Name: culture and assay of large-scale mixed-stage caenorhabditis elegans populations
Uploaded: 2021-05-05T14:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations at JoVE.com

We danken de leden van het Edison Lab voor nuttige discussies en feedback over dit manuscript; in het bijzonder, B.M. Garcia. Sommige soorten werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), en CeNDR, die wordt gefinancierd door NSF Living Collections CSBR 1930382. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de NIH (U2CES030167).

<ol>
	<li>F&#233;lix, M. A., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+history+of+Caenorhabditis+elegans.">The natural history of Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 20 (22), 965-969 (2010).</li><li>Corsi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+behaviour.">The genetics of behaviour.</a> British Medical Bulletin. 29 (3), 269-271 (1973).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).</li><li>Xiong, H., Pears, C., Woollard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+C.+elegans+based+platform+for+toxicity+assessment.">An enhanced C. elegans based platform for toxicity assessment.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9839 (2017).</li><li>Loer, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticle+integrity+and+biogenic+amine+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans+require+the+cofactor+tetrahydrobiopterin+(BH4).">Cuticle integrity and biogenic amine synthesis in Caenorhabditis elegans require the cofactor tetrahydrobiopterin (BH4).</a> Genetics. 200 (1), 237-253 (2015).</li><li>Li, Y., Paik, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+role+for+fatty+acid+biosynthesis+genes+during+molting+and+cuticle+formation+in+Caenorhabditis+elegans.">A potential role for fatty acid biosynthesis genes during molting and cuticle formation in Caenorhabditis elegans.</a> BMB Reports. 44 (4), 285-290 (2011).</li><li>Meli, V. S., Osuna, B., Ruvkun, G., Frand, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLT-10+Defines+a+Family+of+DUF644+and+Proline-rich+Repeat+Proteins+Involved+in+the+Molting+Cycle+of+Caenorhabditis+elegans.">MLT-10 Defines a Family of DUF644 and Proline-rich Repeat Proteins Involved in the Molting Cycle of Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1648-1661 (2010).</li><li>Fritz, J. A., Behm, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUTI-1:+A+novel+tetraspan+protein+involved+in+C.+elegans+CUTicle+formation+and+epithelial+integrity.">CUTI-1: A novel tetraspan protein involved in C. elegans CUTicle formation and epithelial integrity.</a> PloS One. 4 (4), 5117 (2009).</li><li>Golden, J., Riddle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218 (4572), 578-580 (1982).</li><li>Jeong, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+structure+and+biological+activity+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer-inducing+pheromone.">Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone.</a> Nature. 433 (7025), 541-545 (2005).</li><li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans.">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li><li>Kaplan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascaroside+Expression+in+Caenorhabditis+elegans+Is+Strongly+Dependent+on+Diet+and+Developmental+Stage.">Ascaroside Expression in Caenorhabditis elegans Is Strongly Dependent on Diet and Developmental Stage.</a> PLoS One. 6 (3), 17804 (2011).</li><li>Golden, J., Riddle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218 (4572), 578-580 (1982).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Variant+in+the+Neuropeptide+Receptor+npr-1+is+a+Major+Determinant+of+Caenorhabditis+elegans+Growth+and+Physiology.">A Variant in the Neuropeptide Receptor npr-1 is a Major Determinant of Caenorhabditis elegans Growth and Physiology.</a> PLoS Genetics. 10 (2), 1004156 (2014).</li><li>Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+limit+theorem+and+a+strong+mixing+condition.">A central limit theorem and a strong mixing condition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 42 (1), 43-47 (1956).</li><li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+in+developmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans as a model in developmental toxicology.</a> Methods in Molecular Biology. 889, 15-24 (2012).</li><li>Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Beads+Are+a+Versatile+Tool+for+Staging+Caenorhabditis+elegans+in+Different+Life+Histories.">Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories.</a> Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).</li><li>Denver, D. R., Morris, K., Streelman, J. T., Kim, S. K., Lynch, M., Thomas, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+consequences+of+mutation+and+natural+selection+in+Caenorhabditis+elegans.">The transcriptional consequences of mutation and natural selection in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (5), 544-548 (2005).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li><li>Kevin, S., Pulak, R., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Analysis,+Sorting,+and+Dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+Flow-Sorting+System.">Techniques for Analysis, Sorting, and Dispensing of C. elegans on the COPAS Flow-Sorting System.</a> C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+gene+flow+shape+niche-associated+variation+in+pheromone+response.">Selection and gene flow shape niche-associated variation in pheromone response.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 3 (10), 1455-1463 (2019).</li><li>Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeNDR,+the+Caenorhabditis+elegans+natural+diversity+resource.">CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource.</a> Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2016).</li><li>Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Beads+Are+a+Versatile+Tool+for+Staging+Caenorhabditis+elegans+in+Different+Life+Histories.">Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories.</a> Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).</li></ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Een verscheidenheid aan vaten kan worden gebruikt als een LSCP. In dit protocol werd een standaard glazen ovenschaal gebruikt. De in gebruik getreden LSPCs hadden buitenafmetingen van 35,56 x 20,32 cm, binnenafmetingen van 27,94 x 17,78 cm, en ongeveer 4,45 cm diep en werden geleverd met een gemonteerd deksel. Zo is de hoeveelheid bacteriën die hier wordt gebruikt geoptimaliseerd voor een LSCP met de bovenstaande afmetingen om een grote populatie wormen in gemengd stadium op te leveren. Bacterievolume en concentratie kunnen worden aangepast aan de experimentele behoeften.
Verontreiniging door schimmels, schimmels of andere bacteriële bronnen kan bij elke stap in de LSCP-methode voorkomen, dus behandel monsters met zorg. Voordat u begint met een stap in het protocol, moet u ervoor zorgen dat de werkruimte wordt gereinigd met 70% ethanol en 10% bleekmiddel. Behandel gebruikte gebieden indien beschikbaar gedurende 30 minuten met UV-licht en schakel een HEPA-luchtfilter 30 minuten in voordat u met elke stap begint.
Door de LSCP in een gecontroleerde omgeving te laten groeien(d.w.z.in een CT-ruimte op 20 °C), kan de gebruiker gemakkelijker de groei van het monster volgen en mogelijke verontreiniging documenteren. Als het oppervlak van de LSCP verontreinigd raakt, snijdt u de verontreiniging indien mogelijk uit en laat u het monster groeien of gooit u het monster weg als de verontreiniging niet kan worden bekeken. Het is absoluut noodzakelijk om besmetting snel aan te pakken om ongewenste groei te verminderen en ervoor te zorgen dat het wormen niet overcompeteert voor hulpbronnen.
Deze methode is bedoeld voor diegenen die grootschalige gemengde bevolkingsculturen van C. eleganswillen laten groeien. Hoewel het mogelijk is om gesynchroniseerde populaties wormen op de LSCP te kweken, zoals gedaan op commercieel beschikbare Petrischalen en in vloeibare cultuur, hebben de auteurs deze optie niet getest. Bovendien, als gebruikers gemiddeld meer dan ongeveer 2,4 miljoen wormen in een bepaald monster willen kweken, wordt een andere methode aanbevolen4. Groeisucces is afhankelijk van de stam die in de pijplijn wordt verwerkt. De auteurs waren in staat om met succes populaties van ongeveer 2,4 miljoen wormen te laten groeien in ten minste vijf biologische replica's van 15 C. elegans stammen, wat aangeeft dat de methode robuust is.
Voordat u met het experiment begint, moet u opmerken dat de leeftijd en gezondheid van een bepaalde worm de vruchtbaarheid en de daaropvolgende groeitijd van de populatie kunnen beïnvloeden. Zorg ervoor dat wormen in gezonde omstandigheden worden gehouden met minimale stress voordat ze in deze pijpleiding worden gebruikt. Er wordt aangenomen dat voorraadmonsters zijn gemaakt, ingevroren en bewaard op -80 °C om genetische drift in de loop van de tijd te verminderen.
Afhankelijk van de behoeften van een bepaald experiment kan het aantal beginnende gravid volwassenen op een LSCP worden gewijzigd. Het veranderen van het aantal beginnende gravid volwassenen op de LSCP zal de groeisnelheid en dus de tijd om te oogsten veranderen. Vijf gravid volwassenen worden gebruikt om elke LSCP te zaaien om de volgende redenen: (1) Een eenvoudige, snelle en efficiënte manier om veel C. elegans stammen op LSCPs te zaaien was ooit nodig en (2) om de leeftijdsverschillen tussen de gekozen gravid volwassenen te verminderen die kunnen leiden tot de groei heterogeniteit.
Deze methode stelt de gebruiker in staat om grote populaties wormen te oogsten met alle levenscyclusfasen aanwezig. Met de huidige beschikbare methoden vereist het verzamelen van grootschalige monsters van C. elegans bleekmiddelsynchronisatie om het gewenste aantal wormen voor downstreamwerk te verkrijgen. Gezien deze aanpak kan men nu zoveel mogelijk wormen kweken als voorheen mogelijk was in fermentoren of grootschalige vloeibare culturen zonder de problemen die gepaard gaan met bleekmiddelsynchronisatie en meerdere behandelingsstappen. Ons protocol stelt iemand in staat om soorten van belang efficiënt te targeten, minimale verwerkingstijd te gebruiken bij het kweken van het monster zelf en stadia van wormen of de populatie te isoleren indien nodig in downstream pijpleidingen.
Een LPFC werd gebruikt als een hulpmiddel om de populatieverdeling en grootte in een bepaalde LSCP te documenteren. De gebruikte LPFC is een continu stroomsysteem dat wormen analyseert, sorteert en afgeeft op basis van hun grootte (TOF) en optische dichtheid. Terwijl een bepaalde worm door de stroomcel gaat, vangt de axiale lichtverliesdetector de hoeveelheid signaallicht op die wordt geblokkeerd door een 488 nm-solid state laser gedurende de tijd die een worm nodig heeft om door te gaan, waardoor de gebruiker de TOF en optische dichtheid van de worm krijgt. Fluorescentieverzamelingsoptieken en detectoren kunnen ook worden gebruikt om de fluorescentiegevoeligheid en -verzameling op elk monster te maximaliseren. Lpfc-inzamelingsparameters variëren afhankelijk van het instrument. Gebruikers kunnen verschillende platforms gebruiken om de wormgrootte vast te leggen en zijn niet beperkt tot het gebruik van dit protocol als er geen LPFC beschikbaar is.
De auteurs gebruiken monsters gekweekt in de hier beschreven methode om onbekende metabolieten in verschillende stammen van C. elegans te identificeren via Liquid Chromatography – Mass Spectrometry, NMR spectroscopie en RNA sequencing. De auteurs zijn van plan om deze methode te blijven gebruiken voor de groei van monsters in deze pijpleiding met een verscheidenheid aan C. elegans stammen, omdat nieuwe soorten van belang gemakkelijk kunnen worden verwerkt met behulp van deze pijpleiding.

C. elegans is een klein vrijlevend nematode dat over de hele wereld wordt aangetroffen in een verscheidenheid aan natuurlijke habitats1. Zijn relatieve gemak van groei, snelle generatietijd, reproductiesysteem, en transparant lichaam maken het een krachtig modelorganisme dat wijd in ontwikkelingsbiologie, het verouderen, neurobiologie, en genetica2,3is bestudeerd. Het overvloedige werk aan C. elegans maakt het een uitstekende kandidaat om in -omics studies te gebruiken om fenotypes uitgebreid te koppelen aan complexe biologische componenten en hun relaties in een bepaald organisme.
Om C. elegans te gebruiken in collaboratief -omics onderzoek, is een methode nodig om grote populaties van dieren in gemengde fase te genereren waar een enkele steekproef kan worden gesplitst en gebruikt over verschillende platforms en instrumenten voor vergelijkende analyses. Het creëren van een pijplijn om een dergelijk monster te genereren vereist een scherp bewustzijn van dieet, omgeving, stress, bevolkingsstructuur en monsterbehandeling en -verzameling. Daarom is het van cruciaal belang dat standaard en reproduceerbare kweekomstandigheden worden geïntegreerd in grootschalige pijpleidingen. In C. elegans onderzoek, twee traditionele methoden worden gebruikt om wormen te cultuur - agar Petri gerechten en vloeibare cultuur4.
Historisch gezien, wanneer grote hoeveelheden C. elegans nodig zijn, worden ze gekweekt in vloeibare cultuur4. De stappen die betrokken zijn bij het genereren van een grote populatie wormen in vloeibare cultuur vereisen meerdere behandelingsstappen die vaak bleekmiddelsynchronisatie omvatten om gravid volwassen nagelriemen te scheuren, embryo's vrij te geven om de gewenste populatiegrootte te bereiken. Wanneer bleekmiddelsynchronisatie echter wordt gebruikt, is de bevolkingsgroei afhankelijk van de begintellingsgrootte en heeft dit dus gevolgen voor de daaropvolgende groei en bevolkingsaantallen. Bovendien variëren C. elegans-stammen in hun cuticulagevoeligheid, blootstellingstijd en stressrespons op bleeksynchronisatie, waardoor het moeilijk is om veel stammen tegelijk te assayen5,6,7,8,9.
Bovendien vereist wormgroei in vloeibare cultuur een paar overdrachtsstappen, omdat het vaak wordt aanbevolen om slechts één generatie wormen te laten groeien voordat u gaat oogsten, omdat overbevolking gemakkelijk kan optreden als het meerdere generaties wordt gekweekt en kan leiden tot dauervorming ondanks de aanwezigheid van voedsel10. Dauer-vorming vindt plaats door kleine signaalmoleculen zoals ascarosiden, vaak aangeduid als "dauer feromonen"11,12,13,14, worden vrijgegeven in vloeibare media en hebben invloed op de groei van de bevolking. Bovendien leidt het kweken van grote wormpopulaties in vloeibare cultuur tot overmatige ophoping van bacteriën in de cultuur, waardoor problemen ontstaan wanneer een schoon monster nodig is voor downstream fenotypische assays. Ten slotte, wanneer een vloeibare cultuur besmet raakt, is het moeilijker te handhaven omdat schimmelsporen of bacteriële cellen gemakkelijk door de media worden verspreid15.
De andere traditionele methode om C. elegans te kweken is op agar Petri-gerechten. In de handel verkrijgbare Petrischalen stellen men in staat om gemakkelijk meerdere generaties wormen met gemengd stadium te laten groeien zonder de snelle effecten van overbevolking en hoge dauervorming zoals te zien in vloeibare culturen. Een nadeel van wormgroei op traditionele agar Petri-schotels is echter dat de grootste commercieel beschikbare Petrischaal geen grote wormpopulaties oplevert voor een -omics-studie zonder een bleeksynchronisatiestap toe te voegen. Kortom, het cultiveren van populaties van C. elegans op agar Petri-schotels is meer geschikt voor het verzamelen van -omics-gegevens, maar we hadden een methode nodig om zeer grote populatiegroottes te genereren zonder vloeibare cultivering.
Hier presenteren we een methode aan cultuur en verzamelen we grote gemengde C. eleganspopulaties op grootschalige cultuurplaten (LSCP). Het verzamelen van monsters via deze pijpleiding levert voldoende monster op om fenotypische en populatiegegevens te verzamelen, samen met alle gegevens die nodig zijn voor -omics-experimenten(d.w.z.genomica, transcriptomics, proteomics en metabolomics). Bovendien vereist de LSCP-methode minimale manipulatie van de dieren, minder voorbereidingstijd voor de gebruiker, zorgt voor een strakke milieucontrole en zorgt ervoor dat de behandeling van elk monster consistent is gedurende het hele onderzoek voor algehele reproduceerbaarheid.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Graduated Cylinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10124-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 Proof Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75804-654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75874-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>05040-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BVC Control G Fluid Aspiration System</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>449709-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3045-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox Bleach</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89414-502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conviron Control Temperature Room</td>
			<td>Conviron</td>
			<td></td>
			<td>https://www.conviron.com/environmental-rooms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89089-866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Scientific Accuspin 3R</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-Bottom 24-Well Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29443-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft.</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>204390560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT115 E. coli (DE3)</td>
			<td>CGC</td>
			<td>HT115(DE3)</td>
			<td>https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470224-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Scale Culture Plate (LSCP)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1090948</td>
			<td>Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C86677-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Plain Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.11727.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Devices ImageXpress</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model Number:IXMConfocal</td>
			<td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin (10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6261-25MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (6 cm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Controller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-4180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0781-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasssium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P250-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Fluroscent Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19507-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>746398-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>111357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Gilson Pipette Set</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10002M, FA10004M, FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin (100mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Union Biometrica COPAS BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td>https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and assay of large-scale mixed-stage caenorhabditis elegans populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is en blijft een waardevol modelorganisme om ontwikkelingsbiologie, veroudering, neurobiologie en genetica te bestuderen. De grote hoeveelheid werk aan C. elegans maakt het een ideale kandidaat om te integreren in studies met grote populaties, hele dieren om de complexe biologische componenten en hun relaties met een ander organisme te ontleden. Om C. elegans te gebruiken in collaboratief -omics onderzoek, is een methode nodig om grote populaties dieren te genereren waar een enkele steekproef kan worden gesplitst en onderzocht over verschillende platforms voor vergelijkende analyses.
Hier wordt een methode gepresenteerd om een overvloedige C. eleganspopulatie in gemengd stadium op een grootschalige cultuurplaat (LSCP) en daaropvolgende fenotypische gegevens te verzamelen. Deze pijpleiding levert voldoende aantallen dieren op om fenotypische en populatiegegevens te verzamelen, samen met alle gegevens die nodig zijn voor -omics-experimenten (d.w.z. genomica, transcriptomics, proteomics en metabolomics). Bovendien vereist de LSCP-methode minimale manipulatie van de dieren zelf, minder voorbereidingstijd voor de gebruiker, zorgt voor een strakke milieucontrole en zorgt ervoor dat de behandeling van elk monster gedurende het hele onderzoek consistent is voor de algehele reproduceerbaarheid. Ten slotte worden methoden gepresenteerd om de populatiegrootte en populatieverdeling van C. elegans levensfasen in een bepaalde LSCP te documenteren.

De groei van C. elegans met behulp van de LSCP-methode levert gemiddeld ongeveer 2,4 miljoen wormen in gemengd stadium per monster op over 12,2 dagen. De groei van C. elegans met behulp van de LSCP-methode stelt gebruikers in staat om grote populaties van C. elegans te genereren met weinig behandeling en manipulatie van de dieren, wat ideaal is voor grootschalige -omics-studies (Figuur 1). Zodra een LSCP vol zit met volwassen wormen, een grote populatiegrootte heeft bereikt en minimale bacteriën over heeft, kunnen gebruikers de populatiegrootte oogsten en schatten. Dit punt kan ook dienen als een kwaliteitscontrole door te evalueren of de populatie voldoende is om te gebruiken in een -omics-pijpleiding (figuur 2). De populatiedynamiek is afhankelijk van de stam zelf, het gedrag van de stam(d.w.z.gravende stammen hadden de neiging om een lager wormherstel te hebben) en groeisucces(d.w.z.besmetting). De LSCP-methode werd getest op 15 stammen van C. elegans die een mengsel bevatten van Caenorhabditis Genetics Center (CGC) mutanten en Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource (CeNDR) wilde stammen25. Stam genotypen worden beschreven in aanvullende tabel 3.
De LSCP-methode leverde populatiegroottes op van ongeveer 94.500 tot 9.290.000. De gemiddelde populatiegrootte binnen de referentiestam PD1074 en tussen stammen bedroeg ongeveer 2,4 miljoen wormen (figuur 3). Er werden geen significante verschillen gevonden in de geschatte populatiegrootte tussen C. elegans-stammen in de loop van gemiddeld 12,2 LSCP-groeidagen (figuur 4). PD1074 LSCPs duurde tussen de 10 – 14 dagen om uit te groeien tot een volledige gemengde populatie. De gemiddelde groeitijd over PD1074 was 10 dagen. De langzaamst groeiende soort groeide maximaal 20 dagen en de snelst groeiende soort groeide gedurende minimaal 10 dagen (figuur 4).
Daarom kunnen gebruikers met behulp van deze LSCP-methode eenvoudig nieuwe interessestammen integreren in een studie met weinig kennis van ontwikkelingstiming en achtergrondexpertise. Merk op dat stammen en fenotypes die moeten worden onderhouden door te plukken, vruchtbaarheidsdefecten hebben, heterozygoot zijn of groeistoornissen hebben, mogelijk niet goed werken in deze pijplijn.
Met grote deeltjesstroomcytometrie en beeldvorming van monsters kunnen gebruikers de populatieverdeling documenteren. Een breed scala aan platforms kan worden gebruikt om succesvolle bevolkingsgroei te meten.
Voor reproduceerbare -omics metingen is het belangrijk om consistente culturen te laten groeien. De maatstaven voor de reproduceerbaarheid van de cultuur zijn het aantal wormen en een consistente grootteverdeling voor een bepaalde stam. We tonen de monsterverdeling voor de referentiestam PD1074 – een variant van de originele N2 Bristol-stam, met behulp van de LPFC23,26 en micro confocale microscoopbeelden als proxy's voor groeisucces. Aangezien wormen werden gemeten vanaf het L1-stadium tot en met gravid adult op de LPFC-verdeling (figuur 5), daaropvolgende beeldvorming (figuur 6) en de variatie in de populatieverdeling over monsters (figuur 7), kunnen we zien dat deze pijpleiding een gemengde populatie van C. elegansgenereerde .
Om de populatieverdeling van onze gemengde monsters nader te bekijken, hebben we gekeken naar de verdeling van 35 PD1074 LSCPs door te kijken naar het percentage wormen dat binnen elke regio valt over de gehele time of flight (TOF)(d.w.z.lichaamslengte) verdeling (figuur 7A,B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig01.jpg"> Figuur 1: Overzicht van de LSCP wormgroeipijplijn. (A) Eenmaal in het laboratorium ontvangen, werden alle stammen bereid en ingevroren voor langdurige opslag bij -80 °C2. (B) Een "master chunk"-plaat werd bereid uit een bevroren wormvoorraad en bewaard bij 15 °C om niet langer dan een maand te worden gebruikt. (C) Elk monster onderging vier opeenvolgende chunkingstappen om de generatiespanning te verminderen voordat het op de LSCP groeide. (D) 5 individuele gravid volwassenen werden geplukt uit de "chunk 4" 6 cm plaat in Stap (D) en spot gebleekt op vijf bepaalde gebieden van de LSCP. (E) De LSCP werd in een gecontroleerde temperatuurruimte geplaatst en gekweekt bij 20 °C totdat de LSCP vol zat met volwassen wormen, een grote populatiegrootte bereikte en minimale bacteriën over had. (F) De wormpopulatie werd geoogst en verzameld voor stroomafwaartse stappen. (G) Aliquots werden gemaakt van de LSCP en werden flash frozen voor downstream gewenste toepassingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig02.jpg"> Figuur 2: Overzicht van LSCP oogsten en schatten van populatiegrootte. (A) 50 ml M9 werd gebruikt om wormen van het NGMA-oppervlak te wassen. Wormsuspensie werd in een conische buis van 50 ml gepijpt. Stap (A) werd tweemaal herhaald. (B) 15 ml wormsuspensie werd in een nieuwe conische buis van 15 ml gegoten. Wormen werden geplet door centrifugeren. M9 + puin werd afgezogen zonder wormkorrel te verstoren. Stap (B) werd herhaald totdat alle 150 ml wormsuspensie was verzameld. (C) De wormkorrel werd driemaal gewassen en gecentrifugeerd met M9 om restafval te verwijderen. Zodra het monster schoon was, werd de wormkorrel geresuspendeerd in 10 ml ddH2O. (D) Er werd een seriële verdunning van het monster gemaakt om de populatiegrootte van de worm te schatten. Er werd gebruik gemaakt van de verdunningsfactor(en) waarmee wormen nauwkeurig konden worden geteld. De gebruikte verdunningsfactor(en) veranderde afhankelijk van de populatiegrootte van de LSCP. (E) Zodra de verdunningsfactor(en) waren gekozen, werden alle wormen van alle drie de aliquot-replica's van die verdunning op een schone dia gepijpt en werden wormen geteld onder een ontleedmicroscoop. (F) De steekproef werd opgesplitst in aliquots van passende grootte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig03.jpg"> Figuur 3: LSCP-methode genereerde gemiddeld een populatie van 2,4 miljoen wormen in gemengd stadium. LSCP levert bevolkingsgrootte in de kleinste bevolkingsgroei bij rond 94.500 en bij de grootste bevolkingsgroei bij rond 9.290.000. De gemiddelde populatiegrootte van alle stammen was 2,4 miljoen wormen. Staven onder C. elegans stamnamen geven aan of een stam een CGC mutant of CeNDR natuurlijk isolaat is. Voor elke soort wordt de LSCP-steekproefgrootte weergegeven. Vergelijkingen voor alle paren met behulp van Tukey's HSD Test werden uitgevoerd. Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen de geschatte populatiegroottes tussen C. elegans stammen (F(14.108) = 0,7, p = 0,77). Gekleurde balken geven standaard kleurendisplays aan voor de respectievelijke C. elegans stamweergave. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig04.jpg"> Figuur 4: LSCP-methode genereerde grote populaties wormen in gemengde fase in 10 – 20 dagen. Een gegeven C. elegans LSCP groeide totdat het monster vol volwassen wormen zat, een grote populatiegrootte bereikte en een minimaal bacterieel gazon over had. LSCPs duurde tussen de 10 – 20 dagen om uit te groeien tot een volledige gemengde populatie, afhankelijk van de stam. De gemiddelde groeitijd van de stammen was 12,2 dagen. Voor elke soort wordt de LSCP-steekproefgrootte weergegeven. Elke foutbalk is geconstrueerd met 1 standaardafwijking van het gemiddelde. Niveaus die niet met dezelfde letter zijn verbonden, zijn aanzienlijk verschillend. Vergelijkingen voor alle paren met behulp van Tukey's HSD Test. Er werd een significant verschil gevonden in de hoeveelheid groeitijd op LSCP die nodig was voor C. elegans stammen (F(14,108) = 8,8, p < 0,0001*). Gekleurde balken geven standaard kleurendisplays aan voor de respectievelijke C. elegans stamweergave. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2.jpg"> Figuur 5: Gemengde populatie- en groeimeting van de wildtype referentiestam, PD1074. Een representatieve LPFC-verdeling van één LSCP-groei van de wild-type referentiestam, een variant van de oorspronkelijke N2 Bristol-stam (PD1074), documenteert de grootteverdeling en het aantal gebeurtenissen van een populatie in gemengde fase. De x-as geeft de lengte (Vliegtijd, TOF) van de gesorteerde wormen weer. De y-as geeft de optische dichtheid (optische extinctie, EXT) van de gesorteerde wormen weer. Elk gegevenspunt is een worm die in het voor beeld is gedocumenteerd. Elk TOF-gebied dat is gebruikt voor beeldanalyse, wordt in een andere kleur weergegeven. Er werden twintig TOF-regio's gecreëerd (R2 – R21), variërend van een TOF van 50 tot 2050. Details over elke TOF-regio zijn te vinden in aanvullende tabel 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig06.jpg"> Figuur 6: Afbeeldingen van wormen gesorteerd uit TOF-regio's variërend van R2 - R12 tonen de PD1074 LPFC-verdeling. In regio R2 kunnen L1-wormen worden geïdentificeerd en in regio R9 worden voornamelijk gravid-volwassenen geïdentificeerd, die de twee ontwikkelingslarve extremen overspannen, waardoor we geschatte regio's binnen de stroomcytometerverdeling hebben van waar stadia in de distributie worden verwacht. Schaalbalk vertegenwoordigt 1 mm. Er zijn representatieve afbeeldingen genomen van de LPFC-verdeling die in figuur 5wordt weergegeven , en de gekleurde vakken komen overeen met regio 's uit figuur 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig07.jpg"> Figuur 7: Populatieverdeling over tof-regio's (time of flight) in de wild-type referentiestam PD1074. Verspreiding van wormen over het hele TOF-gebied met de regio's waar wormen werden gevonden. Elke PD1074 LSCP wordt weergegeven als een individuele kleur. (A) De x-as toont de twintig TOF-gebieden (R2 – R21) waargenomen en geteld voor de LSCP, met de volledige grootteverdeling. De y-as toont het percentage wormen van een bepaalde LSCP met een lichaamsgrootte die in een bepaald TOF-gebied viel. (B) Aangezien een kleiner deel van de wormpopulatie tussen de R7-R21-regio's valt, werd het logboek van het percentage wormen dat binnen elke regio viel, genomen om de populatieverdeling weer te geven. De x-as geeft de R7-R21 TOF-gebieden weer. De y-as geeft het logboek weer van het percentage wormen van een bepaalde LSCP met een lichaamsgrootte die in een bepaald TOF-gebied viel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
Aanvullende figuur 1: Gemiddelde dagtemperatuur (°C) van de groeiomstandigheden waaronder de LSCP werd geteeld en verwerkt. Gerapporteerde temperaturen van de Controlled Temperature (CT)-ruimte werden gedocumenteerd en verzameld gedurende de periode van zes maanden van monstergroei en -verzameling. De gemiddelde dagtemperatuur wordt hier gerapporteerd. Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen de temperatuur waarin de LCSP tijdens de looptijd van het project groeide (F(5,24) = 2,59, p = 0,0524). Het totale temperatuurverschil besloeg niet meer dan 0,003 °C gedurende de periode van zes maanden van monstergroei en -opwekking. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453supfig01.jpg" target="_blank">Klik hier om deze afbeelding te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 1: TOF gated regions used to sort worms in 384-well plates for imaging. Binned-regio's zijn gemaakt om een TOF van 100 te omvatten over de hele TOF-distributie van 50 - 2050. Gated regio's kunnen worden gewijzigd en geoptimaliseerd om aan uw behoeften te voldoen. Elk TOF-gebied dat is gebruikt voor beeldanalyse, wordt in een andere kleur weergegeven. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table1_FINAL.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 2: 384-put plaatsjabloon van TOF-regio's en repliceer lay-out. Elk monster werd gesorteerd in een 384-put plaat voor beeldvorming. Er zijn vier replica's gemaakt voor elke regio die is geselecteerd voor sortering. Gated regio's kunnen worden gewijzigd en geoptimaliseerd om aan uw behoeften te voldoen. Zie aanvullende tabel 1 voor specifieke gated regions die in dit protocol zijn gemaakt en gebruikt. Elk TOF-gebied dat is gebruikt voor beeldanalyse, wordt in een andere kleur weergegeven. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table2_FINAL.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 3: C. elegans stammen die in dit protocol worden gebruikt, bevatten een mengsel van CGC- en CeNDR-stammen. De stam, het genotype, de stambron en de details worden in deze tabel beschreven. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table3_FINAL.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations at JoVE.com

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Om Caenorhabditis elegans (C. elegans) te gebruiken in omics-onderzoek, is een methode nodig om grote populaties wormen te genereren waar een enkel monster kan worden gemeten op verschillende platforms voor vergelijkende analyses. Hier wordt een methode gepresenteerd om C. eleganspopulaties op grootschalige cultuurplaten (LSCPs) te culteren en de bevolkingsgroei te documenteren.

Cultuur en assay van grootschalige gemengde caenorhabditis elegans populaties

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Deze techniek stelt ons in staat om grootschalige wormpopulaties te verzamelen die kunnen worden gebruikt voor meerdere omics-platforms met minimale manipulatie. Deze techniek stelt ons in staat om gemengde C.elegans populaties te verzamelen in meerdere omics experimenten om een holistisch beeld van elk monster te krijgen. Voor het spotten van gravid volwassenen op grootschalige kweekplaten, vlam een worm pick over een Bunsen brander en gebruik de pick om verse E.coli te scheppen van de rand van het bacteriële gazon op een grootschalige kweekplaat.Kies een enkele gravid volwassene van de vierde brokplaat voor spotbleking en voeg vijf microliters vers bereide alkalische hypochlorietoplossing toe in een hoek van de grootschalige kweekplaat weg van het E.coli-gazon. Plaats de gravid adult in de alkalische hypochlorietoplossing en tik op het nematode om de nagelriem te verstoren en eieren vrij te geven. Wanneer in totaal vijf volwassenen op dezelfde manier gelijkmatig rond het E.coli-gazon zijn geplaatst, plaatst u het deksel terug op de plaat.Om monsters van grootschalige kweekplaten te oogsten, giet je 50 milliliter M9-oplossing op één grootschalig kweekplaatoppervlak en wervel je de plaat om ervoor te zorgen dat de M9 het hele nematodengroeimedium agaroseoppervlak bedekt. Maak een steriele serologische pipet met M9 en kantel de plaat zodat de M9- en wormpopulatie zich in een hoek van de plaat verzamelen. Gebruik de geprimeerde pipet om de wormsuspensie te aspireren en voeg de wormen toe aan een conische buis van 50 milliliter.Plaats de buis op een rocker om eventuele bacteriële klonten en vuil te verstoren. Wanneer alle wormen van alle drie de platen zijn verzameld, breng dan 15 milliliter wormen van elke buis over in elk van de drie conische buizen van 15 milliliter en sedimenteer de wormen in de buizen door centrifugeren. Aspireer de supernatanten voorzichtig zonder de wormkorrels te verstoren en voeg 13 milliliter wormsuspensie toe aan elke buis.Keer de buizen om om de pellets te resuspenden en om zoveel mogelijk bacteriën en vuil af te wassen en de wormen opnieuw te centrifugeren. Wanneer elke hele wormpopulatie is verzameld, wast u de wormkorrels driemaal in 10 milliliter verse M9-oplossing per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt moet elke gereinigde wormkorrel opnieuw worden gesuspendeerd in 10 milliliter dubbel gedestilleerd water.Verdun voor de schatting van de populatiegrootte snel drie 100 microliter aliquots wormmonster uit elke buis in 900 microliter M9-oplossing per monster en gebruik de aliquots om seriële verdunningen te maken. Plaats de suspensuspensus van het stamwormmonster op een rocker voor continue beweging van de culturen terwijl de aliquots worden geteld en meng de wormverdunningen tot ze homogeen zijn. Voeg vijf microliters oplossing van het eerste tot 10 wormmonster toe aan een glazen microscoopschuif en tel de wormen door lichtmicroscopie.Als er minder dan 50 wormen in het monster zitten, tel dan de verdunningen 1:100 en 1:1, 000. Als er meer dan 50 wormen zijn, gaat u naar de volgende seriële verdunning. Na het drie keer tellen van elke aliquot-replica van elke verdunning, telt de verdunning gemiddeld om de geschatte populatiegrootte van de worm te bepalen.Splits vervolgens de wormmonsters in de juiste experimentele aliquots en vries de monsters in vloeibare stikstof in voor min 80 graden Celsius opslag. Om een wormmonster voor te bereiden op cytometrie met grote deeltjesstromen, verdunt u ongeveer vijf keer 10 tot de vierde gemengde fase worm aliquot tot een eindvolume van 10 milliliter M9-oplossing en voegt u 200 microliters van één milligram per milliliter E.coli en 1:50 verdunning van 0,5 micromoler rode fluorescerende microsfeeroplossing toe aan de wormsuspensie. Na een incubatie van 20 minuten bij kamertemperatuur met schommelen, verzamel je de wormen en microbolletjes door centrifugeren en was je de wormen twee keer met verse M9-oplossing om overtollige bacteriën en ongeinternaliseerde microbolletjes te verwijderen.Na de tweede wasbeurt, resuspend de pellet in vijf milliliter M9-oplossing. Als de pellet er schoon uitziet, voeg dan vijf milliliter M9 aangevuld met 50 millimol natrium azide toe aan de wormen en plaats de buis op een rocker om de wormen zowel recht te maken als te euthanaseren voor nauwkeurig tellen en dimensioneren. Voor documentatie over populatieverdeling opent u de gekalibreerde 384-putplaatsjabloon en stelt u de sjabloon in om 20 gated objecten in vier putten te doseren om vier technische replica's van elk gated-gebied voor elk van de 20 bar-regio's van het monster te verkrijgen.Plaats een monster van 40 milliliter wormen op de cytometer van de grote deeltjesstroom en begin automatisch met het sorteren van het monster terwijl u het monster continu roert om te voorkomen dat voorwerpen uit het monster bezinken en tegelijkertijd in de gekalibreerde 384-putplaat worden goten. Zodra het hele monster is gesorteerd en het maximale aantal gated regions in de 384-putplaat is afgegeven, verwijdert u het monster uit de cytometer en reinigt u het instrument. De grootschalige kweekplaatmethode werd getest op 15 stammen van C.Elegans, waaronder een mengsel van Caenorhabditis Genetics Center mutanten en Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource wilde stammen.In deze analyse leverde de grootschalige kweekplaatmethode populatiegroottes op van ongeveer 94. De gemiddelde populatiegrootte binnen de referentiestam PD1074 en over stammen heen was ongeveer 2,4 miljoen wormen. Er werden geen significante verschillen gevonden in de geschatte populatiegrootte tussen C.elegans-stammen in de loop van gemiddeld 12,2 grootschalige groeidagen van de cultuurplaat.PD1074 grootschalige kweekplaten namen tussen de 10 en 14 dagen in om uit te groeien tot een volledige gemengde populatie met een gemiddelde groeitijd van 12,2 dagen. De langzaamste groeiende soort groeide maximaal 20 dagen en de snelst groeiende soort groeide minimaal 10 dagen. In deze monsterverdeling voor PD1074 werden wormen gemeten vanaf het L1-stadium tot gravid adult op een grote deeltjesstroomcytometer.Latere beeldvorming en visualisatie van de variaties in de populatieverdeling over monsters onthulde dat de pijpleiding een gemengde populatie van C.elegans genereerde. Het is belangrijk om de wormen nauwkeurig te tellen in de hele monsterverzameling, zodat u gegevens verkrijgt die vergelijkbaar zijn tussen gezwellen en studies. Deze collectiebenadering kan worden toegepast op RNA-sequencing, genomics en andere omics-analyse om ons begrip van de gecompliceerde dynamiek die zich voordoet binnen C.elegans-populaties uit te breiden.Deze techniek stelt ons in staat om gemengde geënsceneerde C.elegans populaties te verzamelen in meerdere omics experimenten om een holistisch beeld van elk monster te krijgen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Monitoring ruimtelijke segregatie in Surface Kolonisatie microbiële populaties

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Een universeel Protocol voor grootschalige gRNA bibliotheek productie uit elke bron van DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

De Nematode Caenorhabditis Elegans - een veelzijdig In Vivo -Model om te studeren van Host-microbe interacties

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulatie van ploïdie in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel Caenorhabditis elegans levensduur

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Heuristic Mining of Hierarchical Genotypes and Accessory Genome Loci in Bacterial Populations

Heuristische mijnbouw van hiërarchische genotypen en accessoire genoom loci in bacteriële populaties

Routine and systematic use of bacterial whole-genome sequencing (WGS) is enhancing the accuracy and resolution of epidemiological investigations carried ...

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Het meten van Caenorhabditis elegans Gevoeligheid voor de Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Onderzoek naar goedkope methoden om levensduur en gezondheid te meten in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Het meten van de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte bij Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

Analyse van transgenerationele epigenetische overerving in C. elegans met behulp van een fluorescerende reporter en chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...