanto, a obtenção de material tumoral para identificação de perfil genômico do tecido tumoral é um procedimento invasivo10. Além disso, uma biópsia tumoral compreende apenas uma pequena parte de um tumor heterogêneo; e pode, portanto, não ser representativo para o perfil molecular de todo o tumor11. O monitoramento serial e a genotipagem tumoral requerem uma coleta repetida de tecidos tumorais, o que, geralmente, não é viável devido à invasão do procedimento de biópsia tumoral e às questões de segurança decorrentes desses procedimentos12.
A técnica de biópsia líquida, por outro lado, ganhou uma tremenda atenção na oncologia de precisão na última década13,14. Deve-se principalmente à não invasiva dessa técnica, e à possibilidade de ser repetida em vários momentos, possibilitando assim uma técnica de monitoramento fácil de usar e segura para os cursos da doença15,16. A biópsia líquida é baseada em um fenômeno que as células tumorais se multiplicam rapidamente, e simultaneamente muitas delas sofrem apoptose e necrose. Isso leva à liberação de detritos celulares apoptóticos no sangue dos pacientes, juntamente com os fragmentos de DNA que são cortados em tamanhos precisos durante a apoptose17. A apoptose de células não cancerosas também leva à liberação de seus detritos celulares no sangue, no entanto, a taxa de apoptose nessas células é relativamente muito menor do que as células tumorais18. O racional da técnica de biópsia líquida é capturar moléculas associadas ao tumor, como DNA, RNA, proteínas e células tumorais14,19 que circulam continuamente no sangue. Várias técnicas20 podem ser usadas para a análise dessas moléculas, incluindo Sequenciamento de Próxima Geração (NGS), reação em cadeia de polimerase de gotícula digital (ddPCR), PCR em tempo real e ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA). A técnica de biópsia líquida permite identificar biomarcadores que são características das células tumorais. Essas moléculas biomarcadores não são apenas liberadas de partes específicas de um tumor, mas sim de todas as partes do tumor21. Assim, os marcadores identificados na biópsia líquida representam o perfil molecular de todo um tumor heterogêneo, além de outros tumores no corpo, tendo vantagens sobre a técnica baseada em biópsiatecidual 22.
O cfDNA tem um curto tempo de meia-vida no sangue circulante que varia de alguns minutos a 1-2 horas23. No entanto, o curto tempo de meia-vida do CFDNA facilita análises em tempo real, avaliando a resposta ao tratamento e avaliações dinâmicas do tumor. Os níveis de CFDNA derivados do tumor indicam prognóstico do estágio/tamanho do tumor evidenciado por diversos estudos, que mostraram relação entre os níveis de CFDNA e os desfechos de sobrevivência24. Além disso, estudos comprovaram que o CFDNA tem uma melhor capacidade de previsão do que os marcadores tumorais existentes25. O prognóstico do CFDNA é ainda mais acentuado após o tratamento do câncer, níveis mais elevados de CFDNA após o tratamento correlaciona-se bem com uma taxa reduzida de sobrevivência e resistência ao tratamento. Considerando que os níveis mais baixos de CFDNA após a terapia geralmente correspondem à resposta positiva ao tratamento. Além disso, o CFDNA facilita a detecção precoce da resposta ao tratamento do que os métodos tradicionais de detecção.
O CFDNA aumenta a possibilidade de detecção precoce de mutações associadas ao câncer: durante a doença em estágio inicial15, o aparecimento dos sintomas26 e antes do diagnóstico de câncer até 2 anos27. Como o CFDNA é liberado de múltiplas regiões tumorais ou focos, sua análise fornece uma visão abrangente do genoma tumoral que representa28. Portanto, o CFDNA permite detectar mutações somáticas que podem ter sido perdidas nas amostras de tecido29. Como a heterogeneidade intra-tumoral e mutações subclonais podem ser detectadas pelo sequenciamento profundo de regiões genômicas que abrangem milhares de bases, daí a análise do CFDNA permite descobrir subtipos moleculares específicos com assinaturas genômicas distintas13. Para obter um nível semelhante de informação através da amostra de tecido muitas biópsias sólidas teriam sido necessárias.
Além disso, os níveis de CFDNA em pacientes com uma doença localizada, como câncer de cólon, ovário e pulmão após tratamento cirúrgico e/ou quimioterapia, demonstraram ser um poderoso marcador prognóstico para a recidiva do câncer e os resultados do tratamento20. Além disso, em pacientes com câncer de cólon, mama e pulmão, análises de CFNA do sangue puderam detectar com sucesso as alterações específicas do tumor, o que levou à previsão precisa de recidiva com vários meses de antecedência13. Além disso, os marcadores de resistência ao tratamento, como mutações kras em pacientes com CRC recebendo terapia anti-EGFR30; VAFs para genes como PIK3CA, MED1 ou EGFR em pacientes com câncer de mama após o tratamento com várias terapias31; e a mutação de resistência EGFR T790M em pacientes com câncer de pulmão tratada com TKIs32 direcionados ao EGFR também podem ser identificadas pela análise de CFDNA.
Em resumo, a análise cfDNA pode ser utilizada para identificar biomarcadores precisos no campo da oncologia13,33. Neste protocolo, amostras de sangue de 3 pacientes com glioma e 3 controles saudáveis foram processadas para obter DNA genômico de WBCs e CFDNA do plasma. No câncer de glioma, mutações em IDH, TERT, ATRX, EGFR e TP53 servem como diagnóstico, bem como marcadores prognósticos que podem ajudar no diagnóstico precoce de tumores glioma, classificando diferentes tipos de tumores de glioma, orientando o tratamento preciso para o paciente individual e entendendo a resposta ao tratamento34,35. O status mutacional desses genes pode ser identificado usando cfDNA derivado do sangue. Neste manuscrito, apresentamos um protocolo detalhado de CFDNA derivado do plasma que tem sido usado para estudar alterações mutacionais no câncer de glioma12. Esse protocolo de biópsia líquida baseado em CFDNA explicado neste artigo pode ser usado para estudar alterações mutacionais em muitos outros tipos de câncer. Além disso, um estudo recente mostrou que a biópsia líquida baseada em CFDNA pode detectar 50 tipos diferentes decânceres 36.
A coleta, o armazenamento e o envio de amostras de sangue são etapas cruciais neste protocolo, pois a temperatura descontrolada durante essas etapas causa lise dos WBCs, levando à liberação de DNA genômico do WBC no plasma e causando contaminação da amostra de CFDNA, que afeta o resto do procedimento37. A hemólise devido à temperatura descontrolada pode prejudicar os processos de preparação da amostra a jusante do CFDNA, como as etapas38do PCR . O soro contém uma alta proporção de cfDNA germinal em vez de plasma, embora apresente um grande ruído de fundo para cfDNA39associada ao tumor . Portanto, para isolar o CFDNA associado ao tumor, o plasma é uma amostra adequada39. O sangue extraído em um anticoagulante contendo tubo de coleta de sangue deve ser centrifutor imediatamente ou dentro de até duas horas, para separar o plasma e evitar a contaminação por CFDNA. Neste protocolo são utilizados tubos comerciais dedicados de coleta de sangue cfDNA (ver Tabela de Materiais),que são uma alternativa ao anticoagulante contendo tubos de coleta de sangue. Estes tubos dedicados de coleta de sangue preservam cfDNA e cfRNA, e previne a lise de WBCs por até 30 dias a temperatura ambiente, e até 8 dias a 37 °C. Isso facilita a manutenção da temperatura apropriada durante um carregamento de amostras de sangue e até que o plasma e o WBC sejam separados40.
Existem três tipos de metodologias de extração de CFDNA atualmente disponíveis: isolamento de fase, coluna de spin baseada em membrana de silício e isolamento à base de contasmagnéticas 41. O método da coluna spin baseada em membrana de silício rendeu uma alta quantidade de cfDNA com alta integridade em comparação com outros métodos de extração de CFDNA42.
A avaliação quantitativa do DNA é um requisito fundamental na biópsia líquida, há a necessidade de desenvolver um procedimento simples, acessível e padronizado para sua fácil implementação e amplo uso. Três métodos comumente utilizados para quantificação de CFDNA são espectrofotométrico, fluorimétrico e qPCR. O método fluorimétrico é comprovado melhor em relação aos outros métodos relativos à precisão, custo e facilidade de condução43.
A integridade e pureza do CFDNA podem ser estimadas por eletroforese agarose ou eletroforese capilar. A eletroforese agarose não mostra sensibilidade na baixa concentração de CFDNA nem tem alta resolução para mostrar o tamanho preciso do fragmento de cfDNA. Por outro lado, a eletroforese capilar tem uma vantagem sobre a eletroforese agarose, superando os desafios associados e, portanto, amplamente utilizada pelos pesquisadores para a análise do tamanho do fragmento de CFDNA. Neste protocolo, a distribuição do tamanho do fragmento do CFDNA isolado foi estimada utilizando um instrumento automatizado de eletroforese capilar (ver Tabela de Materiais).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Clip for Priming Station</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5042-1398</td>
			<td>Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes</td>
			<td>Norgen Biotek Corp.</td>
			<td>63950</td>
			<td>Norgen&#39;s cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Priming Station</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5065-4401</td>
			<td>Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit&#8212; used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Cleaner Kit</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for Gel Matrix</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>185-5990</td>
			<td>Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Basic Chip Vortex</td>
			<td>IKA-Werke GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>MS-3-S36</td>
			<td>Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740952.5</td>
			<td>With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells 
			(e.g., bacteria), and many other sources.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp circulating nucleic acid kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td>The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac Connecting System</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19419</td>
			<td>In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Qubit assay tubes are 500 &#181;L thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/&#181;L to 100 ng/&#181;L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>84010</td>
			<td>used for vacuum processing of QIAGEN columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crushed ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (96&#8211;100%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block or similar at 56 &#176;C (capable of holding 2 ml collection tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (100%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (adjustable)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients

Identificar mutações em tumores de pacientes com câncer é um passo muito importante no manejo da doença. Essas mutações servem como biomarcadores para o diagnóstico de tumor, bem como para a seleção do tratamento e sua resposta em pacientes com câncer. O método padrão-ouro atual para detectar mutações tumorais envolve um teste genético do DNA tumoral por meio de biópsias tumorais. No entanto, este método invasivo é difícil de ser realizado repetidamente como um teste de acompanhamento do repertório mutacional tumoral. A biópsia líquida é uma técnica nova e emergente para detectar mutações tumorais como uma abordagem de biópsia fácil de usar e não invasiva.
As células cancerígenas se multiplicam rapidamente. Paralelamente, inúmeras células cancerígenas sofrem apoptose. Detritos dessas células são liberados no sistema circulatório de um paciente, juntamente com pedaços de DNA finamente fragmentados, chamados fragmentos de DNA livre de células (CFDNA), que carregam mutações de DNA tumoral. Portanto, para identificar biomarcadores à base de CFDNA utilizando a técnica de biópsia líquida, amostras de sangue são coletadas dos pacientes com câncer, seguidas pela separação de plasma e casaco buffy. Em seguida, o plasma é processado para o isolamento do CFDNA, e o respectivo casaco buffy é processado para o isolamento do DNA genômico de um paciente. Ambas as amostras de ácido nucleico são então verificadas quanto à sua quantidade e qualidade; e analisado para mutações usando técnicas de sequenciamento de última geração (NGS).
Neste manuscrito, apresentamos um protocolo detalhado para biópsia líquida, incluindo coleta de sangue, plasma e separação de casacos buffy, extração de DNA cfDNA e germinal, quantificação de DNA cfDNA ou germinal, e análise de enriquecimento de fragmentos cfDNA.

Separação plasmática O sangue de 8,5-9 mL coletado em tubos de conservação cfDNA ou cfRNA produz cerca de ~4 mL de plasma em volume. O volume de plasma separado do sangue coletado nos tubos EDTA pode variar dependendo da temperatura. A exposição de tubos EDTA contendo sangue a uma temperatura superior a 37 °C leva à diminuição do volume de plasma44.
Resultados do ensaio do ensaio do fluorômetro a concentração de CFDN...

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Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Neste artigo apresentamos um protocolo detalhado para a técnica de biópsia líquida não invasiva, incluindo coleta de sangue, separação de plasma e casaco buffy, extração de DNA cfDNA e germinal, quantificação de DNA cfDNA ou germinal, e análise de enriquecimento de fragmentos cfDNA.

Detecção de DNA livre de células em amostras de plasma de sangue de pacientes com câncer

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Análise integridade do DNA de células-Free em amostras de urina

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Pesquisa do câncer

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Soro e Plasma cópia número deteção usando PCR em tempo real

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Usando 22 3 anticorpo Anti-PD-L1 concentrar-se na biópsia e citologia amostras de pacientes de câncer de pulmão não-pequenas células

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Métodos para avaliar o papel de c-Fos e Dusp1 em dependência do Oncogene

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Deteção de um painel personalizado de MicroRNA circulantes em pacientes com câncer colorretal metastático

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Avaliação do Risco e Prevalência de Câncer Colorretal por Detecção de Integridade do DNA das fezes

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Simple and Fast Rolling Circle Amplification-Based Detection of Topoisomerase 1 Activity in Crude Biological Samples

Detecção Simples e Rápida de Amplificação por Círculo de Rolamento da Atividade da Topoisomerase 1 em Amostras Biológicas Brutas

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, ...

Diagnosis of Vitreoretinal Lymphoma Using Cell-Free DNA

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Advancing VRL Diagnosis Using Cell-Free DNA Extraction from Vitreous Humor (Video) | JoVE

Extração de DNA livre de células de espécimes de humor vítreo e aquoso para diagnóstico e monitoramento de linfoma vitreorretiniano

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...