Name: culture and assay of large-scale mixed-stage caenorhabditis elegans populations
Uploaded: 2021-05-05T14:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations at JoVE.com

نشكر أعضاء مختبر أديسون على المناقشات المفيدة والتعليقات على هذه المخطوطة. على وجه الخصوص، ب.M غارسيا. تم توفير بعض السلالات من قبل CGC ، التي يمولها مكتب NIH لبرامج البنية التحتية للأبحاث (P40 OD010440) ، وCeNDR ، التي تمولها NSF Living Collections CSBR 1930382. تم دعم هذا العمل بمنحة من المعاهد القومية للصحة (U2CES030167).

<ol>
	<li>F&#233;lix, M. A., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+history+of+Caenorhabditis+elegans.">The natural history of Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 20 (22), 965-969 (2010).</li><li>Corsi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+behaviour.">The genetics of behaviour.</a> British Medical Bulletin. 29 (3), 269-271 (1973).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).</li><li>Xiong, H., Pears, C., Woollard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+C.+elegans+based+platform+for+toxicity+assessment.">An enhanced C. elegans based platform for toxicity assessment.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9839 (2017).</li><li>Loer, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticle+integrity+and+biogenic+amine+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans+require+the+cofactor+tetrahydrobiopterin+(BH4).">Cuticle integrity and biogenic amine synthesis in Caenorhabditis elegans require the cofactor tetrahydrobiopterin (BH4).</a> Genetics. 200 (1), 237-253 (2015).</li><li>Li, Y., Paik, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+role+for+fatty+acid+biosynthesis+genes+during+molting+and+cuticle+formation+in+Caenorhabditis+elegans.">A potential role for fatty acid biosynthesis genes during molting and cuticle formation in Caenorhabditis elegans.</a> BMB Reports. 44 (4), 285-290 (2011).</li><li>Meli, V. S., Osuna, B., Ruvkun, G., Frand, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLT-10+Defines+a+Family+of+DUF644+and+Proline-rich+Repeat+Proteins+Involved+in+the+Molting+Cycle+of+Caenorhabditis+elegans.">MLT-10 Defines a Family of DUF644 and Proline-rich Repeat Proteins Involved in the Molting Cycle of Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1648-1661 (2010).</li><li>Fritz, J. A., Behm, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUTI-1:+A+novel+tetraspan+protein+involved+in+C.+elegans+CUTicle+formation+and+epithelial+integrity.">CUTI-1: A novel tetraspan protein involved in C. elegans CUTicle formation and epithelial integrity.</a> PloS One. 4 (4), 5117 (2009).</li><li>Golden, J., Riddle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218 (4572), 578-580 (1982).</li><li>Jeong, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+structure+and+biological+activity+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer-inducing+pheromone.">Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone.</a> Nature. 433 (7025), 541-545 (2005).</li><li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans.">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li><li>Kaplan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascaroside+Expression+in+Caenorhabditis+elegans+Is+Strongly+Dependent+on+Diet+and+Developmental+Stage.">Ascaroside Expression in Caenorhabditis elegans Is Strongly Dependent on Diet and Developmental Stage.</a> PLoS One. 6 (3), 17804 (2011).</li><li>Golden, J., Riddle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218 (4572), 578-580 (1982).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Variant+in+the+Neuropeptide+Receptor+npr-1+is+a+Major+Determinant+of+Caenorhabditis+elegans+Growth+and+Physiology.">A Variant in the Neuropeptide Receptor npr-1 is a Major Determinant of Caenorhabditis elegans Growth and Physiology.</a> PLoS Genetics. 10 (2), 1004156 (2014).</li><li>Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+limit+theorem+and+a+strong+mixing+condition.">A central limit theorem and a strong mixing condition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 42 (1), 43-47 (1956).</li><li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+in+developmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans as a model in developmental toxicology.</a> Methods in Molecular Biology. 889, 15-24 (2012).</li><li>Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Beads+Are+a+Versatile+Tool+for+Staging+Caenorhabditis+elegans+in+Different+Life+Histories.">Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories.</a> Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).</li><li>Denver, D. R., Morris, K., Streelman, J. T., Kim, S. K., Lynch, M., Thomas, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+consequences+of+mutation+and+natural+selection+in+Caenorhabditis+elegans.">The transcriptional consequences of mutation and natural selection in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (5), 544-548 (2005).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li><li>Kevin, S., Pulak, R., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Analysis,+Sorting,+and+Dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+Flow-Sorting+System.">Techniques for Analysis, Sorting, and Dispensing of C. elegans on the COPAS Flow-Sorting System.</a> C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+gene+flow+shape+niche-associated+variation+in+pheromone+response.">Selection and gene flow shape niche-associated variation in pheromone response.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 3 (10), 1455-1463 (2019).</li><li>Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeNDR,+the+Caenorhabditis+elegans+natural+diversity+resource.">CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource.</a> Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2016).</li><li>Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Beads+Are+a+Versatile+Tool+for+Staging+Caenorhabditis+elegans+in+Different+Life+Histories.">Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories.</a> Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من السفن باعتبارها LSCP. في هذا البروتوكول، تم استخدام طبق خبز زجاجي قياسي. 11- وكان لمركبات LSPCs المستخدمة أبعاد خارجية تبلغ 35.56 × 20.32 سم وأبعاد داخلية تبلغ 27.94 × 17.78 سم وعمق 4.45 سم تقريبا، وتحتوي على غطاء مجهز. وهكذا ، تم تحسين كمية البكتيريا المستخدمة هنا لLSCP مع الأبعاد المذكورة أعلاه لتسفر عن عدد كبير من الديدان المختلطة المرحلة. يمكن تعديل حجم البكتيريا وتركيزها لتناسب الاحتياجات التجريبية.
التلوث عن طريق العفن والفطريات ، أو غيرها من المصادر البكتيرية يمكن أن تحدث في أي خطوة في طريقة LSCP ، لذلك التعامل مع العينات بعناية. قبل البدء في أي خطوة في البروتوكول، تأكد من تنظيف مساحة العمل بالإيثانول بنسبة 70٪ والتبييض بنسبة 10٪. إذا كان متوفرا، عالج المناطق المستخدمة بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة ثم قم بتشغيل فلتر هواء HEPA لمدة 30 دقيقة قبل البدء في كل خطوة.
من خلال زراعة LSCP في وضع خاضع للرقابة(أي، في غرفة CT المحددة عند 20 درجة مئوية) ، يمكن للمستخدم تتبع نمو العينة بسهولة أكبر وتوثيق التلوث المحتمل. إذا أصبح سطح LSCP ملوثا، فإما قطع التلوث عندما يكون ذلك ممكنا والسماح للعينة بالاستمرار في النمو أو التخلص من العينة إذا لم يكن من الممكن السيطرة على التلوث. ومن الضروري التصدي للتلوث بسرعة للحد من النمو غير المرغوب فيه وضمان عدم تفوقه على الديدان في زيادة الموارد.
والمقصود من هذه الطريقة لأولئك الذين يرغبون في زراعة واسعة النطاق مختلطة السكان الثقافات من C. elegans. على الرغم من أنه قد يكون من الممكن زراعة مجموعات متزامنة من الديدان على LSCP كما فعلت على أطباق بيتري المتاحة تجاريا وفي الثقافة السائلة ، لم يختبر المؤلفون هذا الخيار. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان المستخدمون يرغبون في زراعة أكثر من 2.4 مليون دودة تقريبا في المتوسط في عينة معينة، يوصى باستخدام طريقة مختلفة4. ويعتمد نجاح النمو على الضغط الذي يجري تجهيزه في خط الأنابيب. تمكن المؤلفون من زيادة أعداد ما يقرب من 2.4 مليون دودة بنجاح في خمس نسخ بيولوجية على الأقل من 15 سلالة من سلالات اليجان ، مما يشير إلى أن الطريقة قوية.
قبل بدء التجربة لاحظ أن عمر وصحة دودة معينة يمكن أن تؤثر على البراز ووقت النمو السكاني اللاحق. تأكد من الحفاظ على الديدان في ظروف صحية مع الحد الأدنى من الإجهاد قبل استخدامها في خط الأنابيب هذا. ومن المفترض أن عينات المخزون قد تم إنشاؤها وتجميدها والاحتفاظ بها عند -80 درجة مئوية للحد من الانجراف الوراثي مع مرور الوقت.
اعتمادا على احتياجات تجربة معينة ، يمكن تغيير عدد البالغين الذين يبدأون في LSCP. تغيير عدد البالغين الذين يبدأون gravid على LSCP سيغير معدل النمو وبالتالي الوقت للحصاد. وتستخدم خمسة البالغين gravid لزرع كل LSCP للأسباب التالية: (1) وهناك حاجة إلى طريقة بسيطة وسريعة وفعالة لزرع العديد من سلالات C. elegans على LSCPs في وقت واحد و (2) للحد من الاختلافات العمرية بين البالغين gravid اختار التي يمكن أن تؤدي إلى عدم التجانس النمو.
هذه الطريقة تسمح للمستخدم لحصاد أعداد كبيرة من الديدان مع جميع مراحل دورة الحياة الحالية. مع الأساليب الحالية المتاحة ، وجمع عينات واسعة النطاق من elegans جيم يتطلب تزامن التبييض للحصول على عدد من الديدان المطلوبة للعمل المصب. وبالنظر إلى هذا النهج، يمكن للمرء الآن أن ينمو أكبر عدد ممكن من الديدان في السابق في المخمرات أو الثقافات السائلة على نطاق واسع دون الصعوبات المرتبطة بمزامنة التبييض وخطوات المناولة المتعددة. بروتوكولنا يسمح لأحد لاستهداف سلالات من الاهتمام بكفاءة، واستخدام الحد الأدنى من وقت المناولة في زراعة العينة نفسها، وعزل مراحل من الديدان أو السكان حسب الحاجة في خطوط أنابيب المصب.
تم استخدام LPFC كأداة لتوثيق توزيع السكان وحجمها في LSCP معين. يستخدم LPFC هو نظام تدفق مستمر يقوم بتحليل الديدان وفرزها وتوزيعها استنادا إلى حجمها (TOF) والكثافة البصرية. كما دودة معينة يمر عبر خلية التدفق، وكاشف فقدان الضوء المحوري يلتقط كمية ضوء إشارة سدت بواسطة ليزر حالة 488 نانومتر الصلبة لطول الوقت الذي يستغرقه دودة لتمرير من خلال، وإعطاء المستخدم TOF والكثافة البصرية للدودة. ويمكن أيضا استخدام بصريات وأجهزة الكشف عن جمع الفلورسينس لزيادة حساسية الفلورسينس وجمعها على كل عينة. سوف تختلف معلمات جمع LPFC استنادا إلى الأداة. يمكن للمستخدمين استخدام مجموعة متنوعة من الأنظمة الأساسية لالتقاط حجم الفيروس المتنقل ولا تقتصر على استخدام هذا البروتوكول إذا لم يتوفر LPFC.
يستخدم المؤلفون عينات نمت في الطريقة الموصوفة هنا لتحديد الأيض غير معروف في سلالات مختلفة من C. elegans عبر الكروماتوغرافيا السائلة – قياس الطيف الكتلي, التحليل الطيفي NMR, وتسلسل الحمض النووي الريبي. يخطط المؤلفون لمواصلة استخدام هذه الطريقة لنمو العينات في خط الأنابيب هذا مع مجموعة متنوعة من سلالات C. elegans حيث يمكن معالجة سلالات جديدة من الاهتمام بسهولة باستخدام خط الأنابيب هذا.

C. elegans هو النيماتودا الصغيرة التي تعيش بحرية التي توجد في جميع أنحاء العالم في مجموعة متنوعة من الموائل الطبيعية1. سهولة نسبية للنمو، وسرعة جيل الوقت، ونظام التكاثر، والجسم شفافة تجعل من كائن حي نموذج قوي التي تمت دراستها على نطاق واسع في علم الأحياء التنموية، والشيخوخة، وعلم الأعصاب، وعلم الوراثة2،3. العمل الوفير على C. elegans يجعلها مرشحا رئيسيا لاستخدامها في دراسات الاقتصاد الاقتصادي لربط الأنماط الظاهرية بشكل شامل مع المكونات البيولوجية المعقدة وعلاقاتها في كائن حي معين.
لاستخدام C. elegans في البحوث التعاونية -omics، هناك حاجة إلى طريقة لتوليد مجموعات كبيرة من الحيوانات المختلطة المراحل حيث يمكن تقسيم عينة واحدة واستخدامها عبر منصات وأدوات متنوعة للتحليلات المقارنة. يتطلب إنشاء خط أنابيب لتوليد مثل هذه العينة وعيا شديدا بالنظام الغذائي والبيئة والإجهاد والهيكل السكاني ومناولة العينات وجمعها. ولذلك، من الأهمية بمكان أن تدمج ظروف الاستزراع القياسية والتكرارية في خطوط أنابيب واسعة النطاق. في أبحاث C. elegans ، يتم استخدام طريقتين تقليديتين استزراع الديدان - أطباق أغار بيتري والثقافة السائلة4.
تاريخيا، عندما تكون هناك حاجة إلى كميات كبيرة من elegans C. ، فإنها تزرع في الثقافة السائلة4. تتطلب الخطوات التي ينطوي عليها توليد عدد كبير من الديدان في الثقافة السائلة خطوات مناولة متعددة غالبا ما تشمل مزامنة التبييض لتمزق البشرة البالغة المرقة ، وإطلاق الأجنة لتحقيق حجم السكان المطلوب. ومع ذلك، عند استخدام تزامن التبييض، يعتمد النمو السكاني على بدء حجم التعداد، وبالتالي، يؤثر على النمو اللاحق وأعداد السكان. وبالإضافة إلى ذلك، سلالات C. elegans تختلف في حساسية كتي، والتعرض الوقت، والاستجابة الإجهاد لمزامنة التبييض مما يجعل من الصعب على المقايسة العديد من السلالات في وقت5،6،7،8،9.
بالإضافة إلى ذلك، يتطلب نمو الدودة في زراعة السائل بضع خطوات نقل كما ينصح في كثير من الأحيان لزراعة جيل واحد فقط من الديدان قبل الحصاد لأن الاكتظاظ يمكن أن يحدث بسهولة إذا نمت لأجيال متعددة ويؤدي إلى تشكيل dauer على الرغم من وجود الغذاء10. يحدث تشكيل Dauer من خلال جزيئات الإشارات الصغيرة مثل أسكاروسيدات ، التي غالبا ما يشار إليها باسم "dauer pheromones"11،12،13،14، يتم إطلاقها في الوسائط السائلة وتأثير نمو السكان. وعلاوة على ذلك، يؤدي تزايد أعداد الديدان الكبيرة في الاستزراع السائل إلى تراكم البكتيريا الزائدة في الثقافة، مما يخلق صعوبات عندما تكون هناك حاجة إلى عينة نظيفة لإجراء فحوصات فينوتيبيك المصب. وأخيرا، عندما تصبح ملوثة ثقافة السائل، فمن الصعب الحفاظ على الجراثيم الفطرية أو الخلايا البكتيرية تنتشر بسهولة في جميع أنحاء وسائل الإعلام15.
الطريقة التقليدية الأخرى لزراعة C. elegans على أطباق أغار بيتري. أطباق بيتري المتاحة تجاريا تسمح للمرء أن ينمو بسهولة أجيال متعددة من الديدان المختلطة المراحل دون الآثار السريعة للاكتظاظ وتشكيل dauer عالية كما رأينا في الثقافات السائلة. ومع ذلك ، فإن عيب نمو الدودة على أطباق أجار بيتري التقليدية هو أن أكبر طبق بيتري متاح تجاريا لا ينتج مجموعات كبيرة من الديدان لدراسة -omics دون إضافة في خطوة مزامنة التبييض. وباختصار ، فإن زراعة مجموعات مختلطة من المراحل من C. elegans على أطباق أغار بيتري هي أكثر ملاءمة لجمع بيانات -omics ، لكننا كنا بحاجة إلى طريقة لتوليد أحجام سكانية كبيرة جدا دون زراعة السائل.
هنا، نقدم طريقة للثقافة وجمع مجموعات كبيرة من المراحل المختلطة C. elegans على لوحات ثقافة واسعة النطاق (LSCP). جمع العينات من خلال هذا خط أنابيب تسفر عن عينة كافية لجمع البيانات الظاهري والسكان، جنبا إلى جنب مع أي بيانات اللازمة للتجارب -omics(أي،علم الجينوم، transcriptomics، البروتيوميات، وeabolomics). وبالإضافة إلى ذلك، تتطلب طريقة LSCP الحد الأدنى من التلاعب بالحيوانات، ووقت إعداد أقل للمستخدم، وتوفر رقابة بيئية مشددة، وتضمن أن التعامل مع كل عينة متسق طوال الدراسة من أجل الاستنساخ بشكل عام.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Graduated Cylinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10124-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 Proof Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75804-654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75874-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>05040-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BVC Control G Fluid Aspiration System</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>449709-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3045-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox Bleach</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89414-502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conviron Control Temperature Room</td>
			<td>Conviron</td>
			<td></td>
			<td>https://www.conviron.com/environmental-rooms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89089-866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Scientific Accuspin 3R</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-Bottom 24-Well Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29443-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft.</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>204390560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT115 E. coli (DE3)</td>
			<td>CGC</td>
			<td>HT115(DE3)</td>
			<td>https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470224-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Scale Culture Plate (LSCP)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1090948</td>
			<td>Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C86677-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Plain Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.11727.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Devices ImageXpress</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model Number:IXMConfocal</td>
			<td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin (10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6261-25MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (6 cm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Controller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-4180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0781-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasssium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P250-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Fluroscent Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19507-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>746398-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>111357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Gilson Pipette Set</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10002M, FA10004M, FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin (100mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Union Biometrica COPAS BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td>https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and assay of large-scale mixed-stage caenorhabditis elegans populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans)كان ولا يزال كائنا حيا نموذجيا قيما لدراسة البيولوجيا التنموية والشيخوخة والبيولوجيا العصبية وعلم الوراثة. مجموعة كبيرة من العمل على C. elegans يجعلها مرشحا مثاليا للاندماج في عدد كبير من السكان، والدراسات الحيوانية الكاملة لتشريح المكونات البيولوجية المعقدة وعلاقاتها مع كائن حي آخر. من أجل استخدام C. elegans في البحوث التعاونية - omics ، هناك حاجة إلى طريقة لتوليد مجموعات كبيرة من الحيوانات حيث يمكن تقسيم عينة واحدة واقتسامها عبر منصات متنوعة للتحليلات المقارنة.
هنا، يتم تقديم طريقة لثقافة وجمع وفيرة مختلطة المرحلة C. elegans السكان على لوحة ثقافة واسعة النطاق (LSCP) والبيانات الظاهرية اللاحقة. هذا خط أنابيب تسفر عن أعداد كافية من الحيوانات لجمع البيانات الظاهري والسكان، جنبا إلى جنب مع أي بيانات اللازمة للتجارب -omics (أي الجينوم، transcriptomics، البروتيوميات، وeabolomics). وبالإضافة إلى ذلك، تتطلب طريقة LSCP الحد الأدنى من التلاعب بالحيوانات نفسها، ووقت إعداد أقل للمستخدم، وتوفر رقابة بيئية مشددة، وتضمن أن التعامل مع كل عينة متسق طوال الدراسة من أجل الاستنساخ بشكل عام. وأخيرا، يتم عرض طرق لتوثيق حجم السكان وتوزيع السكان لمراحل حياة C. elegans في LSCP معين.

وينتج عن نمو السيليغانات C. باستخدام طريقة LSCP ما متوسطه حوالي 2.4 مليون دودة مختلطة المراحل لكل عينة على مدى 12.2 يوما. نمو elegans جيم باستخدام طريقة LSCP تمكن المستخدمين لتوليد مجموعات كبيرة مختلطة المرحلة من elegans جيم مع القليل من التعامل مع والتلاعب من الحيوانات ، وهو مثالي لدراسات واسعة النطاق - omics (الشكل 1). بمجرد أن يصبح LSCP مليئا بالديدان البالغة ، ويصل إلى حجم سكاني كبير ، ولديه الحد الأدنى من البكتيريا المتبقية ، يمكن للمستخدمين حصاد وتقدير حجم السكان. ويمكن لهذه النقطة أيضا أن تكون بمثابة مراقبة للجودة من خلال تقييم ما إذا كان السكان كافية لاستخدامها في خط أنابيب -omics (الشكل 2). تعتمد ديناميكيات السكان على السلالة نفسها ، وسلوك السلالة(أي، تميل سلالات التجشؤ إلى انخفاض انتعاش الدودة) ، ونجاح النمو(أيالتلوث). تم اختبار طريقة LSCP على 15 سلالة من اليجانات C. تحتوي على خليط من المسوخ مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) وCaenorhabditis elegans موارد التنوع الطبيعي البرية (CeNDR)سلالات 25. ويرد وصف الأنماط الجينية للسلالات في الجدول التكميلي 3.
وأسفرت طريقة LSCP عن أحجام سكانية تتراوح بين 500 94 و 000 290 9 نسمة تقريبا. وكان متوسط حجم السكان ضمن سلالة مرجعية، PD1074، وعبر سلالات ما يقرب من 2.4 مليون الديدان(الشكل 3). لم توجد فروق كبيرة في أحجام السكان المقدرة بين سلالات اليجانات C. elegans على مدى متوسط 12.2 يوم نمو LSCP (الشكل 4). استغرق PD1074 LSCPs ما بين 10 - 14 يوما للنمو إلى كامل مختلطة المرحلة السكانية. كان متوسط وقت النمو عبر PD1074 10 أيام. نمت السلالة أبطأ نموا لمدة أقصاها 20 يوما، ونما سلالة الأسرع نموا لمدة لا تقل عن 10 أيام(الشكل 4).
ولذلك، باستخدام هذه الطريقة LSCP، يمكن للمستخدمين بسهولة دمج سلالات جديدة من الاهتمام في دراسة مع معرفة قليلة من توقيت التنمية والخبرة الخلفية. لاحظ أن السلالات والأنماط الظاهرية التي يجب الحفاظ عليها عن طريق الانتقاء ، أو عيوب البراز ، أو هي heterozygous ، أو لديها عيوب نمو قد لا تعمل بشكل جيد في خط الأنابيب هذا.
يسمح قياس تدفق الجسيمات الكبيرة وتصوير العينات للمستخدمين بتوثيق توزيع السكان. ويمكن استخدام مجموعة واسعة من المنصات لقياس النمو السكاني الناجح.
بالنسبة لقياسات omics القابلة للتكرار ، من المهم تنمية ثقافات متسقة. مقاييس قابلية إعادة إنتاج الثقافة هي عدد من الديدان وتوزيع حجم ثابت لسلالة معينة. نعرض توزيع العينة للسلالة المرجعية ، PD1074 - وهو متغير من سلالة N2 Bristol الأصلية ، باستخدام صور مجهر LPFC23و26 و micro confocal كوكلاء لنجاح النمو. كما تم قياس الديدان من المرحلة L1 من خلال الكبار gravid على توزيع LPFC (الشكل 5)، والتصوير اللاحق (الشكل 6)، والاختلاف في توزيع السكان عبر العينات (الشكل 7)، يمكننا أن نرى أن هذا خط أنابيب ولدت مجموعة مختلطة من المراحل من C. elegans.
لإلقاء نظرة فاحصة على التوزيع السكاني لعيناتنا المختلطة ، نظرنا إلى توزيع 35 PD1074 LSCPs من خلال النظر في نسبة الديدان التي تقع داخل كل منطقة عبر كامل وقت الرحلة(أيطول الجسم) التوزيع(الشكل 7A ، B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig01.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة على خط أنابيب نمو دودة LSCP. (أ)بمجرد استلامها في المختبر، تم إعداد جميع السلالات وتجميدها للتخزين على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية2. (ب)تم إعداد لوحة "قطعة رئيسية" من مخزون الدودة المجمدة وتخزينها في 15 درجة مئوية لاستخدامها لمدة لا تزيد عن شهر واحد. (ج)مرت كل عينة من خلال أربع خطوات متتالية قطع للحد من الإجهاد الأجيال قبل أن تنمو على LSCP. (D) تم اختيار 5 بالغين gravid الفردية من لوحة "قطعة 4" 6 سم في الخطوة (D) وبقعة ابيض على خمس مناطق معينة من LSCP. (ه) تم وضع LSCP في غرفة درجة حرارة خاضعة للرقابة ونمت في 20 درجة مئوية حتى LSCP كان مليئا الديدان الكبار، وصلت إلى حجم السكان كبيرة، وكان الحد الأدنى من البكتيريا اليسار. (واو)تم حصاد مجموعة الديدان وجمعها لخطوات المصب. (G) تم إنشاء Aliquots من LSCP وكانت فلاش المجمدة للتطبيقات المصب المطلوب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig02.jpg"> الشكل 2: نظرة عامة على حصاد ال LSCP وتقدير حجم السكان. (أ)استخدمت 50 مل من M9 لغسل الديدان من سطح NGMA. تم إدخال تعليق الدودة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. تكررت الخطوة (أ) مرتين. (ب) 15 مل من تعليق دودة سكب في أنبوب مخروطي 15 مل جديدة. الديدان كانت ت حبيبات بواسطة الطرد المركزي. تم يستنشق M9 + الحطام قبالة دون بيليه دودة مزعجة. تكررت الخطوة (ب) حتى تم جمع جميع 150 مل من تعليق الدودة. (ج)تم غسل بيليه الدودة والطرد المركزي ثلاث مرات مع M9 للقضاء على الحطام المتبقي. وبمجرد تنظيف العينة، أعيد إنفاق بيليه الدودة في 10 مل من ddH2O. (D) تم إنشاء تخفيف تسلسلي للعينة لتقدير حجم مجموعة الديدان. تم استخدام عامل (عوامل) التخفيف التي سمحت بالديدان ليتم عدها بدقة. تغير عامل (عوامل) التخفيف المستخدمة اعتمادا على حجم السكان من LSCP. (ه)وبمجرد اختيار عامل (ق) تخفيف، تم الأنابيب جميع الديدان من جميع التكرارات aliquot الثلاثة من هذا التخفيف على شريحة نظيفة والديدان تحت المجهر تشريح. (F)تم تقسيم العينة إلى aliquots الحجم المناسب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig03.jpg"> الشكل 3: تولد طريقة LSCP بمعدل سكاني يبلغ 2.4 مليون دودة مختلطة المراحل. ويسفر البرنامج عن أحجام سكانية في أصغر نمو سكاني يبلغ حوالي 500 94 نسمة، وفي أكبر نمو سكاني يبلغ نحو 000 290 9 نسمة. وكان متوسط حجم السكان في جميع السلالات 2.4 مليون دودة. الحانات تحت C. elegans أسماء سلالة تشير إلى ما إذا كانت سلالة متحولة CGC أو عزل CeNDR الطبيعية. يتم عرض حجم عينة LSCP لكل سلالة. أجريت مقارنات لجميع الأزواج باستخدام اختبار HSD من Tukey. ولم تلاحظ فروق كبيرة بين الأحجام السكانية المقدرة عبر سلالات اليغانات (F(108 14) = 0.7، ص = 0.77). تشير الأشرطة الملونة إلى شاشات الألوان القياسية لتمثيل سلالة C. elegans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig04.jpg"> الشكل 4: ولدت طريقة LSCP مجموعات كبيرة من الديدان المختلطة في 10 - 20 يوما. نمت A C. elegans LSCP حتى كانت العينة مليئة بالديدان البالغة ، ووصلت إلى حجم سكاني كبير ، وكان لديها الحد الأدنى من العشب البكتيري المتبقي. استغرق LSCPs ما بين 10-20 يوما للنمو إلى مجموعة كاملة من المراحل المختلطة ، اعتمادا على الإجهاد. وكان متوسط وقت النمو عبر السلالات 12.2 يوما. يتم عرض حجم عينة LSCP لكل سلالة. تم إنشاء كل شريط خطأ باستخدام انحراف معياري واحد عن الوسط. مستويات غير متصلة بنفس الحرف مختلفة بشكل ملحوظ. مقارنات لجميع الأزواج باستخدام اختبار HSD من Tukey. تم العثور على فرق كبير في مقدار وقت النمو على LSCP اللازمة عبر سلالات C. elegans (F(14,108) = 8.8، ص < 0.0001*). تشير الأشرطة الملونة إلى شاشات الألوان القياسية لتمثيل سلالة C. elegans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2.jpg"> الشكل 5: قياس السكان والنمو المختلط للسلالة المرجعية البرية، PD1074. توزيع LPFC ممثل واحد نمو LSCP من سلالة مرجعية من النوع البري، وهو البديل من سلالة بريستول N2 الأصلي، (PD1074) وثائق توزيع الحجم والحدث من السكان في مرحلة مختلطة. يعرض المحور س طول (وقت الطيران، TOF) من الديدان فرزها. يعرض المحور ص الكثافة البصرية (الانقراض البصري، EXT) من الديدان فرزها. كل نقطة بيانات هو دودة التي تم توثيقها في العينة. يتم عرض كل منطقة TOF التي تم استخدامها لتحليل الصور بلون مختلف. تم إنشاء عشرين منطقة TOF (R2 - R21) تتراوح بين TOF من 50 إلى 2050. ويمكن الاطلاع على تفاصيل كل منطقة من مناطق التكميلية في الجدول 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig06.jpg"> الشكل 6: تظهر صور الديدان التي تم فرزها من مناطق TOF التي تتراوح بين R2 - R12 توزيع LPFC PD1074. في المنطقة R2 ، يمكن تحديد ديدان L1 وفي المنطقة يتم تحديد البالغين الذين يغلب عليهم الجاذبية R9 ، والتي تمتد على النقيضين اليرقات التنموية مما يعطينا مناطق تقريبية ضمن توزيع مقياس التدفق الخلوي حيث من المتوقع مراحل في التوزيع. يمثل شريط المقياس 1 مم. تم التقاط صور تمثيلية من توزيع LPFC المعروض في الشكل 5، وتتوافق المربعات الملونة مع مناطق من الشكل 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig07.jpg"> الشكل 7: التوزيع السكاني عبر مناطق وقت الطيران (TOF) في السلالة المرجعية البرية، PD1074. توزيع الديدان عبر منطقة TOF بأكملها تبين المناطق التي تم العثور فيها على الديدان. يتم تمثيل كل PD1074 LSCP كلون فردي. (أ) يعرض المحور x مناطق TOF العشرين (R2 – R21) التي تمت ملاحظتها وإحصاءها ل LSCP، مع عرض توزيع الحجم بالكامل. يظهر المحور ص النسبة المئوية للديدان من LSCP معينة التي كان حجم الجسم التي سقطت في منطقة TOF معينة. (ب)نظرا لأن جزءا صغيرا من مجموعة الديدان يقع بين مناطق R7-R21، فقد تم أخذ سجل النسبة المئوية للديدان التي تقع داخل كل منطقة لعرض التوزيع السكاني. يعرض المحور x مناطق التواف R7-R21. يعرض المحور ص سجل النسبة المئوية من الديدان من LSCP معين الذي كان حجم الجسم الذي سقط في منطقة TOF معينة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig07large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الشكل التكميلي 1: متوسط درجة الحرارة اليومية (°C) لظروف النمو التي تم بموجبها زراعة LSCP والتعامل معها. تم توثيق درجات الحرارة المبلغ عنها لغرفة درجة الحرارة الخاضعة للرقابة (CT) وجمعها على مدار فترة الستة أشهر من نمو العينة وجمعها. يتم الإبلاغ عن متوسط درجة الحرارة اليومية هنا. لم تلاحظ اختلافات كبيرة بين درجة الحرارة التي نما فيها LCSP خلال مدة المشروع (F(5,24) = 2.59، p = 0.0524). وقد امتد الفرق في درجة الحرارة بأكمله إلى ما لا يزيد عن 0.003 درجة مئوية طوال فترة الستة أشهر من نمو العينة وتوليدها. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453supfig01.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.</a>
الجدول التكميلي 1: المناطق المسورة TOF المستخدمة لفرز الديدان إلى لوحات 384 بئر للتصوير. تم إنشاء المناطق Binned لتمتد TOF من 100 في جميع أنحاء توزيع TOF من 50-2050. يمكن تغيير المناطق المسورة وتحسينها لتناسب احتياجاتك. يتم عرض كل منطقة TOF التي تم استخدامها لتحليل الصور بلون مختلف. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table1_FINAL.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
الجدول التكميلي 2: قالب لوحة 384 جيدا من مناطق TOF وتكرار التخطيط. تم فرز كل عينة إلى لوحة من 384 بئرا للتصوير. تم إنشاء أربع نسخ متماثلة لكل منطقة محددة للفرز. يمكن تغيير المناطق المسورة وتحسينها لتناسب احتياجاتك. راجع الجدول التكميلي 1 لمناطق محددة مسور تم إنشاؤها واستخدامها في هذا البروتوكول. يتم عرض كل منطقة TOF التي تم استخدامها لتحليل الصور بلون مختلف. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table2_FINAL.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
الجدول التكميلي 3: تحتوي سلالات اليغانات C. المستخدمة في هذا البروتوكول على خليط من سلالات CGC و CeNDR. ويرد وصف للسلالة والنمط الجيني ومصدر السلالة والتفاصيل في هذا الجدول. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table3_FINAL.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations at JoVE.com

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

لاستخدام الإليغانات Caenorhabditis (C. elegans)في أبحاث omics ، هناك حاجة إلى طريقة لتوليد مجموعات كبيرة من الديدان حيث يمكن قياس عينة واحدة عبر منصات للتحليلات المقارنة. هنا، يتم تقديم طريقة لثقافة السكان C. elegans على لوحات الثقافة على نطاق واسع (LSCPs) وتوثيق النمو السكاني.

الثقافة و المقايسة من السكان على نطاق واسع Caenorhabditis النخبوية المختلطة

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

هذه التقنية تسمح لنا بجمع مجموعات واسعة النطاق من الديدان لاستخدامها في منصات omics متعددة مع الحد الأدنى من التلاعب. هذه التقنية تسمح لنا بجمع مجموعات C.elegans المرحلة المختلطة عبر تجارب omics متعددة للحصول على صورة شاملة لكل عينة. للتبييض بقعة من البالغين gravid على لوحات الثقافة على نطاق واسع، لهب اختيار دودة على الموقد بونسن واستخدام اختيار لغرف E.coli الطازجة من حافة العشب البكتيري على لوحة ثقافة واسعة النطاق.اختيار شخص بالغ واحد gravid من لوحة قطعة الرابعة للتبييض بقعة وإضافة خمسة ميكرولترات من محلول الهيبوكلوريت القلوية المعدة حديثا في زاوية واحدة من لوحة ثقافة واسعة النطاق بعيدا عن حديقة E.coli. وضع الكبار gravid في محلول الهيبوكلوريت القلوية والاستفادة من النيماتودا لتعطيل الجلد والإفراج عن البيض. عندما يتم وضع ما مجموعه خمسة بالغين بالتساوي حول حديقة الإشريكية القولونية بنفس الطريقة ، ضع الغطاء مرة أخرى على اللوحة.لحصاد عينات من لوحات الثقافة على نطاق واسع، صب 50 ملليلتر من محلول M9 على سطح لوحة ثقافة واحدة على نطاق واسع ودوامة لوحة لضمان أن M9 يغطي كامل سطح النماتودا نمو المتوسطة agarose. رئيس ماصة المصلية العقيمة مع M9 وإمالة لوحة بحيث تجمع السكان M9 ودودة في زاوية واحدة من لوحة. استخدام ماصة تستعد لترطيب تعليق دودة وإضافة الديدان إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.ضع الأنبوب على الروك لتعطيل أي كتل بكتيرية والحطام. عندما يتم جمع جميع الديدان من جميع الصفائح الثلاث ، نقل 15 ملليلتر من الديدان من كل أنبوب إلى كل من ثلاثة أنابيب مخروطية 15 ملليلتر والرواسب الديدان في الأنابيب عن طريق الطرد المركزي. يستنشق بعناية الشعيرات الفائقة دون إزعاج الكريات دودة وإضافة 13 ملليلتر من تعليق دودة إلى كل أنبوب.عكس الأنابيب لإعادة إنفاق الكريات وغسل أكبر قدر ممكن من البكتيريا والحطام والطرد المركزي الديدان مرة أخرى. عندما يتم جمع كل مجموعة دودة كاملة ، اغسل الكريات الدودة ثلاث مرات في 10 ملليلتر من محلول M9 الطازج لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، أعيد إنفاق كل بيليه دودة نظيفة في 10 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج.لتقدير حجم السكان، تمييع بسرعة ثلاثة 100 ميكرولتر aliquots من عينة دودة من كل أنبوب في 900 ميكرولتر من محلول M9 لكل عينة واستخدام aliquots لجعل التخفيفات التسلسلية. وضع تعليق عينة دودة الأسهم على الروك للحركة المستمرة للثقافات في حين يجري عد aliquots وخلط تخفيف دودة حتى تكون متجانسة. إضافة خمسة ميكرولترات من الحل من أول عينة دودة إلى 10 إلى شريحة المجهر الزجاجي وإحصاء الديدان عن طريق المجهر الخفيف.إذا كان هناك أقل من 50 دودة في العينة، عد تخفيفات 1:100 و 1:1، 000. إذا كان هناك أكثر من 50 دودة، انتقل إلى التخفيف التسلسلي التالي. بعد عد كل تكرار aliquot من كل تخفيف ثلاث مرات ، متوسط عدد التخفيف لتحديد حجم السكان المقدر للدودة.ثم تقسيم عينات دودة في aliquots التجريبية المناسبة وفلاش تجميد العينات في النيتروجين السائل للتخزين ناقص 80 درجة مئوية. لإعداد عينة دودة لقياس الخلايا تدفق الجسيمات الكبيرة، تمييع ما يقرب من خمس مرات 10 إلى المرحلة الرابعة المختلطة دودة aliquot إلى حجم نهائي من 10 ملليلتر من محلول M9 وإضافة 200 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر E.coli و 1:50 تمييع 0.5 ميكرومولار الأحمر الفلورسنت حل ميكروفلورسنت لتعليق الدودة. بعد احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز، وجمع الديدان وmicrospheres عن طريق الطرد المركزي وغسل الديدان مرتين مع محلول M9 الطازجة لإزالة أي البكتيريا الزائدة وmicrospheres غير المغرضة.بعد الغسيل الثاني، أعيد إنفاق بيليه في خمسة ملليلترات من محلول M9. إذا كانت بيليه تبدو نظيفة، إضافة خمسة ملليلتر من M9 تكملها مع 50 ميليمولار الصوديوم azide إلى الديدان ووضع الأنبوب على الروك لتصويب والقتل الرحيم على حد سواء الديدان لعد دقيق والتحجيم. بالنسبة لتوثيق توزيع السكان، افتح قالب اللوحة 384 جيدا والمعايرة وعين القالب لتوزيع 20 جسما مسورا في أربعة آبار للحصول على أربع نسخ متماثلة تقنية لكل منطقة مسورة لكل منطقة من مناطق البار العشرين للعينة.قم بتحميل عينة من الديدان مقدارها 40 ملليلتر على مقياس تدفق الجسيمات الكبير والبدء في فرز العينة تلقائيا مع تحريك العينة باستمرار لمنع التسوية والاستغناء عن الكائنات في نفس الوقت من العينة في لوحة 384-well معايرة. وبمجرد فرز العينة بأكملها والاستغناء عن الحد الأقصى لعدد المناطق المسورة في لوحة 384 بئرا، قم بإزالة العينة من مقياس الخلايا وتنظيف الجهاز. تم اختبار طريقة لوحة الثقافة على نطاق واسع على 15 سلالة من C.Elegans ، بما في ذلك مزيج من المسوخ مركز علم الوراثة Caenorhabditis وسلالات Caenorhabditis elegans الطبيعية التنوع الموارد البرية.في هذا التحليل، أسفرت طريقة لوحة الثقافة على نطاق واسع عن أحجام سكانية من حوالي 94 و500 إلى 9 و290 و000. وكان متوسط حجم السكان ضمن السلالة المرجعية PD1074 وعبر السلالات حوالي 2.4 مليون دودة. لم توجد اختلافات كبيرة في أحجام السكان المقدرة بين سلالات C.elegans على مدار ما متوسطه 12.2 يوم نمو لوحات الثقافة على نطاق واسع.استغرق PD1074 لوحات الثقافة على نطاق واسع بين 10 إلى 14 يوما للنمو إلى مرحلة مختلطة كاملة من السكان مع متوسط وقت النمو من 12.2 يوما. ونمت أبطأ سلالة نموا لمدة أقصاها 20 يوما ونمت السلالة الأسرع نموا لمدة لا تقل عن 10 أيام. في توزيع العينة هذا ل PD1074 ، تم قياس الديدان من مرحلة L1 من خلال البالغين gravid على مقياس تدفق الجسيمات الكبيرة.وكشف التصوير والتصور اللاحقان للاختلافات في توزيع السكان عبر العينات أن خط الأنابيب ولد مجموعة مختلطة من ال C.elegans. من المهم عد الديدان بدقة في جميع أنحاء مجموعة العينات حتى تحصل على بيانات قابلة للمقارنة عبر النمو والدراسات. يمكن تطبيق نهج الجمع هذا على تسلسل الحمض النووي الريبي وعلم الجينوم وتحليلات علم الاقتصادات الأخرى لتوسيع فهمنا للديناميكيات المعقدة التي تحدث داخل مجموعات C.elegans.تسمح لنا هذه التقنية بجمع مجموعات C.elegans المختلطة عبر تجارب omics متعددة للحصول على صورة شاملة لكل عينة.

Research

JoVE Journal

Genetics

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

مراقبة المكانية الفصل في استعمار سطح الميكروبية السكان

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

بروتوكول عالمي جرنة على نطاق واسع "الإنتاج مكتبة" من أي "مصدر الحمض النووي"

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

ايليجانس كاينورهابديتيس السلكية-نموذج تنوعاً في فيفو لدراسة التفاعلات بين الميكروبات والمضيف

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

التلاعب في بلويدي في ايليجانس كاينورهابديتيس

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

طريقة تعيين النسخة متماثلة: نهج الفائق "قياس كمي" ايليجانس كاينورهابديتيس عمر

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Heuristic Mining of Hierarchical Genotypes and Accessory Genome Loci in Bacterial Populations

التعدين الإرشادي للأنماط الجينية الهرمية ومواقع الجينوم الملحقة في المجموعات البكتيرية

Routine and systematic use of bacterial whole-genome sequencing (WGS) is enhancing the accuracy and resolution of epidemiological investigations carried ...

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

قياس حساسية Caenorhabditis elegans لمستقبلات الأسيتيل كولين ناهض ليفاميزول

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

طرق المسح منخفضة التكلفة لقياس العمر الافتراضي والمدى الصحي في Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

قياس الصلاحية الجنينية وحجم الحضنة في Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

تحليل الوراثة اللاجينية عبر الأجيال في C. elegans باستخدام مراسل الفلورسنت والترسيب المناعي للكروماتين (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...