Name: culture and assay of large-scale mixed-stage caenorhabditis elegans populations
Uploaded: 2021-05-05T14:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations at JoVE.com

Vi takker medlemmer af Edison Lab for nyttige diskussioner og feedback på dette manuskript; især B.M. Garcia. Nogle stammer blev leveret af CGC, som er finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), og CeNDR, som er finansieret af NSF Living Collections CSBR 1930382. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra NIH (U2CES030167).

<ol>
	<li>F&#233;lix, M. A., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+history+of+Caenorhabditis+elegans.">The natural history of Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 20 (22), 965-969 (2010).</li><li>Corsi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+behaviour.">The genetics of behaviour.</a> British Medical Bulletin. 29 (3), 269-271 (1973).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).</li><li>Xiong, H., Pears, C., Woollard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+C.+elegans+based+platform+for+toxicity+assessment.">An enhanced C. elegans based platform for toxicity assessment.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9839 (2017).</li><li>Loer, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticle+integrity+and+biogenic+amine+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans+require+the+cofactor+tetrahydrobiopterin+(BH4).">Cuticle integrity and biogenic amine synthesis in Caenorhabditis elegans require the cofactor tetrahydrobiopterin (BH4).</a> Genetics. 200 (1), 237-253 (2015).</li><li>Li, Y., Paik, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+role+for+fatty+acid+biosynthesis+genes+during+molting+and+cuticle+formation+in+Caenorhabditis+elegans.">A potential role for fatty acid biosynthesis genes during molting and cuticle formation in Caenorhabditis elegans.</a> BMB Reports. 44 (4), 285-290 (2011).</li><li>Meli, V. S., Osuna, B., Ruvkun, G., Frand, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLT-10+Defines+a+Family+of+DUF644+and+Proline-rich+Repeat+Proteins+Involved+in+the+Molting+Cycle+of+Caenorhabditis+elegans.">MLT-10 Defines a Family of DUF644 and Proline-rich Repeat Proteins Involved in the Molting Cycle of Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1648-1661 (2010).</li><li>Fritz, J. A., Behm, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUTI-1:+A+novel+tetraspan+protein+involved+in+C.+elegans+CUTicle+formation+and+epithelial+integrity.">CUTI-1: A novel tetraspan protein involved in C. elegans CUTicle formation and epithelial integrity.</a> PloS One. 4 (4), 5117 (2009).</li><li>Golden, J., Riddle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218 (4572), 578-580 (1982).</li><li>Jeong, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+structure+and+biological+activity+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer-inducing+pheromone.">Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone.</a> Nature. 433 (7025), 541-545 (2005).</li><li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans.">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li><li>Kaplan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascaroside+Expression+in+Caenorhabditis+elegans+Is+Strongly+Dependent+on+Diet+and+Developmental+Stage.">Ascaroside Expression in Caenorhabditis elegans Is Strongly Dependent on Diet and Developmental Stage.</a> PLoS One. 6 (3), 17804 (2011).</li><li>Golden, J., Riddle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218 (4572), 578-580 (1982).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Variant+in+the+Neuropeptide+Receptor+npr-1+is+a+Major+Determinant+of+Caenorhabditis+elegans+Growth+and+Physiology.">A Variant in the Neuropeptide Receptor npr-1 is a Major Determinant of Caenorhabditis elegans Growth and Physiology.</a> PLoS Genetics. 10 (2), 1004156 (2014).</li><li>Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+limit+theorem+and+a+strong+mixing+condition.">A central limit theorem and a strong mixing condition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 42 (1), 43-47 (1956).</li><li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+in+developmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans as a model in developmental toxicology.</a> Methods in Molecular Biology. 889, 15-24 (2012).</li><li>Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Beads+Are+a+Versatile+Tool+for+Staging+Caenorhabditis+elegans+in+Different+Life+Histories.">Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories.</a> Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).</li><li>Denver, D. R., Morris, K., Streelman, J. T., Kim, S. K., Lynch, M., Thomas, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+consequences+of+mutation+and+natural+selection+in+Caenorhabditis+elegans.">The transcriptional consequences of mutation and natural selection in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (5), 544-548 (2005).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li><li>Kevin, S., Pulak, R., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Analysis,+Sorting,+and+Dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+Flow-Sorting+System.">Techniques for Analysis, Sorting, and Dispensing of C. elegans on the COPAS Flow-Sorting System.</a> C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+gene+flow+shape+niche-associated+variation+in+pheromone+response.">Selection and gene flow shape niche-associated variation in pheromone response.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 3 (10), 1455-1463 (2019).</li><li>Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeNDR,+the+Caenorhabditis+elegans+natural+diversity+resource.">CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource.</a> Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2016).</li><li>Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Beads+Are+a+Versatile+Tool+for+Staging+Caenorhabditis+elegans+in+Different+Life+Histories.">Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories.</a> Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

En række fartøjer kan bruges som LSCP. I denne protokol blev der brugt en standard glasbageplade. De LSC'er, der var i brug, havde ydre dimensioner på 35,56 x 20,32 cm, indvendige dimensioner på 27,94 x 17,78 cm og ca. 4,45 cm dybe og kom med et monteret låg. Således er mængden af bakterier, der anvendes her, blevet optimeret til et LSCP med ovenstående dimensioner for at give en stor population af orme i blandet fase. Bakteriel volumen og koncentration kan justeres, så de passer til forsøgsbehovene.
Forurening med skimmel, svampe eller andre bakterielle kilder kan forekomme på ethvert trin i LSCP-metoden, så håndter prøver med omhu. Før du starter et trin i protokollen, skal du sikre dig, at arbejdsområdet rengøres med 70% ethanol og 10% blegemiddel. Hvis det er muligt, behandle brugte områder med UV-lys i 30 min og tænde en HEPA luftfilter 30 min før du starter hvert trin.
Ved at dyrke LSCP i kontrollerede omgivelser (dvs.i et CT-rum, der er indstillet til 20 °C), kan brugeren lettere spore prøvens vækst og dokumentere potentiel kontaminering. Hvis LSCP's overflade bliver forurenet, skal forureningen enten udskæres, når det er muligt, og prøven fortsætte med at vokse eller kassere prøven, hvis kontamineringen ikke er mulig at kontrollere. Det er bydende nødvendigt at håndtere forurening hurtigt for at reducere uønsket vækst og for at sikre, at det ikke udkonkurrerer orme for ressourcer.
Denne metode er beregnet til dem, der ønsker at dyrke store blandede befolkningskulturer i C. elegans. Selv om det kan være muligt at dyrke synkroniserede populationer af orme på LSCP som gjort på kommercielt tilgængelige Petri retter og i flydende kultur, har forfatterne ikke testet denne mulighed. Hvis brugerne desuden ønsker at dyrke mere end ca. 2,4 millioner orme i gennemsnit i en given prøve, anbefales en anden metode4. Vækstsucces afhænger af den belastning, der behandles i pipelinen. Forfatterne var i stand til at vokse populationer på ca. 2,4 millioner orme i mindst fem biologiske replikater af 15 C. elegans stammer, hvilket indikerer, at metoden er robust.
Før eksperimentet påbegyndes, skal du bemærke, at en given orms alder og sundhed kan påvirke fecundity og efterfølgende befolkningstilvæksttid. Sørg for, at orme opretholdes under sunde forhold med minimal stress, før de bruges i denne rørledning. Det antages, at der er skabt, frosset og opbevaret lagerprøver ved -80 °C for at reducere den genetiske afdrift over tid.
Afhængigt af behovene i et givet eksperiment kan antallet af begyndende gravide voksne på et LSCP ændres. Ændring af antallet af begyndende gravide voksne på LSCP vil ændre vækstraten og dermed tid til at høste. Fem gravide voksne er vant til frø hver LSCP af følgende grunde: (1) En enkel, hurtig og effektiv måde at frø mange C. elegans stammer på LSCPs på én gang var nødvendig, og (2) for at reducere aldersforskellene blandt de gravide voksne plukket, der kan føre til vækst heterogenitet.
Denne metode giver brugeren mulighed for at høste store populationer af orme med alle livscyklusstadier til stede. Med de nuværende metoder til rådighed, indsamling af store prøver af C. elegans kræver blegemiddel synkronisering for at opnå det antal orme ønskede for downstream arbejde. I betragtning af denne tilgang kan man nu dyrke så mange orme som tidligere muligt i fermenteringsmaskiner eller store flydende kulturer uden vanskeligheder forbundet med blegemiddelsynkronisering og flere håndteringstrin. Vores protokol gør det muligt at målrette interessestammer effektivt, bruge minimal håndteringstid til at dyrke selve prøven og isolere stadier af orme eller befolkningen efter behov i downstream-rørledninger.
En LPFC blev brugt som et værktøj til at dokumentere befolkningsfordelingen og størrelsen i et givet LSCP. Den anvendte LPFC er et kontinuerligt flowsystem, der analyserer, sorterer og dispenserer orme baseret på deres størrelse (TOF) og optisk tæthed. Som en given orm passerer gennem flowcellen, opfanger den aksiale lystabsdetektor mængden af signallys, der er blokeret af en 488 nm solid state laser i den tid, det tager en orm at passere igennem, hvilket giver brugeren tof og optisk tæthed af ormen. Fluorescens indsamling optik og detektorer kan også bruges til at maksimere fluorescens følsomhed og indsamling på hver prøve. LPFC-indsamlingsparametrene varierer afhængigt af instrumentet. Brugere kan anvende en række forskellige platforme til at registrere ormens størrelse og er ikke begrænset til at bruge denne protokol, hvis en LPFC ikke er tilgængelig.
Forfatterne bruger prøver dyrket i den metode, der er beskrevet her for at identificere ukendte metabolitter i forskellige stammer af C. elegans via Flydende kromatografi – Massespektrometri, NMR-spektroskopi og RNA-sekventering. Forfatterne planlægger at fortsætte med at bruge denne metode til vækst af prøver i denne rørledning med en række C. elegans stammer som nye stammer af interesse let kan behandles ved hjælp af denne rørledning.

C. elegans er en lille fritlevende nematode, der findes over hele verden i en række naturlige levesteder1. Dens relative lethed af vækst, hurtig generationstid, reproduktionssystem og gennemsigtig krop gør det til en stærk modelorganisme, der er blevet bredt undersøgt i udviklingsbiologi, aldring, neurobiologi og genetik2,3. Det rigelige arbejde med C. elegans gør det til en oplagt kandidat til at bruge i-omics undersøgelser til omfattende link fænotyper med komplekse biologiske komponenter og deres relationer i en given organisme.
For at kunne anvende C. elegans i forskningssamarbejde er der behov for en metode til at generere store populationer af dyr i blandede faser, hvor en enkelt prøve kan opdeles og anvendes på tværs af forskellige platforme og instrumenter til sammenlignende analyser. Oprettelse af en rørledning til at generere en sådan prøve kræver stor bevidsthed om kost, miljø, stress, befolkningsstruktur, og prøve håndtering og indsamling. Derfor er det afgørende at have standard- og reproducerbare dyrkningsforhold integreret i store rørledninger. I C. elegans forskning, to traditionelle metoder bruges til at dyrke orme - agar Petri retter og flydende kultur4.
Historisk set, når der er behov for store mængder C. elegans, dyrkes de i flydende kultur4. De skridt, der er involveret i at generere en stor population af orme i flydende kultur kræver flere håndtering trin, der ofte omfatter blegemiddel synkronisering til brud gravid voksne neglebånd, frigive embryoner for at opnå den ønskede befolkning størrelse. Men når blegemiddel synkronisering anvendes, befolkningstilvæksten er afhængig af start folketælling størrelse og dermed virkninger efterfølgende vækst og befolkningstal. Derudover varierer C. elegans-stammer i deres neglebåndsfølsomhed, eksponeringstid og stressrespons på blegemiddelsynkronisering, hvilket gør det vanskeligt at analysere mange stammer ad gangen5,6,7,8,9.
Derudover kræver ormvækst i flydende kultur et par overførselstrin, da det ofte anbefales at dyrke kun en generation af orme før høst, fordi overbelægning let kan forekomme, hvis den dyrkes i flere generationer og fører til dauerdannelse på trods af tilstedeværelsen af mad10. Dauer dannelse sker gennem små signalering molekyler såsom ascarosider, ofte benævnt "dauer feromoner"11,12,13,14, frigives i flydende medier og virkning væksten af befolkningen. Desuden fører voksende store ormpopulationer i flydende kultur til overskydende bakterieakkumulering i kulturen, hvilket skaber vanskeligheder, når der er behov for en ren prøve til downstream-fænotypiske assays. Endelig, når en flydende kultur bliver forurenet, er det vanskeligere at opretholde som svampesporer eller bakterieceller let spredes i hele medierne15.
Den anden traditionelle metode til dyrkning af C. elegans er på agar Petri retter. Kommercielt tilgængelige Petri retter giver en mulighed for nemt at dyrke flere generationer af blandet fase orme uden de hurtige virkninger af overbelægning og høj dauer dannelse som set i flydende kulturer. Men en ulempe ved orm vækst på traditionelle agar Petri retter er, at den største kommercielt tilgængelige Petri parabol ikke giver store orm befolkninger for en-omics undersøgelse uden at tilføje i en blegemiddel synkronisering trin. Sammenfattende er dyrkning af blandede stadier af C. elegans på agar Petri retter mere egnet til indsamling af -omics data, men vi krævede en metode til at generere meget store befolkningsstørrelser uden flydende dyrkning.
Her præsenterer vi en metode til kultur og samler store blandede C. elegans populationer på store kulturplader (LSCP). Indsamling af prøver gennem denne rørledning giver tilstrækkelig prøve til at indsamle fænotypiske data og befolkningsdata sammen med alle data, der er nødvendige for -omics-eksperimenter (dvs.genomik, transskriptionomics, proteomics og metabolomics). Desuden kræver LSCP-metoden minimal manipulation af dyrene, mindre brugerforberedelsestid, giver en stram miljøkontrol og sikrer, at håndteringen af hver prøve er konsistent under hele undersøgelsen for generel reproducerbarhed.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Graduated Cylinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10124-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 Proof Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75804-654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75874-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>05040-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BVC Control G Fluid Aspiration System</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>449709-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3045-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox Bleach</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89414-502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conviron Control Temperature Room</td>
			<td>Conviron</td>
			<td></td>
			<td>https://www.conviron.com/environmental-rooms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89089-866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Scientific Accuspin 3R</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-Bottom 24-Well Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29443-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft.</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>204390560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT115 E. coli (DE3)</td>
			<td>CGC</td>
			<td>HT115(DE3)</td>
			<td>https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470224-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Scale Culture Plate (LSCP)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1090948</td>
			<td>Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C86677-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Plain Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.11727.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Devices ImageXpress</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model Number:IXMConfocal</td>
			<td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin (10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6261-25MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (6 cm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Controller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-4180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0781-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasssium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P250-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Fluroscent Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19507-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>746398-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>111357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Gilson Pipette Set</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10002M, FA10004M, FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin (100mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Union Biometrica COPAS BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td>https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and assay of large-scale mixed-stage caenorhabditis elegans populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) har været og er fortsat en værdifuld model organisme til at studere udviklingsbiologi, aldring, neurobiologi og genetik. Den store mængde arbejde på C. elegans gør det til en ideel kandidat til at integrere sig i store, hele dyreforsøg for at dissekere de komplekse biologiske komponenter og deres forhold til en anden organisme. For at kunne anvende C. elegans i forskningssamarbejde er der behov for en metode til at generere store populationer af dyr, hvor en enkelt prøve kan opdeles og analyseres på tværs af forskellige platforme til sammenlignende analyser.
Her præsenteres en metode til kultur og indsamling af en rigelig blandet fase C. elegans befolkning på en storstilet kulturplade (LSCP) og efterfølgende fænotypiske data. Denne rørledning giver et tilstrækkeligt antal dyr til at indsamle fænotypiske data og befolkningsdata sammen med alle data, der er nødvendige for -omics-forsøg (dvs. genomik, transskriptionomics, proteomics og metabolomics). Desuden kræver LSCP-metoden minimal manipulation af dyrene selv, mindre brugerforberedelsestid, giver en stram miljøkontrol og sikrer, at håndteringen af hver prøve er konsistent under hele forsøget for generel reproducerbarhed. Endelig præsenteres metoder til at dokumentere befolkningsstørrelse og befolkningsfordeling af C. elegans livsstadier i et givet LSCP.

Væksten i C. elegans ved hjælp af LSCP-metoden giver i gennemsnit ca. 2,4 millioner orme i blandet fase pr. prøve over 12,2 dage. Væksten i C. elegans ved hjælp af LSCP-metoden giver brugerne mulighed for at generere store blandede populationer af C. elegans med ringe håndtering og manipulation af dyrene, hvilket er ideelt til store -omiske undersøgelser (Figur 1). Når en LSCP er blevet fuld af voksne orme, nåede en stor befolkning størrelse, og har minimal bakterier tilbage, kan brugerne høste og estimere befolkningens størrelse. Dette punkt kan også tjene som kvalitetskontrol ved at vurdere, om befolkningen er tilstrækkelig til at kunne bruges i en "omics pipeline" (figur 2). Populationsdynamikken er afhængig af selve stammen, belastningens opførsel (dvs.gravende stammer havde en tendens til at have lavere ormgendannelse) og vækstsucces(dvs.forurening). LSCP-metoden blev testet på 15 stammer af C. elegans, der indeholder en blanding af Caenorhabditis Genetics Center (CGC) mutanter og Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource (CeNDR) vilde stammer25. Stammegenotyper er beskrevet i supplerende tabel 3.
LSCP-metoden gav befolkningsstørrelser fra ca. 94.500 til 9.290.000. Den gennemsnitlige befolkningsstørrelse inden for referencestammen PD1074 og på tværs af stammer var ca. 2,4 millioner orme (figur 3). Der blev ikke konstateret signifikante forskelle i de anslåede befolkningsstørrelser mellem C. elegans-stammer i løbet af et gennemsnit på 12,2 LSCP-vækstdage (figur 4). PD1074 LSCPs tog mellem 10 - 14 dage at vokse til en fuld blandet fase befolkning. Den gennemsnitlige væksttid på tværs af PD1074 var 10 dage. Den langsomste voksende stamme voksede i højst 20 dage, og den hurtigst voksende stamme voksede i mindst 10 dage (Figur 4).
Derfor kan brugerne ved hjælp af denne LSCP-metode nemt integrere nye interessestammer i en undersøgelse med ringe viden om udviklingsmæssig timing og baggrundsekspertise. Bemærk, at stammer og fænotyper, der skal vedligeholdes ved plukning, har fecundity defekter, er heterozygoa, eller har vækstfejl kan ikke fungere godt i denne pipeline.
Store partikel flow cytometry og billeddannelse af prøver giver brugerne mulighed for at dokumentere befolkningsfordelingen. En bred vifte af platforme kan bruges til at måle vellykket befolkningstilvækst.
For reproducerbare -omics målinger, er det vigtigt at vokse konsekvent kulturer. Målingerne af kultur reproducerbarhed er antallet af orme og en ensartet størrelsesfordeling for en given stamme. Vi viser prøvefordelingen for referencestammen PD1074 – en variant af den oprindelige N2 Bristol-stamme ved hjælp af LPFC23-26 - og mikrokonfokale mikroskopbilleder som proxyer for vækstsucces. Da orme blev målt fra L1-fasen til gravid voksen på LPFC-fordelingen (Figur 5), efterfølgende billeddannelse (Figur 6) og variationen i befolkningsfordelingen på tværs af prøver (Figur 7), kan vi se, at denne rørledning genererede en blandet population af C. elegans.
For at se nærmere på befolkningsfordelingen af vores mixed stage prøver, vi kiggede på fordelingen af 35 PD1074 LSCPs ved at se på den procentdel af orme, der falder inden for hver region på tværs af hele Time of Flight (TOF)(dvs.kropslængde) distribution(Figur 7A, B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig01.jpg"> Figur 1: Oversigt over LSCP-ormens vækstpipeline. (A) Når alle stammer er modtaget i laboratoriet, er de blevet tilberedt og frosset til langtidsopbevaring ved -80 °C2. B) Der er fremstillet en "master chunk"-plade af en frossen ormbestand, som opbevares ved 15 °C, og som højst skal anvendes i en måned. (C) Hver prøve gennemgik fire på hinanden følgende chunking-trin for at reducere generationsstress, før den voksede på LSCP. (D) 5 individuelle gravide voksne blev plukket fra "chunk 4" 6 cm plade i trin (D) og stedet bleget på fem givne områder af LSCP. (E) LSCP'et blev placeret i et kontrolleret temperaturrum og dyrket ved 20 °C, indtil LSCP var fuld af voksne orme, nåede en stor befolkningsstørrelse og havde minimale bakterier tilbage. (F) Ormens befolkning blev høstet og indsamlet til nedstrøms trin. (G)Aliquots blev oprettet fra LSCP og blev flash frosset til downstream ønskede applikationer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig02.jpg"> Figur 2: Oversigt over LSCP-høst og estimering af befolkningsstørrelsen. (A) 50 mL M9 blev brugt til at vaske orme af NGMA-overfladen. Ormeaffjedringen blev pipetteret ind i et 50 mL konisk rør. Trin (A) blev gentaget to gange. (B) 15 mL ormeaffjedring blev hældt i et nyt 15 mL konisk rør. Orme blev pelleted af centrifuging. M9 + vragrester blev suget ud uden at forstyrre orm pellet. Trin (B) blev gentaget, indtil alle 150 mL ormeaffjedring blev indsamlet. (C) Ormen pellet blev vasket og centrifuged tre gange med M9 at fjerne de resterende snavs. Når prøven var ren, blev ormepillen genbrugt i 10 mL ddH2O. (D) Der blev oprettet en seriel fortynding af prøven for at estimere ormens befolkningsstørrelse. Den eller de fortyndingsfaktorer, der gjorde det muligt at tælle orme nøjagtigt, blev anvendt. Den eller de anvendte fortyndingsfaktorer ændrede sig afhængigt af LSCP's befolkningsstørrelse. (E) Når fortyndingsfaktoren eller -faktorerne var valgt, blev alle orme fra alle tre aliquot-replikater af denne fortynding pipetteret på et rent dias, og orme blev talt under et dissekerende mikroskop. (F)Prøven blev opdelt i aliquots af passende størrelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig03.jpg"> Figur 3: LSCP-metoden genererede i gennemsnit en population på 2,4 millioner orme i blandet stadie. LSCP giver befolkningsstørrelser i de mindste befolkningstilvækster på omkring 94.500 og på den største befolkningstilvækst på omkring 9.290.000. Den gennemsnitlige befolkningsstørrelse på tværs af alle stammer var 2,4 millioner orme. Bjælker under C. elegans stamme navne angiver, om en stamme er en CGC mutant eller CeNDR naturlige isolere. LSCP-prøvestørrelsen vises for hver stamme. Sammenligninger for alle par ved hjælp af Tukeys HSD-test blev udført. Der blev ikke observeret signifikante forskelle mellem de anslåede befolkningsstørrelser på tværs af C. elegansstammer (F(14,108) = 0,7, p = 0,77). Farvede bjælker angiver standardfarveskærme for respektive C. elegans stammerepræsentation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig04.jpg"> Figur 4: LSCP-metoden genererede store populationer af orme i blandet fase på 10 – 20 dage. En given C. elegans LSCP voksede, indtil prøven var fuld af voksne orme, nåede en stor befolkning størrelse, og havde minimal bakteriel græsplæne tilbage. LSCPs tog mellem 10 - 20 dage at vokse til en fuld blandet fase befolkning, afhængigt af belastningen. Den gennemsnitlige væksttid på tværs af stammerne var 12,2 dage. LSCP-prøvestørrelsen vises for hver stamme. Hver fejllinje blev konstrueret ved hjælp af 1 standardafvigelse fra middelværdien. Niveauer, der ikke er forbundet med samme bogstav, er væsentligt forskellige. Sammenligninger for alle par ved hjælp af Tukeys HSD-test. Der blev konstateret en betydelig forskel i den mængde væksttid på LSCP, der var nødvendig på tværs af C. elegans-stammer (F(14.108) = 8,8, p < 0,0001*). Farvede bjælker angiver standardfarveskærme for respektive C. elegans stammerepræsentation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2.jpg"> Figur 5: Blandet befolknings- og vækstmåling af referencestammen af vildtypen, PD1074. En repræsentativ LPFC-fordeling af en LSCP-vækst af referencestammen af vild type, en variant af den oprindelige N2 Bristol-stamme (PD1074), dokumenterer størrelsesfordelingen og hændelsestællingerne for en population i blandede trin. X-aksen viser længden (Flyvetid, TOF) af de sorterede orme. Y-aksen viser ormenes optiske tæthed (optisk udryddelse, EXT) sorteret. Hvert datapunkt er en orm, der er dokumenteret i eksemplet. Hvert tof-område, der blev brugt til billedanalyse, vises i en anden farve. Der blev oprettet 20 TOF-regioner (R2 – R21) fra en tof på 50 til 2050. Nærmere oplysninger om hver enkelt tof-region findes i supplerende tabel 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig06.jpg"> Figur 6: Billeder af orme sorteret fra TOF-områder fra R2 – R12 viser PD1074 LPFC-distributionen. I region R2 kan L1 orme identificeres, og i region R9 identificeres overvejende gravide voksne, der spænder over de to udviklingsmæssige larve ekstremer, hvilket giver os omtrentlige regioner inden for flowcytometerfordelingen af, hvor stadier forventes i fordelingen. Skalalinjen repræsenterer 1 mm. Repræsentative billeder er taget fra LPFC-fordelingen, der vises i figur 5, og de farvede bokse svarer til områder fra figur 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig07.jpg"> Figur 7: Befolkningsfordeling på tværs af flyvetidsområder i referencestammen af vildtype, PD1074. Fordeling af orme i hele tof-området, der viser de områder, hvor orme blev fundet. Hvert PD1074 LSCP repræsenteres som en individuel farve. (A)X-aksen viser de tyve TOF-områder (R2 – R21), der er observeret og talt for LSCP'et, og viser hele størrelsesfordelingen. Y-aksen viser procentdelen af orme fra et givet LSCP, der havde en kropsstørrelse, der faldt i et givet TOF-område. (B) Da en mindre del af ormens befolkning ligger mellem R7-R21-regionerne, blev loggen over den procentdel af ormene, der faldt inden for hvert område, taget for at vise befolkningsfordelingen. X-aksen viser tof-områderne R7-R21. Y-aksen viser loggen på procentdelen af orme fra et givet LSCP, der havde en kropsstørrelse, der faldt ind i et givet TOF-område. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende figur 1: Gennemsnitlig daglig temperatur (°C) af vækstbetingelserne, hvorunder LSCP blev dyrket og håndteret. Rapporterede temperaturer i det kontrollerede temperaturrum (CT) blev dokumenteret og indsamlet i hele seksmåneders spændvidden for prøvevækst og -indsamling. Den gennemsnitlige daglige temperatur rapporteres her. Der blev ikke observeret signifikante forskelle mellem den temperatur, hvor LCSP voksede i projektets løbetid (F(5,24) = 2,59, p = 0,0524). Hele temperaturforskellen strakte sig ikke over 0,003 °C i hele prøvevækstens og -generationens seksmåneders varighed. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453supfig01.jpg" target="_blank">Klik her for at downloade dette tal.</a>
Supplerende tabel 1: Tof-indhegnede områder, der bruges til at sortere orme i 384-brøndsplader til billeddannelse. Der blev oprettet områder med placering for at spænde over en tof på 100 på tværs af hele tof-fordelingen fra 50 – 2050. Gated regioner kan ændres og optimeres til dine behov. Hvert tof-område, der blev brugt til billedanalyse, vises i en anden farve. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table1_FINAL.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende tabel 2: 384-brønds pladeskabelon for tof-områder og replikatlayout. Hver prøve blev sorteret i en 384-godt plade til billeddannelse. Der blev oprettet fire replikater for hvert område, der er valgt til sortering. Gated regioner kan ændres og optimeres til dine behov. Se supplerende tabel 1 for specifikke lukkede områder, der er oprettet og anvendt i denne protokol. Hvert tof-område, der blev brugt til billedanalyse, vises i en anden farve. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table2_FINAL.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende tabel 3: C. eleganstammer, der anvendes i denne protokol, indeholder en blanding af CGC- og CeNDR-stammer. Stammen, genotypen, stammekilden og detaljerne er beskrevet i denne tabel. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table3_FINAL.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations at JoVE.com

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

For at bruge Caenorhabditis elegans (C. elegans) i omics forskning, en metode er nødvendig for at generere store populationer af orme, hvor en enkelt prøve kan måles på tværs af platforme for sammenlignende analyser. Her præsenteres en metode til kultur C. elegans populationer på store kulturplader (LSCP'er) og til at dokumentere befolkningstilvæksten.

Kultur og assay af storstilet blandet stadie Caenorhabditis elegans Populationer

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Denne teknik giver os mulighed for at indsamle store ormpopulationer, der skal bruges til flere omics platforme med minimal manipulation. Denne teknik giver os mulighed for at indsamle blandede fase C.elegans befolkninger på tværs af flere omics eksperimenter for at opnå et holistisk billede af hver prøve. For spot blegning af gravide voksne på store kultur plader, flamme en orm pick over en Bunsen brænder og bruge pick til scoop frisk E.coli fra kanten af bakteriel græsplæne på en storstilet kultur plade.Vælg en enkelt gravid voksen fra den fjerde chunk plade til spot blegning og tilsæt fem mikroliter af frisklavet alkalisk hypochloritopløsning i det ene hjørne af den store kulturplade væk fra E.coli græsplænen. Placer den gravide voksne i den alkaliske hypochloritopløsning og tryk på nematoden for at forstyrre neglebåndet og frigive æg. Når i alt fem voksne er blevet placeret jævnt rundt om E.coli græsplænen på samme måde, skal du placere låget tilbage på pladen.For at høste prøver fra store kulturplader hældes 50 milliliter M9-opløsning på en storskala kulturpladeoverflade og hvirvler pladen for at sikre, at M9 dækker hele nematodevækstmediet agaroseoverflade. Prime en steril serologisk pipette med M9 og vippe pladen, så M9 og orm befolkning samles i det ene hjørne af pladen. Brug den primede pipette til at suge ormen suspension og tilføje orme til en 50 milliliter konisk rør.Placer røret på en rocker for at forstyrre bakterielle klumper og snavs. Når alle ormene er indsamlet fra alle tre plader, overføres 15 milliliter orme fra hvert rør til hver af tre 15 milliliter koniske rør og sediment orme i rørene ved centrifugering. Aspirer forsigtigt supernatanterne uden at forstyrre ormen pellets og tilsæt 13 milliliter ormeaffjedring til hvert rør.Invertere rørene til at genbruge pellets og til at vaske så mange bakterier og snavs som muligt og centrifuge ormene igen. Når hver hel orm befolkning er blevet indsamlet, vask ormen pellets tre gange i 10 milliliter frisk M9 opløsning pr vask. Efter den sidste vask, genbruges hver renset orm pellet i 10 milliliter dobbelt destilleret vand.Ved vurdering af populationens størrelse fortyndes tre 100 mikroliter aliquots ormeprøve fra hvert rør i 900 mikroliter M9-opløsning pr. prøve, og aliquots anvendes til at foretage serielle fortyndinger. Placer bestanden orm prøve suspensioner på en rocker for kontinuerlig bevægelse af kulturer, mens aliquots tælles og blande ormen fortyndinger, indtil de er homogene. Tilføj fem mikroliter opløsning fra den første til 10 orm prøve til et glas mikroskop dias og tælle orme ved lys mikroskopi.Hvis der er mindre end 50 orme i prøven, skal du tælle fortyndingerne 1:100 og 1:1, 000. Hvis der er mere end 50 orme, skal du gå til den næste serielle fortynding. Efter at have talt hver aliquot replikat af hver fortynding tre gange, gennemsnit fortynding tæller til at bestemme den anslåede befolkningsstørrelse af ormen.Derefter opdele ormen prøver i passende eksperimentelle aliquots og flash fryse prøverne i flydende nitrogen for minus 80 grader Celsius opbevaring. For at forberede en ormprøve til stor partikelstrømscytometri fortyndes en ca. fem gange 10 til den fjerde orm i blandet fase aliquot til et sidste volumen på 10 milliliter M9-opløsning og tilsættes 200 mikroliter af en milligram pr. milliliter E.coli og 1:50 fortynding af 0,5 mikromolar rød fluorescerende mikrosfæreopløsning til ormens suspension. Efter en 20-minutters inkubation ved stuetemperatur med rokkende, indsamle orme og mikrosfærer ved centrifugering og vask ormene to gange med frisk M9-opløsning for at fjerne overskydende bakterier og uinternaliserede mikrosfærer.Efter den anden vask, genbruges pellet i fem milliliter M9 opløsning. Hvis pellet ser ren, tilføje fem milliliter M9 suppleret med 50 millimolar natrium azide til orme og placere røret på en rocker til både rette og aflive orme for nøjagtig optælling og dimensionering. For befolkningsfordeling dokumentation, åbne den kalibrerede 384-godt plade skabelon og indstille skabelonen til at dispensere 20 gated objekter i fire brønde for at opnå fire tekniske replikater af hver gated region for hver af de 20 bar regioner i prøven.Der udtages en 40 milliliter prøve orme på det store partikelstrømscytometer, og prøven sorteres automatisk under konstant omrøring af prøven for at forhindre, at genstande afregnes og samtidig dispenseres fra prøven i den kalibrerede 384-brøndsplade. Når hele prøven er sorteret, og det maksimale antal indhegnede områder er blevet dispenseret i 384-brøndspladen, skal prøven fjernes fra cytometeret, og instrumentet rengøres. Den store kultur plade metode blev testet på 15 stammer af C.Elegans, herunder en blanding af Caenorhabditis Genetics Center mutanter og Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource vilde stammer.I denne analyse gav den store kulturplademetode befolkningsstørrelser fra ca. 94.500 til 9.290.000. Den gennemsnitlige befolkningsstørrelse inden for referencestammen PD1074 og på tværs af stammer var ca. 2,4 millioner orme. Der blev ikke konstateret signifikante forskelle i de anslåede befolkningsstørrelser mellem C.elegans-stammer i løbet af et gennemsnit på 12,2 store kulturpladevækstdage.PD1074 store kulturplader tog mellem 10 og 14 dage at vokse til en fuld blandet fase befolkning med en gennemsnitlig væksttid på 12,2 dage. Den langsomste voksende stamme voksede i maksimalt 20 dage, og den hurtigst voksende stamme voksede i mindst 10 dage. I denne prøvefordeling for PD1074 blev orme målt fra L1-fasen gennem gravid voksen på et stort partikelflowcytometer.Efterfølgende billeddannelse og visualisering af variationerne i befolkningsfordelingen på tværs af prøver afslørede, at rørledningen genererede en blandet fasepopulation af C.elegans. Det er vigtigt at tælle ormene nøjagtigt i hele prøvesamlingen, så du får data, der er sammenlignelige på tværs af vækster og undersøgelser. Denne indsamling tilgang kan anvendes til RNA sekventering, genomik, og andre omik analyse for at udvide vores forståelse af den komplicerede dynamik, der opstår inden for C.elegans populationer.Denne teknik giver os mulighed for at indsamle blandede iscenesatte C.elegans populationer på tværs af flere omics eksperimenter for at opnå et holistisk billede af hver prøve.

Research

JoVE Journal

Genetics

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Overvågning Rumlig Segregation i Surface kolonisere mikrobielle populationer

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

En universel protokol for storstilet gRNA bibliotek produktion fra enhver kilde, DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Den nematodeprøveudtagning Caenorhabditis Elegans - en alsidig In Vivo Model til at studere Host-mikrobe interaktioner

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation af Ploidi i Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Den replika sæt metode: En høj overførselshastighed tilgang til kvantitativt foranstaltning Caenorhabditis elegans levetid

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Heuristic Mining of Hierarchical Genotypes and Accessory Genome Loci in Bacterial Populations

Heuristisk minedrift af hierarkiske genotyper og tilbehør genom Loci i bakteriepopulationer

Routine and systematic use of bacterial whole-genome sequencing (WGS) is enhancing the accuracy and resolution of epidemiological investigations carried ...

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Måling af Caenorhabditis elegans Følsomhed over for acetylcholin receptoragonist levamisol

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Undersøgelse af billige metoder til måling af levetid og sundhed i Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Måling af embryonal levedygtighed og yngelstørrelse i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

Analyse af transgenerationel epigenetisk arv i C. elegans ved hjælp af en fluorescerende reporter og kromatinimmunudfældning (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...