Name: culture and assay of large-scale mixed-stage caenorhabditis elegans populations
Uploaded: 2021-05-05T14:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations at JoVE.com

אנו מודים לחברי מעבדת אדיסון על דיונים מועילים ומשוב על כתב יד זה; במיוחד, בי.M גרסיה. זנים מסוימים סופקו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH של תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440), ו CeNDR, אשר ממומן על ידי NSF Living אוספים CSBR 1930382. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מה-NIH (U2CES030167).

<ol>
	<li>F&#233;lix, M. A., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+history+of+Caenorhabditis+elegans.">The natural history of Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 20 (22), 965-969 (2010).</li><li>Corsi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+behaviour.">The genetics of behaviour.</a> British Medical Bulletin. 29 (3), 269-271 (1973).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).</li><li>Xiong, H., Pears, C., Woollard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+C.+elegans+based+platform+for+toxicity+assessment.">An enhanced C. elegans based platform for toxicity assessment.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9839 (2017).</li><li>Loer, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticle+integrity+and+biogenic+amine+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans+require+the+cofactor+tetrahydrobiopterin+(BH4).">Cuticle integrity and biogenic amine synthesis in Caenorhabditis elegans require the cofactor tetrahydrobiopterin (BH4).</a> Genetics. 200 (1), 237-253 (2015).</li><li>Li, Y., Paik, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+role+for+fatty+acid+biosynthesis+genes+during+molting+and+cuticle+formation+in+Caenorhabditis+elegans.">A potential role for fatty acid biosynthesis genes during molting and cuticle formation in Caenorhabditis elegans.</a> BMB Reports. 44 (4), 285-290 (2011).</li><li>Meli, V. S., Osuna, B., Ruvkun, G., Frand, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLT-10+Defines+a+Family+of+DUF644+and+Proline-rich+Repeat+Proteins+Involved+in+the+Molting+Cycle+of+Caenorhabditis+elegans.">MLT-10 Defines a Family of DUF644 and Proline-rich Repeat Proteins Involved in the Molting Cycle of Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1648-1661 (2010).</li><li>Fritz, J. A., Behm, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUTI-1:+A+novel+tetraspan+protein+involved+in+C.+elegans+CUTicle+formation+and+epithelial+integrity.">CUTI-1: A novel tetraspan protein involved in C. elegans CUTicle formation and epithelial integrity.</a> PloS One. 4 (4), 5117 (2009).</li><li>Golden, J., Riddle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218 (4572), 578-580 (1982).</li><li>Jeong, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+structure+and+biological+activity+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer-inducing+pheromone.">Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone.</a> Nature. 433 (7025), 541-545 (2005).</li><li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans.">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li><li>Kaplan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascaroside+Expression+in+Caenorhabditis+elegans+Is+Strongly+Dependent+on+Diet+and+Developmental+Stage.">Ascaroside Expression in Caenorhabditis elegans Is Strongly Dependent on Diet and Developmental Stage.</a> PLoS One. 6 (3), 17804 (2011).</li><li>Golden, J., Riddle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218 (4572), 578-580 (1982).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Variant+in+the+Neuropeptide+Receptor+npr-1+is+a+Major+Determinant+of+Caenorhabditis+elegans+Growth+and+Physiology.">A Variant in the Neuropeptide Receptor npr-1 is a Major Determinant of Caenorhabditis elegans Growth and Physiology.</a> PLoS Genetics. 10 (2), 1004156 (2014).</li><li>Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+limit+theorem+and+a+strong+mixing+condition.">A central limit theorem and a strong mixing condition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 42 (1), 43-47 (1956).</li><li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+in+developmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans as a model in developmental toxicology.</a> Methods in Molecular Biology. 889, 15-24 (2012).</li><li>Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Beads+Are+a+Versatile+Tool+for+Staging+Caenorhabditis+elegans+in+Different+Life+Histories.">Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories.</a> Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).</li><li>Denver, D. R., Morris, K., Streelman, J. T., Kim, S. K., Lynch, M., Thomas, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+consequences+of+mutation+and+natural+selection+in+Caenorhabditis+elegans.">The transcriptional consequences of mutation and natural selection in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (5), 544-548 (2005).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li><li>Kevin, S., Pulak, R., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Analysis,+Sorting,+and+Dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+Flow-Sorting+System.">Techniques for Analysis, Sorting, and Dispensing of C. elegans on the COPAS Flow-Sorting System.</a> C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+gene+flow+shape+niche-associated+variation+in+pheromone+response.">Selection and gene flow shape niche-associated variation in pheromone response.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 3 (10), 1455-1463 (2019).</li><li>Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeNDR,+the+Caenorhabditis+elegans+natural+diversity+resource.">CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource.</a> Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2016).</li><li>Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Beads+Are+a+Versatile+Tool+for+Staging+Caenorhabditis+elegans+in+Different+Life+Histories.">Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories.</a> Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מגוון רחב של כלי יכול לשמש LSCP. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בתבנית אפייה סטנדרטית מזכוכית. LSPCs בשימוש היו הממדים החיצוניים של 35.56 x 20.32 ס"מ, מידות פנימיות של 27.94 x 17.78 ס"מ, וכ 4.45 ס"מ עמוק והגיע עם מכסה מצויד. לכן, כמות החיידקים המשמשים כאן כבר אופטימיזציה עבור LSCP עם הממדים לעיל כדי להניב אוכלוסייה גדולה של תולעים מעורב שלב. ניתן להתאים נפח וריכוז חיידקיים כך שיתאימו לצרכים הניסיוניים.
זיהום על ידי עובש, פטריות, או מקורות חיידקיים אחרים יכולים להתרחש בכל שלב בשיטת LSCP, כך לטפל דגימות בזהירות. לפני תחילת כל שלב בפרוטוקול, ודא כי מרחב העבודה מנוקה עם 70% אתנול ו 10% אקונומיקה. אם זמין, לטפל באזורים משומשים עם אור UV במשך 30 דקות ולהדליק מסנן אוויר HEPA 30 דקות לפני תחילת כל שלב.
על ידי הגדלת LSCP בסביבה מבוקרת (כלומר,בחדר CT להגדיר ב 20 מעלות צלזיוס), המשתמש יכול בקלות רבה יותר לעקוב אחר הצמיחה של המדגם ולתעד זיהום פוטנציאלי. אם פני השטח של LSCP הופך מזוהם, או לחתוך את הזיהום כאשר הדבר אפשרי ולתת את המדגם להמשיך לגדול או להשליך את המדגם אם הזיהום אינו ניתן לשלוט. זה הכרחי כדי לטפל בזיהום במהירות כדי להפחית את הצמיחה לא רצויים כדי להבטיח שזה לא עולה תולעים עבור משאבים.
שיטה זו מיועדת למי שרוצה לגדל תרבויות אוכלוסייה מעורבת בקנה מידה גדול של C. elegans. למרות שזה עשוי להיות אפשרי לגדול אוכלוסיות מסונכרנות של תולעים על LSCP כפי שנעשה על מנות פטרי זמין מסחרית ובתרבות נוזלית, המחברים לא בדקו אפשרות זו. בנוסף, אם משתמשים רוצים לגדול יותר מ 2.4 מיליון תולעים בממוצע במדגם נתון, שיטה אחרת מומלץ4. הצלחת הצמיחה תלויה במתח המעובד בצנרת. המחברים הצליחו לגדל בהצלחה אוכלוסיות של כ -2.4 מיליון תולעים בלפחות חמישה משכפלים ביולוגיים של 15 זני אלגנס C. elegans, המציין כי השיטה היא חזקה.
לפני תחילת הניסוי לציין כי הגיל והבריאות של תולעת נתון יכול להשפיע על פוריות וזמן גידול האוכלוסייה הבאים. ודא כי תולעים נשמרים בתנאים בריאים עם מתח מינימלי לפני השימוש בצינור זה. ההנחה היא כי דגימות מלאי נוצרו, הוקפאו, ונשמרו ב -80 מעלות צלזיוס כדי להפחית את הסחף הגנטי לאורך זמן.
בהתאם לצרכים של ניסוי נתון, ניתן לשנות את מספר המבוגרים המתחילים ב- LSCP. שינוי מספר המבוגרים המתחילים ב- LSCP ישנה את קצב הגדילה ובכך הגיע הזמן לקצור. חמישה מבוגרים מסורבים משמשים לזרע כל LSCP מהסיבות הבאות: (1) דרך פשוטה, מהירה ויעילה לזרוע זנים רבים של C. elegans על LSCPs בבת אחת היה צורך ו (2) כדי להפחית את פערי הגילאים בין המבוגרים gravid הרים שיכול להוביל הטרוגניות הצמיחה.
שיטה זו מאפשרת למשתמש לקצור אוכלוסיות גדולות של תולעים עם כל שלבי מחזור החיים הנוכחיים. עם השיטות הנוכחיות הזמינות, איסוף דגימות בקנה מידה גדול של C. elegans דורש סנכרון אקונומיקה כדי להשיג את מספר התולעים הרצוי לעבודה במורד הזרם. בהתחשב בגישה זו, ניתן כעת לגדל תולעים רבות ככל האפשר בתסיסה או בתרבויות נוזליות בקנה מידה גדול ללא הקשיים הקשורים לסנכרון אקונומיקה ושלבי טיפול מרובים. הפרוטוקול שלנו מאפשר למקד זנים של עניין ביעילות, להשתמש בזמן טיפול מינימלי בגידול המדגם עצמו, ולבודד שלבים של תולעים או האוכלוסייה לפי הצורך בצינורות במורד הזרם.
LPFC שימש ככלי לתיעוד התפלגות האוכלוסיה וגודלה ב- LSCP נתון. ה- LPFC המשמשת היא מערכת זרימה רציפה המנתחת, ממיינת ומחלקת תולעים בהתבסס על גודלן (TOF) וצפיפותן האופטית. כאשר תולעת נתונה עוברת דרך תא הזרימה, גלאי אובדן האור הצירי לוכד את כמות אור האות החסום על ידי לייזר מצב מוצק של 488 ננומטר למשך הזמן שלוקח לתולעת לעבור, מה שמעניק למשתמש את ה- TOF ואת הצפיפות האופטית של התולעת. ניתן גם להשתמש באיסוף פלואורסצנטיות של אופטיקה וגלאים כדי למקסם את הרגישות לפלואורסצנטיות ולאיסוף על כל דגימה. פרמטרי אוסף LPFC ישתנו בהתאם למכשיר. משתמשים יכולים להשתמש במגוון פלטפורמות כדי ללכוד גודל תולעת ואינם מוגבלים לשימוש בפרוטוקול זה אם LPFC אינו זמין.
המחברים משתמשים בדגימות הגדלות בשיטה המתוארת כאן כדי לזהות מטבוליטים לא ידועים בזנים שונים של C. elegans באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית – ספקטרומטריית מסה, ספקטרוסקופיית NMR, רצף RNA. המחברים מתכננים להמשיך להשתמש בשיטה זו לצמיחה של דגימות בצינור זה עם מגוון של C. elegans זנים כמו זנים חדשים של עניין ניתן לעבד בקלות באמצעות צינור זה.

C. elegans הוא נמטודה קטנה וחיה חופשית שנמצאת ברחבי העולם במגוון בתי גידול טבעיים1. קלות הצמיחה היחסית שלה, זמן הייצור המהיר, מערכת הרבייה והגוף השקוף הופכים אותה לאורגניזם מודל רב עוצמה שנחקר רבות בביולוגיה התפתחותית, הזדקנות, נוירוביולוגיה וגנטיקה2,3. העבודה השופעת על C. elegans הופכת אותו למועמד עיקרי להשתמש במחקרים -omics לקשר באופן מקיף פנוטיפים עם רכיבים ביולוגיים מורכבים ואת מערכות היחסים שלהם באורגניזם נתון.
כדי להשתמש ב- C. elegans במחקר שיתופי-omics, יש צורך בשיטה כדי ליצור אוכלוסיות מעורבות גדולות של בעלי חיים שבהן ניתן לפצל מדגם יחיד ולהשתמש בו בפלטפורמות ובכלים מגוונים לניתוחים השוואתיים. יצירת צינור כדי ליצור מדגם כזה דורש מודעות חדה של דיאטה, סביבה, מתח, מבנה האוכלוסייה, טיפול מדגם ואיסוף. לכן, חיוני לשלב תנאי פולחן סטנדרטיים וניתן לשחזור בצינורות בקנה מידה גדול. במחקר C. elegans, שתי שיטות מסורתיות משמשות תולעי תרבות - מנות אגר פטרי ותרבות נוזלית4.
מבחינה היסטורית, כאשר יש צורך בכמויות גדולות של C. elegans, הם גדלים בתרבות נוזלית4. השלבים הכרוכים ביצירת אוכלוסייה גדולה של תולעים בתרבות הנוזלית דורשים צעדי טיפול מרובים הכוללים לעתים קרובות סנכרון אקונומיקה לקרע קוטיקלים למבוגרים, שחרור עוברים כדי להשיג את גודל האוכלוסייה הרצוי. עם זאת, כאשר נעשה שימוש בסנכרון אקונומיקה, גידול האוכלוסייה תלוי בגודל מפקד האוכלוסין ההתחלתי, ולכן משפיע על הגידול הבא ועל מספרי האוכלוסייה. בנוסף, זני C. elegans משתנים ברגישותם לקוטיקלים, זמן החשיפה ותגובת הלחץ לסנכרון אקונומיקה ומקשה על בדיקת זנים רבים בכל פעם5,6,7,8,9.
בנוסף, צמיחת תולעים בתרבות הנוזלית דורשת כמה שלבי העברה שכן לעתים קרובות מומלץ לגדל רק דור אחד של תולעים לפני הקציר כי צפיפות יכולה להתרחש בקלות אם גדל במשך דורות רבים ולהוביל היווצרות דאור למרות נוכחותו של מזון10. היווצרות דאואר מתרחשת באמצעות מולקולות איתות קטנות כגון ascarosides, המכונה לעתים קרובות "dauer פרומונים"11,12,13,14, משתחררים לתוך התקשורת הנוזלית להשפיע על הגידול של האוכלוסייה. יתר על כן, גידול אוכלוסיות תולעים גדולות בתרבות הנוזלית מוביל להצטברות חיידקים עודפת בתרבות, ויוצר קשיים כאשר יש צורך במדגם נקי למטעני פנוטיפים במורד הזרם. לבסוף, כאשר תרבות נוזלית הופכת מזוהמת, קשה יותר לשמור כמו נבגים פטרייתיים או תאים חיידקיים מפוזרים בקלות ברחבי התקשורת15.
השיטה המסורתית האחרת של גידול C. elegans היא על מנות אגר פטרי. מנות פטרי הזמינות מסחרית מאפשרות לגדל בקלות דורות רבים של תולעים מעורבות ללא ההשפעות המהירות של צפיפות יתר ויצירת דאואר גבוהה כפי שניתן לראות בתרבויות נוזליות. עם זאת, חיסרון לגידול תולעים על מנות אגר פטרי מסורתיות הוא כי צלחת פטרי זמינה מסחרית הגדולה ביותר אינה מניבה אוכלוסיות תולעים גדולות למחקר -omics מבלי להוסיף בשלב סנכרון אקונומיקה. לסיכום, יצירת אוכלוסיות מעורבות של C. elegans על מנות אגר פטרי מתאימה יותר לאיסוף נתוני אומיקים, אך דרשנו שיטה ליצירת גדלי אוכלוסייה גדולים מאוד ללא פולחן נוזלי.
כאן, אנו מציגים שיטה לתרבות ולאסוף אוכלוסיות גדולות מעורב שלב C. elegans על צלחות תרבות בקנה מידה גדול (LSCP). איסוף דגימות דרך צינור זה מניב מספיק מדגם כדי לאסוף נתונים פנוטיפיים ואוכלוסייה, יחד עם כל הנתונים הדרושים לניסויים -omics (כלומר,גנומיקה, תעתיקים, פרוטאומיקה, ו metabolomics). בנוסף, שיטת LSCP דורשת מניפולציה מינימלית של בעלי החיים, פחות זמן הכנה למשתמש, מספקת בקרה סביבתית הדוקה, ומבטיחה כי הטיפול בכל מדגם עקבי לאורך כל המחקר לשחזור הכולל.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Graduated Cylinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10124-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 Proof Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75804-654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75874-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>05040-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BVC Control G Fluid Aspiration System</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>449709-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3045-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox Bleach</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89414-502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conviron Control Temperature Room</td>
			<td>Conviron</td>
			<td></td>
			<td>https://www.conviron.com/environmental-rooms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89089-866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Scientific Accuspin 3R</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-Bottom 24-Well Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29443-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft.</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>204390560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT115 E. coli (DE3)</td>
			<td>CGC</td>
			<td>HT115(DE3)</td>
			<td>https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470224-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Scale Culture Plate (LSCP)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1090948</td>
			<td>Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C86677-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Plain Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.11727.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Devices ImageXpress</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model Number:IXMConfocal</td>
			<td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin (10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6261-25MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (6 cm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Controller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-4180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0781-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasssium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P250-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Fluroscent Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19507-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>746398-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>111357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Gilson Pipette Set</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10002M, FA10004M, FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin (100mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Union Biometrica COPAS BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td>https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and assay of large-scale mixed-stage caenorhabditis elegans populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) היה ונשאר אורגניזם מודל בעל ערך ללמוד ביולוגיה התפתחותית, הזדקנות, נוירוביולוגיה, וגנטיקה. גוף העבודה הגדול על C. elegans הופך אותו למועמד אידיאלי להשתלב באוכלוסיה גדולה, מחקרים בבעלי חיים שלמים כדי לנתח את המרכיבים הביולוגיים המורכבים ואת היחסים שלהם עם אורגניזם אחר. על מנת להשתמש C. elegans במחקר שיתוף פעולה -omics, שיטה נדרשת כדי ליצור אוכלוסיות גדולות של בעלי חיים שבו מדגם אחד ניתן לפצל ו assayed על פני פלטפורמות מגוונות לניתוחים השוואתיים.
כאן, שיטה לתרבות ולאסוף אוכלוסיית C. elegans מעורבת בשפע על צלחת תרבות בקנה מידה גדול (LSCP) ונתונים פנוטיפיים הבאים מוצגים. צינור זה מניב מספר מספיק של בעלי חיים כדי לאסוף נתונים פנוטיפיים ואוכלוסייה, יחד עם כל הנתונים הדרושים לניסויים -omics (כלומר, גנומיקה, transcriptomics, פרוטאומיקה, ו metabolomics). בנוסף, שיטת LSCP דורשת מניפולציה מינימלית לבעלי החיים עצמם, פחות זמן הכנה למשתמש, מספקת בקרה סביבתית הדוקה, ומבטיחה כי הטיפול בכל מדגם עקבי לאורך כל המחקר לשחזור כולל. לבסוף, מוצגות שיטות לתיעוד גודל האוכלוסייה והתפלגות האוכלוסין של שלבי החיים של C. elegans ב- LSCP נתון.

צמיחה של C. elegans בשיטת LSCP מניבה בממוצע כ 2.4 מיליון תולעים בשלב מעורב לכל מדגם על פני 12.2 ימים. הצמיחה של C. elegans בשיטת LSCP מאפשרת למשתמשים ליצור אוכלוסיות מעורבות גדולות של C. elegans עם טיפול ומניפולציה מועטים של בעלי החיים, שהוא אידיאלי למחקרים בקנה מידה גדול -omics (איור 1). לאחר LSCP הפך מלא תולעים בוגרים, הגיע לגודל אוכלוסייה גדול, ויש לו חיידקים מינימליים עזבו, משתמשים יכולים לקצור ולהעריך את גודל האוכלוסייה. נקודה זו יכולה לשמש גם כבקרת איכות על-ידי הערכת האם האוכלוסייה מספיקה לשימוש בצינור -omics (איור 2). הדינמיקה של האוכלוסייה תלויה במתח עצמו, בהתנהגות המתח (כלומר,זנים מתחפרים נוטים להיות בעלי התאוששות תולעת נמוכה יותר), ובהצלחה בצמיחה (כלומר,זיהום). שיטת LSCP נבדקה על 15 זנים של C. elegans המכיל תערובת של מוטציות מרכז גנטיקה Caenorhabditis (CGC) ו Caenorhabditis elegans משאב גיוון טבעי (CeNDR) זנים פראיים25. גנוטיפים זן מתוארים בטבלה משלימה 3.
שיטת LSCP הניבה גדלי אוכלוסייה מכ-94,500 ל-9,290,000. גודל האוכלוסייה הממוצע בזן הייחוס, PD1074, ועל פני זנים היה כ-2.4 מיליון תולעים (איור 3). לא נמצאו הבדלים משמעותיים בגדלים המשוערים של האוכלוסייה בין זני C. elegans במהלך 12.2 ימי גידול LSCP בממוצע (איור 4). PD1074 LSCPs לקח בין 10 - 14 ימים לגדול לאוכלוסייה מעורבת מלאה בשלבים. זמן הצמיחה הממוצע על פני PD1074 היה 10 ימים. הזן הגדל האיטי ביותר גדל במשך 20 יום לכל היותר, והזן הגדל במהירות הגבוהה ביותר גדל למשך 10 ימים לפחות (איור 4).
לכן, באמצעות שיטת LSCP זו, משתמשים יכולים בקלות לשלב זנים חדשים של עניין לתוך מחקר עם ידע מועט של תזמון התפתחותי ומומחיות ברקע. שים לב כי זנים ופנוטיפים שיש לשמור על ידי קטיף, יש פגמים בהיתכנות, הם heterozygous, או יש פגמים בצמיחה לא יכול לעבוד טוב בצינור זה.
ציטומטריה של זרימת חלקיקים גדולה והדמיה של דגימות מאפשרת למשתמשים לתעד התפלגות אוכלוסין. ניתן להשתמש במגוון רחב של פלטפורמות למדידת גידול אוכלוסין מוצלח.
למדידות הניתנות לשחזור - אומיקים, חשוב לגדל תרבויות עקביות. המדדים של יכולת הרבייה של התרבות הם מספר התולעים והתפלגות גודל עקבית עבור זן נתון. אנו מראים את התפלגות המדגם עבור זן הייחוס, PD1074 – גרסה של זן N2 בריסטול המקורי, באמצעות תמונות מיקרוסקופ LPFC23,26 ומיקרו confocal כמו שליחים להצלחת הצמיחה. כאשר תולעים נמדדו משלב L1 דרך מבוגרים מסורבלים בהתפלגות LPFC (איור 5), ההדמיה העוקבת (איור 6), והשונות בהתפלגות האוכלוסייה על פני דגימות (איור 7), אנו יכולים לראות שהצינור הזה יצר אוכלוסייה מעורבת של C. elegans.
כדי לבחון מקרוב את התפלגות האוכלוסין של הדגימות המעורבות שלנו, בחנו את ההתפלגות של 35 PD1074 LSCPs על ידי התבוננות באחוז התולעים הנופלות בתוך כל אזור לאורך כל התפלגות זמן הטיסה (TOF)(כלומר,אורך הגוף)(איור 7A,B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig01.jpg"> איור 1: מבט כולל על צינור הצמיחה של תולעת LSCP. (A)לאחר שהתקבל במעבדה, כל הזנים הוכנו וקפאו לאחסון לטווח ארוך ב -80 מעלות צלזיוס2. צלחת"נתח ראשי" הוכנה ממלאי תולעת קפואה ואחסנה ב-15 מעלות צלזיוס לשימוש לא יותר מחודש. (C)כל מדגם עבר ארבעה שלבי קיבוץ רצופים כדי להפחית את הלחץ הדורי לפני שגדל על LSCP. (D)5 מבוגרים גראביד בודדים נבחרו מתוך "נתח 4" 6 ס"מ צלחת צעד (D) ו נקודה מולבן על חמישה אזורים נתון של LSCP. LSCPהוצב בחדר טמפרטורה מבוקר וגדל ב 20 °C (70 °F) עד LSCP היה מלא תולעים בוגרים, הגיע לגודל אוכלוסייה גדולה, היו חיידקים מינימליים עזבו. (ו)אוכלוסיית התולעים נקצרה ונאספה למדרגות במורד הזרם. (G)Aliquots נוצרו מן LSCP היו פלאש קפוא עבור יישומים הרצוי במורד הזרם הרצוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig02.jpg"> איור 2: מבט כולל על קצירת LSCP והערכת גודל האוכלוסייה. 50מ"ל של M9 שימשו לשטיפת תולעים מפני השטח של NGMA. השעיית תולעת הוכנסה לצינור חרוט של 50 מ"ל. שלב (א)) חזר על עצמו פעמיים. (B)15 מ"ל של השעיית תולעת נשפך לתוך צינור חרוט חדש 15 מ"ל. תולעים נטרפו על ידי צנטריפוגות. M9 + פסולת היו שאיפה את מבלי להפריע גלולה תולעת. שלב (B) חזר על עצמו עד שנאספו כל 150 מ"ל של השעיית תולעת. גלולתהתולעת נשטפה וצנטריפוגה שלוש פעמים עם M9 כדי לחסל את הפסולת שנותרה. לאחר שהדגימה הייתה נקייה, גלולת התולעת נעשה שימוש חוזר ב 10 מ"ל של ddH2O. (D) דילול סדרתי של המדגם נוצר כדי להעריך את גודל אוכלוסיית התולעת. נעשה שימוש מדויק במקדם הדילול שאיפשר לספור תולעים במדויק. גורמי הדילול בהם נעשה שימוש השתנו בהתאם לגודל האוכלוסיה של ה- LSCP. (ה)לאחר שנבחרו גורמי הדילול, כל התולעים מכל שלושת השכפולים של הדילול הועברו למגלשה נקייה ותולעים נספרו תחת מיקרוסקופ מנתח. (ו)המדגם חולק ל aliquots בגודל המתאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig03.jpg"> איור 3: שיטת LSCP יצרה בממוצע אוכלוסייה של 2.4 מיליון תולעים מעורבות. LSCP מניב גדלי אוכלוסייה באוכלוסייה הקטנה ביותר גדל בסביבות 94,500 ובגידול האוכלוסייה הגדול ביותר בסביבות 9,290,000. גודל האוכלוסייה הממוצע בכל הזנים היה 2.4 מיליון תולעים. פסים מתחת לשמות הזנים C. elegans מציינים אם זן הוא מוטציה CGC או בידוד טבעי CeNDR. גודל דגימת LSCP מוצג עבור כל זן. בוצעו השוואות עבור כל הזוגות באמצעות בדיקת HSD של Tukey. לא נצפו הבדלים משמעותיים בין גודל האוכלוסייה המשוער על פני זני C. elegans (F(14,108) = 0.7, p = 0.77). פסים צבעוניים מציינים צגי צבע סטנדרטיים לייצוג זן C. elegans בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig04.jpg"> איור 4: שיטת LSCP יצרה אוכלוסיות מעורבות גדולות של תולעים ב-10 עד 20 יום. נתון C. elegans LSCP גדל עד המדגם היה מלא תולעים בוגרות, הגיע לגודל אוכלוסייה גדול, והיה מדשאה חיידקית מינימלית עזב. LSCPs לקח בין 10 – 20 ימים לגדול לאוכלוסייה מעורבת מלאה בשלבים, בהתאם למתח. זמן הצמיחה הממוצע על פני הזנים היה 12.2 ימים. גודל דגימת LSCP מוצג עבור כל זן. כל קו שגיאה נבנה באמצעות סטיית תקן אחת מהתו הממוצע. רמות שאינן מחוברות באמצעות אותה אות שונות באופן משמעותי. השוואות לכל הזוגות באמצעות בדיקת HSD של Tukey. הבדל משמעותי נמצא בכמות זמן הצמיחה על LSCP הדרוש על פני זני C. elegans (F(14,108) = 8.8, p < 0.0001 *). פסים צבעוניים מציינים צגי צבע סטנדרטיים לייצוג זן C. elegans בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2.jpg"> איור 5: מדידת אוכלוסייה מעורבת וצמיחה של זן הייחוס מסוג בר, PD1074. התפלגות LPFC מייצגת של צמיחת LSCP אחת של זן הייחוס מסוג פראי, גרסה של זן N2 בריסטול המקורי, (PD1074) מתעדת את התפלגות הגודל וספירת האירועים של אוכלוסייה מעורבת. ציר ה- x מציג את האורך (זמן טיסה, TOF) של התולעים הממוינות. ציר y מציג את הצפיפות האופטית (הכחדה אופטית, EXT) של התולעים הממוינות. כל נקודת נתונים היא תולעת שתועדה במדגם. כל אזור TOF ששימש לניתוח תמונה מוצג בצבע שונה. עשרים אזורי TOF נוצרו (R2 – R21) החל TOF של 50 עד 2050. פרטים על כל אזור TOF ניתן למצוא בטבלה משלימה 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig06.jpg"> איור 6: תמונות של תולעים ממוינות מאזורי TOF החל מ- R2 – R12 מציגות את התפלגות ה- PD1074 LPFC. באזור R2, תולעי L1 ניתן לזהות ובאזור R9 בעיקר מבוגרים gravid מזוהים, פורש את שני קיצוניים זחל התפתחותי נותן לנו אזורים משוער בתוך התפלגות ציטומטר זרימה של איפה השלבים צפויים בהתפלגות. סרגל קנה המידה מייצג 1 מ"מ. תמונות מייצגות צולמו מהתפלגות LPFC המוצגת באיור 5, והתיבות הצבעוניות תואמות לאזורים מאיור 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig07.jpg"> איור 7: התפלגות אוכלוסין לאורך זמן הטיסה (TOF) באזורים בזן הייחוס מסוג בר, PD1074. התפלגות התולעים בכל אזור TOF המציגה את האזורים שבהם נמצאו תולעים. כל PD1074 LSCP מיוצג כצבע בודד. (A) ציר ה- x מציג את עשרים אזורי TOF (R2 - R21) שנצפו ונספרו עבור LSCP, ומציגים את התפלגות הגודל כולה. ציר y מראה את אחוז התולעים מ LSCP נתון שהיה לו גודל גוף שנפל לאזור TOF נתון. (B) כאשר חלק קטן יותר מאוכלוסיית התולעים נופל בין אזורי R7-R21, יומן הרישום של אחוז התולעים שנפלו בתוך כל אזור נלקח כדי להציג את התפלגות האוכלוסייה. ציר ה- x מציג את אזורי ה- TOF R7-R21. ציר y מציג את יומן הרישום של אחוז התולעים מ- LSCP נתון בעל גודל גוף שנפל לאזור TOF נתון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig07large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים 1: טמפרטורה יומית ממוצעת (°C) של תנאי גדילה שבהם LSCP גדל וטופל. הטמפרטורות המדווחות של חדר הטמפרטורה המבוקרת (CT) תועדו ונאספו לאורך שישה חודשים של צמיחה ואיסוף מדגם. הטמפרטורה היומית הממוצעת מדווחת כאן. לא נצפו הבדלים משמעותיים בין הטמפרטורה שבה גדל ה- LCSP במהלך הפרויקט (F(5,24) = 2.59, p = 0.0524). הפרש הטמפרטורה כולו השתרע על פני לא יותר מ 0.003 °C (6 °F) לאורך שישה חודשים של צמיחה מדגם ויצירת. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453supfig01.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.</a>
טבלה משלימה 1: אזורים מגודרים TOF המשמשים למיון תולעים ללוחות 384 באר להדמיה. אזורים מאוחסנים נוצרו כדי להשתרע על פני TOF של 100 על פני כל התפלגות TOF מ 50 - 2050. ניתן לשנות אזורים מגודרים ולמטב אותם כך שיתאימו לצרכים שלך. כל אזור TOF ששימש לניתוח תמונה מוצג בצבע שונה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table1_FINAL.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה משלימה 2: תבנית צלחת של 384 באר של אזורי TOF ופריסת שכפול. כל דגימה מוינתה ללוח של 384 באר להדמיה. ארבעה שכפולים נוצרו עבור כל אזור שנבחר למיון. ניתן לשנות אזורים מגודרים ולמטב אותם כך שיתאימו לצרכים שלך. ראה טבלה משלימה 1 לקבלת אזורים מגודרים ספציפיים שנוצרו ושימשו בפרוטוקול זה. כל אזור TOF ששימש לניתוח תמונה מוצג בצבע שונה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table2_FINAL.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה משלימה 3: C. זני אלגנס המשמשים בפרוטוקול זה מכילים תערובת של זנים CGC ו- CeNDR. הזן, הגנוטיפ, מקור המתח והפרטים מתוארים בטבלה זו. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table3_FINAL.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations at JoVE.com

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

כדי להשתמש ב- Caenorhabditis elegans (C. elegans) במחקר omics, יש צורך בשיטה כדי ליצור אוכלוסיות גדולות של תולעים שבהן ניתן למדוד מדגם יחיד על פני פלטפורמות לניתוחים השוואתיים. כאן מוצגת שיטה לתרבות C. elegans אוכלוסיות על לוחות תרבות בקנה מידה גדול (LSCPs) ולתעד את גידול האוכלוסייה.

תרבות ו Assay של בקנה מידה גדול מעורב שלב Caenorhabditis אוכלוסיות אלגנים

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

טכניקה זו מאפשרת לנו לאסוף אוכלוסיות תולעים בקנה מידה גדול כדי לשמש פלטפורמות omics מרובים עם מניפולציה מינימלית. טכניקה זו מאפשרת לנו לאסוף אוכלוסיות C.elegans בשלב מעורב על פני ניסויים omics מרובים כדי לקבל תמונה הוליסטית של כל מדגם. להלבנת כתמים של מבוגרים מגושמים על צלחות תרבות בקנה מידה גדול, להבה תולעת לבחור מעל מבער Bunsen ולהשתמש בבחירה כדי לגרוף E.coli טרי מקצה מדשאת החיידקים על צלחת תרבות בקנה מידה גדול.בחרו מבוגר אחד מהצלחת הרביעית להלבנת כתמים והוסיפו חמישה מיקרוליטרים של פתרון היפוכלוריט אלקליין שהוכן זה עתה לפינה אחת של צלחת התרבות בקנה מידה גדול הרחק ממדשאת אי קולי. מניחים את המבוגר gravid לתוך הפתרון hypochlorite אלקליין ולהקיש על nematode כדי לשבש את הקוטיקל ולשחרר ביצים. כאשר בסך הכל חמישה מבוגרים הוצבו באופן שווה סביב מדשאת E.coli באותו אופן, מניחים את המכסה בחזרה על הצלחת.כדי לקצור דגימות מצלחות תרבות בקנה מידה גדול, יוצקים 50 מיליליטר של פתרון M9 על משטח צלחת תרבות בקנה מידה גדול אחד מערבלים את הצלחת כדי להבטיח כי M9 מכסה את כל משטח צמיחה נמטודה בינוני agarose. ראש פיפטה סרולוגית סטרילית עם M9 ולהטות את הצלחת כך M9 ואוכלוסיית התולעת לאסוף בפינה אחת של הצלחת. השתמש פיפטה מוכן לשאוף את השעיית התולעת ולהוסיף את התולעים לצינור חרוט 50 מיליליטר.מניחים את הצינור על נדנדה כדי לשבש את כל גושים חיידקיים ופסולת. כאשר כל התולעים נאספו מכל שלוש הצלחות, להעביר 15 מיליליטר של תולעים מכל צינור לתוך כל אחד משלושה צינורות חרוט 15 מיליליטר ומשקעים התולעים בצינורות על ידי צנטריפוגה. בזהירות לשאוף את supernatants מבלי להפריע כדורי תולעת ולהוסיף 13 מיליליטר של השעיית תולעת לכל צינור.הפוך את הצינורות כדי resuspend כדורי לשטוף כמה שיותר חיידקים ופסולת ככל האפשר צנטריפוגה התולעים שוב. כאשר כל אוכלוסיית תולעים נאספה, לשטוף את כדורי התולעת שלוש פעמים ב 10 מיליליטר של פתרון M9 טרי לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, resuspend כל גלולה תולעת ניקה ב 10 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים.להערכת גודל האוכלוסייה, לדלל במהירות שלושה 100 aliquots microliter של מדגם תולעת מכל צינור ב 900 microliters של פתרון M9 לכל מדגם ולהשתמש aliquots לעשות דילול סדרתי. מניחים את ההשעיות מדגם תולעת מלאי על נדנדה לתנועה רציפה של התרבויות בעוד aliquots נספרים ומערבבים את דילול התולעת עד שהם הומוגניים. הוסף חמישה מיקרוליטרים של פתרון מהראשון עד 10 דגימת תולעת למגלשת מיקרוסקופ זכוכית ולספור את התולעים על ידי מיקרוסקופ אור.אם יש פחות מ-50 תולעים במדגם, ספור את הדילולים של 1:100 ו-1:1, 000. אם יש יותר מ-50 תולעים, עבור לדילול הסדרתי הבא. לאחר ספירת כל שכפול aliquot של כל דילול שלוש פעמים, ממוצע ספירת הדילול כדי לקבוע את גודל האוכלוסייה המשוער של התולעת.ואז לפצל את דגימות התולעת לתוך aliquots ניסיוני המתאים פלאש להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי עבור מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון. כדי להכין דגימת תולעת עבור cytometry זרימת חלקיקים גדולים, לדלל כחמש פעמים 10 אל aliquot תולעת השלב המעורב הרביעי לנפח סופי של 10 מיליליטר של פתרון M9 ולהוסיף 200 microliters של מיליגרם אחד מיליליטר E.coli ו 1:50 דילול של 0.5 מיקרומולאר אדום פלואורסצנטי פתרון לתולעת. לאחר דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה, לאסוף את התולעים והמיקרוספרות על ידי צנטריפוגה ולשטוף את התולעים פעמיים עם פתרון M9 טרי כדי להסיר כל חיידקים עודפים מיקרוספרות לא אינטרנליין.לאחר הכביסה השנייה, resuspend גלולה בחמישה מיליליטר של פתרון M9. אם גלולה נראה נקי, להוסיף חמישה מיליליטר של M9 בתוספת 50 מילימולאר נתרן אזיד לתולעים ומניחים את הצינור על נדנדה הן ליישר המתת התולעים לספירה מדויקת וגודל. לתיעוד התפלגות האוכלוסין, פתחו את תבנית הלוח המכוילת של 384 באר והגדירו את התבנית לחלק 20 אובייקטים מגודרים לארבע בארות כדי להשיג ארבעה שכפולים טכניים של כל אזור מגודר עבור כל אחד מ- 20 אזורי מייצגי המידה של המדגם.לטעון מדגם 40 מיליליטר של תולעים על cytometer זרימת החלקיקים הגדולים ולהתחיל באופן אוטומטי למיין את המדגם תוך ערבוב מתמשך של המדגם כדי למנוע התיישבות ובמקביל לחלק חפצים מן המדגם לתוך צלחת 384-well מכויל. לאחר המדגם כולו כבר ממוין ואת המספר המרבי של אזורים מגודרים חולקו לתוך צלחת 384-well, להסיר את המדגם מן cytometer ולנקות את המכשיר. שיטת צלחת התרבות בקנה מידה גדול נבדקה על 15 זנים של C.Elegans, כולל תערובת של מוטציות מרכז גנטיקה Caenorhabditis ו Caenorhabditis elegans גיוון טבעי משאב זנים פראיים.בניתוח זה, שיטת צלחת התרבות בקנה מידה גדול הניבה גדלי אוכלוסייה מכ-94, 500 עד 9, 290, 000. גודל האוכלוסייה הממוצע בתוך זן הייחוס PD1074 ועל פני זנים היה כ 2.4 מיליון תולעים. לא נמצאו הבדלים משמעותיים בגדלים המשוערים של האוכלוסייה בין זנים C.elegans במהלך ממוצע של 12.2 ימי צמיחה צלחת תרבות בקנה מידה גדול.PD1074 צלחות תרבות בקנה מידה גדול לקח בין 10 ל 14 ימים לגדול לאוכלוסייה בשלב מעורב מלא עם זמן צמיחה ממוצע של 12.2 ימים. הזן הגדל האיטי ביותר גדל במשך מקסימום של 20 ימים ואת הזן הגדל במהירות הגבוהה ביותר גדל במשך מינימום של 10 ימים. בהתפלגות מדגם זו עבור PD1074, תולעים נמדדו משלב L1 דרך מבוגר gravid על סיטרומטר זרימת חלקיקים גדולה.הדמיה והדמיה עוקבות של הווריאציות בהתפלגות האוכלוסייה על פני דגימות גילו שהצינור יצר אוכלוסיית שלבים מעורבת של C.elegans. חשוב לספור במדויק את התולעים לאורך איסוף המדגם כך שתקבל נתונים דומים בין גידולים ומחקרים. ניתן ליישם גישת איסוף זו על רצף RNA, גנומיקה וניתוח אומיקים אחרים כדי להרחיב את הבנתנו את הדינמיקה המורכבת המתרחשת באוכלוסיות C.elegans.טכניקה זו מאפשרת לנו לאסוף אוכלוסיות C.elegans מבוימות מעורבות על פני ניסויים אומיקים מרובים כדי לקבל תמונה הוליסטית של כל מדגם.

Research

JoVE Journal

Genetics

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

ניטור מרחבי הפרדה Surface מיישבים אוכלוסיות מיקרוביאליות

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

פרוטוקול אוניברסלי עבור gRNA בקנה מידה גדול ספריית הפקה מכל מקור ה-DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

מניפולציה של פלואידיות ב Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

השיטה קבע עותק משוכפל: בגישה תפוקה גבוהה באופן כמותי מידה Caenorhabditis elegans תוחלת החיים

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Heuristic Mining of Hierarchical Genotypes and Accessory Genome Loci in Bacterial Populations

כרייה היוריסטית של גנוטיפים היררכיים וגושים של גנום עזר באוכלוסיות חיידקים

Routine and systematic use of bacterial whole-genome sequencing (WGS) is enhancing the accuracy and resolution of epidemiological investigations carried ...

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

מדידת רגישות Caenorhabditis elegans לקולטן אצטילכולין אגוניסט לבאמיזול

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב - Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

מדידת כדאיות עוברית וגודל הברוד ב- Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...