Name: detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients
Uploaded: 2020-09-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить членов Лаборатории геномики рака и биокомпутирования сложных заболеваний за их активный наблюдательный вклад и участие в многочисленных дискуссиях на различных этапах этого проекта. Поддержка финансирования включает в себя Израильскую ассоциацию рака (грант ICA на M.F-M 2017-2019) и грант Камина Израильского инновационного управления (для M.F-M.).

Перед сбором крови требуется информированное согласие субъектов, участвующих в исследовании, которые должны быть получены. Исследование, описанное в этой рукописи, было проведено в соответствии с медицинским центром Рабина, Комитетом по этике Израиля (этический кодекс: 0039-17-RMC) и медиц?...

Сбор крови пациента в трубке, отгрузка и хранение являются важными первоначальными шагами в жидкой биопсии. Неправильное обращение может ухудшить качество плазмы и, следовательно, может помешать результатам жидкой биопсии47. Если образец крови собран в трубке крови ЭДТА, п...

Технологические достижения привели к секвенированию сотен геномов рака и транскриптомов1. Это способствовало пониманию ландшафтов молекулярных изменений в различных типах рака2. Дальнейшие исследования этих ландшафтов помогли охарактеризовать последовательные соматические изменения игенно-генные слияния 3, которые участвуют в раке или прогрессировании опухоли, последовательно нарушая пути апоптоза4. Таким образом, соматические мутации и генно-генные синтезы могут предоставить информацию об опухолях, выступая в качестве биомаркеров у отдельныхпациентов для конкретного типа опухоли 5, выявление существующих первичныхпрогнозов опухоли 6, классификация вторичных опухолей наоснове молекулярных изменений 7, и выявление наркотических целейопухоли 8. Такая информация может способствовать выбору персонализированного лечения онкологических больных и в определении положительных и отрицательных ответов налечение 9. Однако получение опухолевого материала для выявления геномного профилирования опухолевой ткани является инвазивнойпроцедурой 10. Кроме того, биопсия опухоли состоит лишь из небольшой части неоднородной опухоли; и, следовательно, не может быть репрезентативным для молекулярного профиля всей опухоли11. Серийный мониторинг и генотипирование опухоли требуют повторного сбора опухолевых тканей, что, как правило, не представляется возможным из-за инвазивности процедуры биопсии опухоли и вопросов безопасности, которые возникают врезультате таких процедур 12.
Техника жидкой биопсии, с другой стороны, получила огромное внимание в точной онкологии за последнеедесятилетие 13,14. Это в основном из-за неинвазивности этого метода, и возможность его повторения в нескольких точках времени, тем самым позволяя простой в использовании и безопасный метод мониторинга длякурсов болезни 15,16. Биопсия жидкости основана на явлении, что опухолевые клетки размножаются быстро, и одновременно многие из них проходят апоптоз и некроз. Это приводит к высвобождению апоптотических клеточных обломков в кровь пациентов, а также фрагменты ДНК, которые вырезаны в точных размерах во время апоптоза17. Апоптоз не раковых клеток также приводит к высвобождению его клеточного мусора в кровь, однако, скорость апоптоза в этих клетках относительно намного ниже, чем опухолевыеклетки 18. Рациональным методом жидкой биопсии является захват связанных с опухолью молекул, таких как ДНК, РНК, белки иопухолевые клетки 14,19, которые постоянно циркулируют в крови. Различныеметоды 20 могут быть использованы для анализа этих молекул, включая секвенирование следующего поколения (NGS), цифровую реакцию цепи полимеразы капли (ddPCR), ПЦР в режиме реального времени и связанный с ферментами иммуносорбентный анализ (ELISA). Методика биопсии жидкости позволяет выявлять биомаркеры, которые являются характеристиками опухолевых клеток. Эти молекулы биомаркера высвобождаются не только из определенных частей опухоли, но и из всех частей опухоли21. Таким образом, маркеры, выявленные в жидкой биопсии представляет собой молекулярное профилирование всей неоднородной опухоли, в дополнение к другим опухолям в организме, таким образом, имея преимущества перед биопсией тканей наоснове техники 22.
CfDNA имеет короткий период полу-жизни в циркулирующей крови, начиная от нескольких минут до 1-2 часов23. Тем не менее, короткое время полуиллиард cfDNA облегчает анализы в режиме реального времени путем оценки реакции лечения и динамических оценок опухоли. Опухолевые уровни cfDNA указывают на прогнозирование стадии/размера опухоли, о чем свидетельствует несколько исследований, которые показали связь между уровнями cfDNA и исходамивыживания 24. Кроме того, исследования доказали, что cfDNA имеет лучшую способность прогнозирования, чем существующие маркерыопухоли 25. Прогнозирование cfDNA еще более выраженным после лечения рака, более высокие уровни cfDNA после лечения хорошо коррелирует со снижением скорости выживания, и устойчивость к лечению. Принимая во время, более низкие уровни cfDNA после терапии вообще соответствует с положительной реакцией обработки. Кроме того, cfDNA облегчает раннее выявление ответных мер лечения, чем традиционные методы обнаружения.
cfDNA увеличивает возможность раннего выявления связанных с раком мутаций: во времяранней стадии заболевания 15,появление симптомов 26 и до диагностики рака до 2лет 27. Как cfDNA высвобождается из нескольких областей опухоли или очагов, его анализ обеспечивает всеобъемлющее представление генома опухоли он представляет28. Таким образом, cfDNA позволяет обнаружить соматические мутации, которые, возможно, были пропущены в образцахтканей 29. Поскольку внутриохоуловидная неоднородность и субклональные мутации могут быть обнаружены путем глубокого секвенирования геномных областей, охватывающих тысячи баз, следовательно, анализ cfDNA позволяет выявить конкретные молекулярные подтипы с различными геномнымисигнатурами 13. Для получения аналогичного уровня информации через образец ткани было бы необходимо много твердых биопсий.
Кроме того, уровни cfDNA у пациентов с локализованным заболеванием, таким как толстой кишки, яичников и рака легких после хирургического лечения и / или химиотерапии, показали, что мощный прогностический маркер для рецидива рака ирезультатов лечения 20. Кроме того, у пациентов с раком толстой кишки, молочной железы и легких анализы cfDNA из крови могли успешно обнаружить опухолевые изменения, которые привели к точному прогнозированию рецидива занесколько месяцев до 13. Кроме того, маркеры устойчивости к лечению, такие как мутации KRAS у пациентов с CRC, получающих анти-EGFRтерапию 30; VAFs для генов, таких как PIK3CA, MED1 или EGFR у пациентов с раком молочной железы после лечения с различными методамилечения 31; и EGFR T790M резистентности мутации у больных раком легких лечение EGFR-целевыхTKIs 32 также могут быть определены с помощью анализа cfDNA.
Таким образом, анализ cfDNA может быть использован для выявления точных биомаркеров в областионкологии 13,33. В этом протоколе, образцы крови 3 пациентов глиомы и 3 здоровых контроля были обработаны для получения геномной ДНК из WBCs и cfDNA из плазмы. При раке глиомы мутации в IDH, TERT, ATRX, EGFR и TP53 служат как диагностическими, так и прогностические маркеры, которые могут помочь в ранней диагностике опухолей глиомы, классификации различных типов опухолей глиомы, руководстве точное лечение для отдельного пациента и пониманиереакции лечения 34,35. Мутационный статус этих генов можно определить с помощью с помощью сфДНК, полученной из крови. В этой рукописи мы представляем подробный протокол плазменного cfDNA, который был использован для изучения мутационных изменений в раке глиомы12. Такой протокол жидкой биопсии на основе cfDNA, разъясняясь в этой статье, может быть использован для изучения мутационных изменений во многих других видах рака. Кроме того, недавнее исследование показало, что cfDNA основе жидкой биопсии может обнаружить 50 различных видов рака36.
Сбор образцов крови, хранение и отгрузка являются важными шагами в этом протоколе, так как неконтролируемая температура во время этих шагов вызывает лиз WBCs, что приводит к выпуску геномной ДНК из WBC в плазму и вызывает загрязнение образца cfDNA, который влияет на остальную частьпроцедуры 37. Гемолиз из-за неконтролируемой температуры может ухудшить вниз по течению процессы подготовки образца cfDNA, такие как ПЦРшаги 38. Сыворотка содержит высокую долю зародышевой cfDNA, а не плазмы, хотя она представляет собой большой фоновый шум для опухолевых cfDNA39. Таким образом, для изоляции опухолевых cfDNA, плазма является подходящим образцом39. Кровь, нарисованная в антикоагулянте, содержащем трубку для сбора крови, должна быть центрифугирована немедленно или в течение двух часов, чтобы отделить плазму и избежать загрязнения cfDNA. В этом протоколе используются специальные коммерческие трубки для сбора крови cfDNA (см. таблицу материалов),которые являются альтернативой антикоагулянту, содержащем трубки для сбора крови. Эти выделенные трубки сбора крови сохраняют cfDNA и cfRNA, и предотвращает лиз WBCs на срок до 30 дней при температуре окружающей среды, и до 8 дней при температуре 37 градусов по Цельсию. Это облегчает поддержание соответствующей температуры во время отгрузки образца крови и до тех пор, пока плазма и WBC разделены40.
Есть три типа методов извлечения cfDNA в настоящее время доступны: фазовая изоляция, кремниевая мембрана на основе спина колонки, и магнитной бисером на основеизоляции 41. Силиконовая мембрана на основе спина колонки метод дал большое количество cfDNA с высокой целостностью по сравнению с другими методами извлечения cfDNA42.
Количественная оценка ДНК является одним из основных требований в жидкой биопсии, необходимо разработать простую, доступную и стандартизированную процедуру для их легкой реализации и широкого использования. Три широко используемых метода количественной оценки cfDNA являются спектрофотометрические, флюориметрические и qPCR. Фторметрический метод оказался лучше по отношению к другим методам, касающимся точности, стоимости и простоты проведения43.
Целостность и чистоту cfDNA можно оценить либо по агарозовому электрофорезу, либо по капиллярной электрофорезу. Электрофорез агарозы не показывает чувствительности при низкой концентрации cfDNA и не имеет высокого разрешения, чтобы показать точный размер фрагмента cfDNA. С другой стороны, капиллярный электрофорез имеет преимущество перед электрофорезом агарозы, преодолевая связанные с этим проблемы и, следовательно, широко используемый исследователями для анализа размера фрагмента cfDNA. В этом протоколе распределение размера фрагмента изолированной cfDNA оценивалось с помощью автоматизированного капиллярного электрофореза (см. таблицу материалов).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Clip for Priming Station</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5042-1398</td>
			<td>Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes</td>
			<td>Norgen Biotek Corp.</td>
			<td>63950</td>
			<td>Norgen&#39;s cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Priming Station</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5065-4401</td>
			<td>Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit&#8212; used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Cleaner Kit</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for Gel Matrix</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>185-5990</td>
			<td>Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Basic Chip Vortex</td>
			<td>IKA-Werke GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>MS-3-S36</td>
			<td>Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740952.5</td>
			<td>With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells 
			(e.g., bacteria), and many other sources.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp circulating nucleic acid kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td>The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac Connecting System</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19419</td>
			<td>In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Qubit assay tubes are 500 &#181;L thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/&#181;L to 100 ng/&#181;L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>84010</td>
			<td>used for vacuum processing of QIAGEN columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crushed ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (96&#8211;100%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block or similar at 56 &#176;C (capable of holding 2 ml collection tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (100%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (adjustable)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients

Выявление мутаций в опухолях онкологических больных является очень важным шагом в лечении заболеваний. Эти мутации служат биомаркерами для диагностики опухоли, а также для отбора лечения и его реакции у онкологических больных. Нынешний метод золотого стандарта для обнаружения мутаций опухоли включает в себя генетический тест ДНК опухоли с помощью биопсии опухоли. Тем не менее, этот инвазивный метод трудно выполнить повторно в качестве последующего теста опухолевых мутационных репертуара. Биопсия жидкости является новым и новым методом для обнаружения мутаций опухоли в качестве простого в использовании и неинвазивного подхода к биопсии.
Раковые клетки быстро размножаются. Параллельно многочисленные раковые клетки подвергаются апоптозу. Мусор из этих клеток высвобождается в кровеносную систему пациента, вместе с мелко фрагментированными фрагментами ДНК, называемыми фрагментами ДНК без клеток (cfDNA), которые несут мутации ДНК опухоли. Поэтому для выявления биомаркеров на основе cfDNA с использованием метода жидкой биопсии, образцы крови собираются у онкологических больных, а затем разделение плазмы и баффи пальто. Далее плазма обрабатывается для изоляции cfDNA, и соответствующие баффи пальто обрабатывается для изоляции геномной ДНК пациента. Оба образца нуклеиновой кислоты затем проверяются на их количество и качество; и проанализированы на мутации с использованием методов секвенирования нового поколения (NGS).
В этой рукописи мы представляем подробный протокол для жидкой биопсии, включая сбор крови, плазму и разделение буйного пальто, cfDNA и извлечение ДНК зародышей, количественную оценку ДНК cfDNA или зародышевой линии, а также анализ обогащения фрагментов cfDNA.

Разделение плазмы 8,5-9 мл крови, собранной в cfDNA или cfRNA консервантных трубок дает около 4 мл плазмы в объеме. Объем плазмы, отделенной от крови, собранной в трубках ЭДТА, может варьироваться в зависимости от температуры. Воздействие EDTA трубки, содержащие кровь при температуре вы...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients at JoVE.com

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

В этой статье мы представляем подробный протокол для неинвазивной жидкостной биопсии техники, в том числе сбора крови, плазмы и баффи пальто разделения, cfDNA и зародышевой ДНК извлечения, количественной оценки cfDNA или зародышевой ДНК, и cfDNA анализ обогащения фрагментов.

Обнаружение ДНК без клеток в образцах плазмы крови онкологических больных

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Бесклеточных ДНК Integrity Анализ проб мочи в

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Сыворотки и плазмы скопировать номер обнаружения с помощью ПЦР в реальном времени

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

С помощью 22 c 3 антитела анти PD-L1 сосредоточиться на биопсию и цитологических мазков из больных раком легкого немелкоклеточного

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Методы для оценки роли c-Fos и Dusp1 в зависимости от онкогена

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Обнаружение циркулирующего микроРНК пользовательские группы больных с метастатическим колоректальным раком

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Оценка риска колоректального рака и распространенности по обнаружению целостности ДНК стула

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Поток Цитометрический анализ митохондриальных реактивных видов кислорода в Мурин гематопоитических стволовых и прародителей клеток и MLL-AF9 Driven лейкемии

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Обнаружение и мониторинг опухолев, связанных с циркуляцией ДНК в биожидкости пациентов

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Simple and Fast Rolling Circle Amplification-Based Detection of Topoisomerase 1 Activity in Crude Biological Samples

Простое и быстрое обнаружение активности топоизомеразы 1 в сырых биологических образцах на основе усиления скользящего круга

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, ...

Diagnosis of Vitreoretinal Lymphoma Using Cell-Free DNA

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Advancing VRL Diagnosis Using Cell-Free DNA Extraction from Vitreous Humor (Video) | JoVE

Экстракция внеклеточной ДНК образцов стекловидного тела и водянистой влаги для диагностики и мониторинга витреоретинальной лимфомы

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...