Name: culture and assay of large-scale mixed-stage caenorhabditis elegans populations
Uploaded: 2021-05-05T14:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations at JoVE.com

हम इस पांडुलिपि पर उपयोगी चर्चाओं और प्रतिक्रिया के लिए एडीसन लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं; विशेष रूप से, बी .M गार्सिया । सीजीसी द्वारा कुछ उपभेदों को प्रदान किया गया था, जिसे एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम्स (पी 40 ओडी010440) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, और सीईएनडीआर, जिसे एनएसएफ लिविंग कलेक्शन सीएसबीआर द्वारा वित्त पोषित किया जाता है 1930382। इस काम को एनआईएच (U2CES030167) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

एलएससीपी के रूप में विभिन्न प्रकार के जहाजों का उपयोग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में एक स्टैंडर्ड ग्लास बेकिंग डिश का इस्तेमाल किया गया। उपयोग में एलएसपीसी में 35.56 x 20.32 सेमी के बाहरी आयाम, 27.94 x 17.78 सेमी के आंतरिक आयाम, और लगभग 4.45 सेमी गहरे थे और एक फिट ढक्कन के साथ आए थे। इस प्रकार, यहां उपयोग किए जाने वाले बैक्टीरिया की मात्रा को मिश्रित चरण के कीड़े की एक बड़ी आबादी को उपज देने के लिए उपरोक्त आयामों के साथ एलएससीपी के लिए अनुकूलित किया गया है। प्रयोगात्मक जरूरतों को फिट करने के लिए बैक्टीरियल वॉल्यूम और एकाग्रता को समायोजित किया जा सकता है।
मोल्ड, कवक, या अन्य जीवाणु स्रोतों द्वारा संदूषण एलएससीपी विधि में किसी भी कदम पर हो सकता है, इसलिए देखभाल के साथ नमूनों को संभालें। प्रोटोकॉल में किसी भी कदम को शुरू करने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि काम करने की जगह 70% इथेनॉल और 10% ब्लीच के साथ साफ की गई है। यदि उपलब्ध है, तो 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ इस्तेमाल क्षेत्रों का इलाज करें और प्रत्येक चरण को शुरू करने से पहले हेपा एयर-फिल्टर 30 मिनट चालू करें।
एलएससीपी को नियंत्रित सेटिंग(यानी,20 डिग्री सेल्सियस पर सेट किए गए सीटी रूम में) में उगाकर, उपयोगकर्ता अधिक आसानी से नमूना और दस्तावेज़ संभावित संदूषण के विकास को ट्रैक कर सकता है। यदि एलएससीपी की सतह दूषित हो जाती है, तो या तो संभव होने पर संदूषण को काट दें और यदि संदूषण को नियंत्रित करना संभव नहीं है तो नमूना विकसित होता है या छोड़ने दें। अवांछित विकास को कम करने और यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह संसाधनों के लिए कीड़े को मात नहीं दे रहा है, संदूषण को जल्दी से संबोधित करना अनिवार्य है ।
यह विधि उन लोगों के लिए है जो सी एलिगेंस की बड़े पैमाने पर मिश्रित जनसंख्या संस्कृतियों को विकसित करना चाहते हैं। यद्यपि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पेट्री व्यंजनों और तरल संस्कृति पर किए गए एलएससीपी पर कीड़े की समकालिक आबादी विकसित करना संभव हो सकता है, लेखकों ने इस विकल्प का परीक्षण नहीं किया है। इसके अतिरिक्त, यदि उपयोगकर्ता किसी दिए गए नमूने में औसतन लगभग 2.4 मिलियन कीड़े से अधिक विकसित करना चाहते हैं, तो एक अलग विधि की सिफारिश की जाती है4। विकास की सफलता पाइपलाइन में संसाधित किए जा रहे तनाव पर निर्भर है । लेखक 15 सी एलिगेंस उपभेदों के कम से कम पांच जैविक प्रतिकृति में लगभग 2.4 मिलियन कीड़े की आबादी को सफलतापूर्वक विकसित करने में सक्षम थे, यह दर्शाता है कि विधि मजबूत है।
प्रयोग शुरू करने से पहले ध्यान दें कि किसी दिए गए कीड़े की उम्र और स्वास्थ्य fecundity और बाद में जनसंख्या वृद्धि के समय को प्रभावित कर सकता है। सुनिश्चित करें कि इस पाइपलाइन में उपयोग किए जाने से पहले न्यूनतम तनाव के साथ स्वस्थ परिस्थितियों में कीड़े बनाए रखे जाते हैं। यह माना जाता है कि समय के साथ आनुवंशिक बहाव को कम करने के लिए स्टॉक नमूने बनाए गए हैं, जमे हुए हैं, और -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया है।
किसी दिए गए प्रयोग की जरूरतों के आधार पर, एलएससीपी पर ग्रेविड वयस्कों की संख्या को बदला जा सकता है। एलएससीपी पर शुरू ग्रेविड वयस्कों की संख्या में फेरबदल विकास दर और इस तरह फसल के लिए समय बदल जाएगा । पांच ग्रेविड वयस्कों का उपयोग निम्नलिखित कारणों से प्रत्येक एलएससीपी को बीज देने के लिए किया जाता है: (1) एक समय में एलएससीपी पर कई सी एलिगेंस उपभेदों को बीज करने के लिए एक सरल, तेज और कुशल तरीका आवश्यक था और (2) ग्रेविड वयस्कों के बीच उम्र के अंतर को कम करने के लिए चुना गया है जो विकास विषमता का कारण बन सकता है।
यह विधि उपयोगकर्ता को सभी जीवन चक्र चरणों के साथ कीड़े की बड़ी आबादी को फसल करने की अनुमति देती है। वर्तमान तरीकों के उपलब्ध होने के साथ, सी एलिगेंस के बड़े पैमाने पर नमूनों को इकट्ठा करने के लिए डाउनस्ट्रीम काम के लिए वांछित कीड़े की संख्या प्राप्त करने के लिए ब्लीच सिंक्रोनाइजेशन की आवश्यकता होती है। इस दृष्टिकोण को देखते हुए, अब कोई भी ब्लीच सिंक्रोनाइजिंग और कई हैंडलिंग चरणों से जुड़ी कठिनाइयों के बिना किण्वितर या बड़े पैमाने पर तरल संस्कृतियों में पहले से संभव के रूप में कई कीड़े विकसित कर सकता है। हमारा प्रोटोकॉल किसी को ब्याज के उपभेदों को कुशलतापूर्वक लक्षित करने, नमूना खुद को बढ़ाने में न्यूनतम हैंडलिंग समय का उपयोग करने और डाउनस्ट्रीम पाइपलाइनों में आवश्यकतानुसार कीड़े या जनसंख्या के चरणों को अलग करने की अनुमति देता है।
एक एलपीएफसी का उपयोग एक दिए गए एलएससीपी में जनसंख्या वितरण और आकार को दस्तावेज करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया गया था। एलपीएफसी का उपयोग किया जाने वाला एक सतत प्रवाह प्रणाली है जो उनके आकार (TOF) और ऑप्टिकल घनत्व के आधार पर कीड़े का विश्लेषण, प्रकार और वितरण करती है। के रूप में एक दिया कृमि प्रवाह सेल के माध्यम से गुजरता है, अक्षीय प्रकाश हानि डिटेक्टर एक ४८८ एनएम ठोस राज्य लेजर द्वारा अवरुद्ध संकेत प्रकाश की मात्रा को समय की लंबाई के लिए यह एक कीड़ा के माध्यम से पारित करने के लिए लेता है, उपयोगकर्ता TOF और कीड़ा के ऑप्टिकल घनत्व दे रही है । फ्लोरेसेंस संग्रह प्रकाशिकी और डिटेक्टरों का उपयोग प्रत्येक नमूने पर फ्लोरेसेंस संवेदनशीलता और संग्रह को अधिकतम करने के लिए भी किया जा सकता है। एलपीएफसी संग्रह पैरामीटर उपकरण के आधार पर अलग-अलग होंगे। उपयोगकर्ता कृमि आकार को पकड़ने के लिए विभिन्न प्लेटफार्मों को नियोजित कर सकते हैं और यदि एलपीएफसी उपलब्ध नहीं है तो इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने तक सीमित नहीं हैं।
लेखक यहां वर्णित विधि में उगाए गए नमूनों का उपयोग कर रहे हैं ताकि तरल क्रोमेटोग्राफी के माध्यम से सी एलिगेंस के विभिन्न उपभेदों में अज्ञात मेटाबोलाइट्स की पहचान की जा सके - मास स्पेक्ट्रोमेट्री, एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी, और आरएनए अनुक्रमण। लेखकों को इस पाइपलाइन में नमूनों के विकास के लिए इस विधि का उपयोग जारी रखने की योजना है सी elegans उपभेदों की एक किस्म के साथ ब्याज के नए उपभेदों के रूप में आसानी से इस पाइपलाइन का उपयोग कर संसाधित किया जा सकता है ।

सी एलिगेंस एक छोटा सा मुक्त रहने वाला सूत्रकृमि है जो दुनिया भर में विभिन्न प्राकृतिक आवासों में पाया जाता है1। इसकी विकास में सापेक्ष आसानी, तेज पीढ़ी का समय, प्रजनन प्रणाली और पारदर्शी शरीर इसे एक शक्तिशाली मॉडल जीव बनाते हैं जिसका विकासात्मक जीवविज्ञान, उम्र बढ़ने, न्यूरोबायोलॉजी और जेनेटिक्स2,3में व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है। सी एलिगेंस पर प्रचुर काम यह एक प्रमुख उंमीदवार में उपयोग करने के लिए-omics अध्ययन व्यापक जटिल जैविक घटकों और एक दिए गए जीव में उनके संबंधों के साथ फेनोटाइप लिंक बनाता है ।
सहयोगी-ओमिक्स अनुसंधान में सी एलिगेंस का उपयोग करने के लिए, जानवरों की बड़ी मिश्रित चरण आबादी उत्पन्न करने के लिए एक विधि की आवश्यकता होती है जहां तुलनात्मक विश्लेषण के लिए विविध प्लेटफार्मों और उपकरणों में एक नमूना विभाजित और उपयोग किया जा सकता है। इस तरह के नमूने उत्पन्न करने के लिए एक पाइपलाइन बनाने के लिए आहार, पर्यावरण, तनाव, जनसंख्या संरचना, और नमूना हैंडलिंग और संग्रह के बारे में गहरी जागरूकता की आवश्यकता होती है। इसलिए, मानक और प्रजनन योग्य संस्कृति की स्थिति को बड़े पैमाने पर पाइपलाइनों में एकीकृत करना महत्वपूर्ण है। सी एलिगेंस रिसर्च में, दो पारंपरिक तरीकों का उपयोग कीड़े-एगर पेट्री व्यंजन और तरल संस्कृति 4 को संस्कृति के लिए कियाजाताहै ।
ऐतिहासिक रूप से, जब बड़ी मात्रा में सी एलिगेंस की आवश्यकता होती है, तो वे तरल संस्कृति4में उगाए जाते हैं। तरल संस्कृति में कीड़े की एक बड़ी आबादी पैदा करने में शामिल कदम कई हैंडलिंग कदम है कि अक्सर ग्रेविड वयस्क क्यूटिकल टूटना करने के लिए ब्लीच सिंक्रोनाइजेशन शामिल हैं, वांछित जनसंख्या आकार को प्राप्त करने के लिए भ्रूण जारी करने की आवश्यकता है । हालांकि, जब ब्लीच सिंक्रोनाइजेशन का उपयोग किया जाता है, तो जनसंख्या वृद्धि जनगणना के आकार को शुरू करने पर निर्भर करती है और इसलिए, बाद में वृद्धि और जनसंख्या संख्या को प्रभावित करती है। इसके अलावा, सी एलिगेंस उपभेदों को उनकी क्यूटिकल संवेदनशीलता, एक्सपोजर समय और ब्लीच सिंक्रोनाइजेशन के लिए तनाव प्रतिक्रिया में भिन्न होता है जिससे एक समय में कई उपभेदों को परखना मुश्किल हो जाता है5,6,7,8,9।
इसके अतिरिक्त, तरल संस्कृति में कृमि वृद्धि के लिए कुछ हस्तांतरण चरणों की आवश्यकता होती है क्योंकि अक्सर कटाई से पहले कीड़े की सिर्फ एक पीढ़ी बढ़ने की सिफारिश की जाती है क्योंकि भीड़ आसानी से हो सकती है यदि कई पीढ़ियों के लिए उगाया जाता है और भोजन10की उपस्थिति के बावजूद डायर गठन का कारण बन जाता है। दाऊर गठन छोटे सिग्नलिंग अणुओं जैसे एस्कारोसिड्स के माध्यम से होता है, जिसे अक्सर "दाऊर फेरोमोन" के रूप में जाना जाता है11,12,13,14,तरल मीडिया में जारी किए जाते हैं और जनसंख्या के विकास को प्रभावित करते हैं। इसके अलावा, तरल संस्कृति में बड़ी कृमि आबादी बढ़ने से संस्कृति में अतिरिक्त बैक्टीरिया संचय होता है, जिससे कठिनाइयां पैदा होती हैं जब डाउनस्ट्रीम फेनोटाइपिक परख के लिए एक साफ नमूने की आवश्यकता होती है। अंत में, जब एक तरल संस्कृति दूषित हो जाती है, तो फंगल बीजाणुओं या जीवाणु कोशिकाओं को आसानी से मीडिया में फैलाया जाता है15के रूप में बनाए रखना अधिक कठिन होता है।
सी एलिगेंस उगाने की अन्य पारंपरिक विधि आगर पेट्री व्यंजनों पर है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पेट्री व्यंजन तरल संस्कृतियों में देखे गए भीड़-भाड़ और उच्च दाऊर गठन के तेजी से प्रभाव के बिना मिश्रित चरण कीड़े की कई पीढ़ियों को आसानी से विकसित करने की अनुमति देते हैं। हालांकि, पारंपरिक एगर पेट्री व्यंजनों पर कृमि विकास के लिए एक नुकसान यह है कि सबसे बड़ा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पेट्री डिश ब्लीच सिंक्रोनाइजेशन चरण में जोड़ने के बिना-ओमिक्स अध्ययन के लिए बड़ी कृमि आबादी नहीं देती है। संक्षेप में, एगर पेट्री व्यंजनों पर सी एलिगेंस की मिश्रित चरण आबादी को इकट्ठा करने के लिए अधिक उपयुक्त है- ओमिक्स डेटा, लेकिन हमें तरल संस्कृति के बिना बहुत बड़ी जनसंख्या आकार उत्पन्न करने के लिए एक विधि की आवश्यकता होती है।
यहां, हम संस्कृति के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं और बड़े पैमाने पर संस्कृति प्लेटों (एलएससीपी) पर बड़े मिश्रित चरण सी एलिगेंस आबादी एकत्र करते हैं। इस पाइपलाइन के माध्यम से नमूने एकत्र करने से फेनोटाइपिक और जनसंख्या डेटा इकट्ठा करने के लिए पर्याप्त नमूना होता है, साथ ही-ओमिक्स प्रयोगों(यानीजीनोमिक्स, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स, प्रोटेओमिक्स और मेटाबोलोमिक्स) के लिए आवश्यक किसी भी डेटा के साथ। इसके अलावा, एलएससीपी विधि को जानवरों के न्यूनतम हेरफेर की आवश्यकता होती है, कम उपयोगकर्ता प्रस्तुत करने का समय, तंग पर्यावरणीय नियंत्रण प्रदान करता है, और यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक नमूने की हैंडलिंग समग्र प्रजनन क्षमता के लिए पूरे अध्ययन में सुसंगत है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Graduated Cylinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10124-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 Proof Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75804-654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75874-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>05040-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BVC Control G Fluid Aspiration System</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>449709-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3045-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox Bleach</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89414-502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conviron Control Temperature Room</td>
			<td>Conviron</td>
			<td></td>
			<td>https://www.conviron.com/environmental-rooms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89089-866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Scientific Accuspin 3R</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-Bottom 24-Well Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29443-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft.</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>204390560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT115 E. coli (DE3)</td>
			<td>CGC</td>
			<td>HT115(DE3)</td>
			<td>https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470224-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Scale Culture Plate (LSCP)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1090948</td>
			<td>Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C86677-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Plain Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.11727.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Devices ImageXpress</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model Number:IXMConfocal</td>
			<td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin (10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6261-25MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (6 cm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Controller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-4180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0781-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasssium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P250-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Fluroscent Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19507-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>746398-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>111357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Gilson Pipette Set</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10002M, FA10004M, FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin (100mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Union Biometrica COPAS BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td>https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and assay of large-scale mixed-stage caenorhabditis elegans populations

कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस (सी एलिगेंस)विकासात्मक जीव विज्ञान, उम्र बढ़ने, न्यूरोबायोलॉजी और आनुवंशिकी का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल जीव रहा है और बना हुआ है। सी एलिगेंस पर काम का बड़ा शरीर जटिल जैविक घटकों और किसी अन्य जीव के साथ उनके संबंधों को विच्छेदन करने के लिए बड़ी आबादी, पूरे पशु अध्ययनों में एकीकृत करने के लिए एक आदर्श उम्मीदवार बनाता है। सहयोगी-ओमिक्स अनुसंधान में सी एलिगेंस का उपयोग करने के लिए, जानवरों की बड़ी आबादी उत्पन्न करने के लिए एक विधि की आवश्यकता होती है जहां तुलनात्मक विश्लेषणों के लिए विविध प्लेटफार्मों पर एक नमूना विभाजित और परख किया जा सकता है।
यहां, संस्कृति के लिए एक विधि और एक बड़े पैमाने पर संस्कृति प्लेट (LSCP) और बाद में फेनोटाइपिक डेटा पर एक प्रचुर मात्रा में मिश्रित चरण सी elegans आबादी इकट्ठा प्रस्तुत किया है । यह पाइपलाइन फेनोटाइपिक और जनसंख्या डेटा एकत्र करने के लिए पर्याप्त संख्या में जानवरों की पैदावार करती है, साथ ही-ओमिक्स प्रयोगों (यानी जीनोमिक्स, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स, प्रोटेओमिक्स और मेटाबोलोमिक्स) के लिए आवश्यक किसी भी डेटा के साथ। इसके अलावा, एलएससीपी विधि को स्वयं जानवरों के लिए न्यूनतम हेरफेर की आवश्यकता होती है, कम उपयोगकर्ता तैयार करने का समय, तंग पर्यावरणीय नियंत्रण प्रदान करता है, और यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक नमूने की हैंडलिंग समग्र प्रजनन क्षमता के लिए पूरे अध्ययन में सुसंगत है। अंत में, किसी दिए गए एलएससीपी में सी एलिगेंस लाइफ चरणों के जनसंख्या आकार और जनसंख्या वितरण को दस्तावेज करने के तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं ।

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Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

ओमिक्स अनुसंधान में कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस (सी एलिगेंस)का उपयोग करने के लिए, कीड़े की बड़ी आबादी उत्पन्न करने के लिए एक विधि की आवश्यकता होती है जहां तुलनात्मक विश्लेषण के लिए प्लेटफार्मों पर एक नमूना मापा जा सकता है। यहां, बड़े पैमाने पर संस्कृति प्लेटों (LSCPs) पर सी elegans आबादी संस्कृति के लिए एक विधि प्रस्तुत की है ।

संस्कृति और बड़े पैमाने पर मिश्रित मंच Caenorhabditis elegans आबादी की परख

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

यह तकनीक हमें कम से कम हेरफेर के साथ कई ओमिक्स प्लेटफार्मों के लिए उपयोग की जाने वाली बड़े पैमाने पर कृमि आबादी को इकट्ठा करने की अनुमति देती है। यह तकनीक हमें प्रत्येक नमूने की एक समग्र तस्वीर प्राप्त करने के लिए कई ओमिक्स प्रयोगों में मिश्रित चरण C.elegans आबादी एकत्र करने की अनुमति देती है। बड़े पैमाने पर संस्कृति प्लेटों पर ग्रेविड वयस्कों की जगह विरंजन के लिए, एक कीड़ा एक Bunsen बर्नर पर लेने की लौ और एक बड़े पैमाने पर संस्कृति प्लेट पर जीवाणु लॉन के किनारे से ताजा ई. कोलाई स्कूप करने के लिए लेने का उपयोग करें ।स्पॉट ब्लीचिंग के लिए चौथे हिस्से की प्लेट से एक भी ग्रेविड वयस्क चुनें और ई. कोलाई लॉन से दूर बड़े पैमाने पर संस्कृति प्लेट के एक कोने में हौसले से तैयार क्षारीय हाइपोक्लोराइट समाधान के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें। ग्रेविड वयस्क को क्षारीय हाइपोक्लोराइट समाधान में रखें और क्यूटिकल को बाधित करने और अंडे छोड़ने के लिए नेमाटोड पर टैप करें। जब पांच वयस्कों की कुल एक ही तरीके से ई. कोलाई लॉन के आसपास समान रूप से रखा गया है, ढक्कन वापस थाली पर जगह है ।बड़े पैमाने पर संस्कृति प्लेटों से नमूनों की कटाई के लिए, एक बड़े पैमाने पर संस्कृति प्लेट सतह पर M9 समाधान के ५० मिलीलीटर डालना और थाली भंवर को सुनिश्चित करने के लिए कि M9 पूरे सूत्रकृमि विकास मध्यम agarose सतह को शामिल किया गया । प्रधानमंत्री M9 के साथ एक बाँझ सीरोलॉजिकल पिपेट और थाली झुकाव इतना है कि M9 और कीड़ा आबादी थाली के एक कोने में इकट्ठा । कीड़े निलंबन को आकांक्षी करने के लिए प्राइमेड पिपेट का उपयोग करें और 50 मिलीलीटर शंकुवा ट्यूब में कीड़े जोड़ें।किसी भी बैक्टीरियल झुरमुट और मलबे को बाधित करने के लिए ट्यूब को एक घुमाव पर रखें। जब सभी कीड़े सभी तीन प्लेटों से एकत्र किए गए हैं, तो प्रत्येक ट्यूब से 15 मिलीलीटर कीड़े को तीन 15 मिलीलीटर शंकु नलियों में स्थानांतरित करें और अपकेंद्रित्र द्वारा ट्यूबों में कीड़े को तलछट दें। कृमि छर्रों को परेशान किए बिना सुपरनेटेंट को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें और प्रत्येक ट्यूब में 13 मिलीलीटर कृमि निलंबन जोड़ें।छर्रों को फिर से खर्च करने और जितना संभव हो सके उतना बैक्टीरिया और मलबे को धोने और कीड़े को फिर से अपकाइज करने के लिए ट्यूबों को उलटें। जब प्रत्येक पूरी कृमि आबादी एकत्र की गई है, तो प्रति वॉश ताजा M9 समाधान के 10 मिलीलीटर में तीन बार कीड़ा छर्रों को धोएं। अंतिम धोने के बाद, डबल आसुत पानी के 10 मिलीलीटर में प्रत्येक साफ कृमि गोली को फिर से खर्च करें।जनसंख्या के आकार के अनुमान के लिए, प्रति सैंपल M9 समाधान के 900 माइक्रोलीटर में प्रत्येक ट्यूब से वर्म सैंपल के तीन 100 माइक्रोलीटर एलिकोट्स को जल्दी से पतला करें और सीरियल कमजोर करने के लिए एलिकोट्स का उपयोग करें। संस्कृतियों के निरंतर आंदोलन के लिए एक घुमाव पर स्टॉक कृमि नमूना निलंबन रखें, जबकि aliquots गिना जा रहा है और कीड़ा कमजोर पड़ने मिश्रण जब तक वे सजातीय हैं । एक ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए पहले एक से 10 कीड़े के नमूने से समाधान के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें और हल्के माइक्रोस्कोपी द्वारा कीड़े गिनती ।यदि नमूने में 50 से कम कीड़े हैं, तो 1:100 और 1:1, 000 कमजोर पड़ने की गणना करें। अगर 50 से ज्यादा कीड़े हैं तो अगले सीरियल तनुज की ओर बढ़ें। प्रत्येक कमजोर पड़ने के प्रत्येक aliquot दोहराने की तीन बार गिनती के बाद, औसत कमजोर पड़ने कीड़े की अनुमानित जनसंख्या आकार निर्धारित करने के लिए मायने रखता है ।फिर कृमि के नमूनों को उचित प्रायोगिक aliquots में विभाजित करें और तरल नाइट्रोजन में नमूनों को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस भंडारण के लिए फ्लैश फ्रीज करें। बड़े कण प्रवाह साइटोमेट्री के लिए एक कीड़े का नमूना तैयार करने के लिए, एम9 समाधान के 10 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में चौथे मिश्रित चरण कृमि एलिकोट में लगभग पांच गुना 10 गुना पतला करें और एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर ई.कोलाई के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें और 0.5 माइक्रोमोलर रेड फ्लोरोसेंट माइक्रोशेरेप समाधान के 1:50 कमजोर पड़ने को जोड़ें। कमाल के साथ कमरे के तापमान पर 20 मिनट की इनक्यूबेशन के बाद, अपकेंद्रित्र द्वारा कीड़े और माइक्रोस्फीयर एकत्र करें और किसी भी अतिरिक्त बैक्टीरिया और अनइंटरनेलाइज्ड माइक्रोस्फीयर को हटाने के लिए ताजा M9 समाधान के साथ दो बार कीड़े धोएं।दूसरी धुलाई के बाद, M9 समाधान के पांच मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। यदि गोली साफ दिखती है, तो कीड़े में 50 मिलीमोलर सोडियम अज़ाइड के साथ पूरक M9 के पांच मिलीलीटर जोड़ें और ट्यूब को एक घुमाव पर सीधे और सटीक गिनती और आकार घटाने के लिए कीड़े को इच्छामृत्यु दें। जनसंख्या वितरण प्रलेखन के लिए, कैलिब्रेटेड 384-वेल प्लेट टेम्पलेट खोलें और नमूने के 20 बार क्षेत्रों में से प्रत्येक के लिए प्रत्येक गेटेड क्षेत्र की चार तकनीकी प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए 20 गेटेड वस्तुओं को चार कुओं में बांटने के लिए टेम्पलेट सेट करें।बड़े कण प्रवाह साइटोमीटर पर कीड़े का एक 40 मिलीलीटर नमूना लोड करें और स्वचालित रूप से नमूने को छांटना शुरू करें, जबकि लगातार नमूने को व्यवस्थित करने से रोकने के लिए और साथ ही नमूने से वस्तुओं को कैलिब्रेटेड 384-वेल प्लेट में वितरित करने के लिए सरगर्मी करें। एक बार पूरे नमूने को हल कर लिया गया है और गेटेड क्षेत्रों की अधिकतम संख्या 384-अच्छी प्लेट में वितरित की गई है, साइटोमीटर से नमूना हटा दें और उपकरण को साफ करें। बड़े पैमाने पर संस्कृति प्लेट विधि का परीक्षण सी एलिगेंस के 15 उपभेदों पर किया गया था, जिसमें कैनोरहैब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर म्यूटेंट और कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस प्राकृतिक विविधता संसाधन जंगली उपभेदों का मिश्रण शामिल था।इस विश्लेषण में, बड़े पैमाने पर संस्कृति प्लेट विधि लगभग 94, 500 से 9, 290, 000 तक जनसंख्या आकार मिले। संदर्भ तनाव PD1074 के भीतर मतलब जनसंख्या का आकार और उपभेदों के पार लगभग 2.4 मिलियन कीड़े था। १२.२ बड़े पैमाने पर संस्कृति प्लेट विकास के दिनों के औसत के दौरान सी एलिगेंस उपभेदों के बीच अनुमानित जनसंख्या आकार में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया ।PD1074 बड़े पैमाने पर संस्कृति प्लेटों के बीच 10 से 14 दिनों के लिए १२.२ दिनों के एक मतलब विकास के समय के साथ एक पूर्ण मिश्रित चरण आबादी को विकसित करने के लिए ले लिया । सबसे धीमी बढ़ती तनाव अधिकतम 20 दिनों के लिए बढ़ी और सबसे तेजी से बढ़ते तनाव में न्यूनतम 10 दिनों तक वृद्धि हुई । PD1074 के लिए इस नमूना वितरण में, एक बड़े कण प्रवाह साइटोमीटर पर ग्रेविड वयस्क के माध्यम से L1 चरण से कीड़े मापा गया था।बाद में इमेजिंग और नमूनों में जनसंख्या वितरण में विविधताओं के दृश्य से पता चला है कि पाइपलाइन C.elegans की एक मिश्रित चरण जनसंख्या उत्पन्न । नमूना संग्रह में कीड़े को सटीक रूप से गिनना महत्वपूर्ण है ताकि आप डेटा प्राप्त करें जो वृद्धि और अध्ययनों में तुलनीय है। इस संग्रह दृष्टिकोण को सी एलिगेंस आबादी के भीतर होने वाली जटिल गतिशीलता की हमारी समझ का विस्तार करने के लिए आरएनए अनुक्रमण, जीनोमिक्स और अन्य ओमिक्स विश्लेषण पर लागू किया जा सकता है।यह तकनीक हमें प्रत्येक नमूने की एक समग्र तस्वीर प्राप्त करने के लिए कई ओमिक्स प्रयोगों में मिश्रित मंचन सी एलिगेंस आबादी एकत्र करने की अनुमति देती है।

Research

JoVE Journal

Genetics

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

भूतल बस्तियां माइक्रोबियल आबादी में निगरानी स्थानिक पृथक्करण

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

किसी भी डीएनए स्रोत से बड़े पैमाने पर gRNA पुस्तकालय उत्पादन के लिए एक सार्वभौमिक प्रोटोकॉल

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस-एक बहुमुखी Vivo मॉडल में मेजबान-सूक्ष्म बातचीत का अध्ययन करने के लिए

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis एलिगेंस में Ploidy का हेरफेर

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

प्रतिकृति सेट विधि: मात्रात्मक माप करने के लिए एक उच्च-प्रवाह Approach Caenorhabditis एलिगेंस आयुष्यात

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Heuristic Mining of Hierarchical Genotypes and Accessory Genome Loci in Bacterial Populations

पदानुक्रमित जीनोटाइप और जीवाणु आबादी में गौण जीनोम लोकी के ह्यूरिस्टिक खनन

Routine and systematic use of bacterial whole-genome sequencing (WGS) is enhancing the accuracy and resolution of epidemiological investigations carried ...

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर एगोनिस्ट लेवामिसोल के लिए कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस संवेदनशीलता को मापना

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस में जीवनकाल और हेल्थस्पैन को मापने के लिए कम लागत वाले तरीकों का सर्वेक्षण करना

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

केनोरहाब्डिस एलिगेंस में भ्रूण व्यवहार्यता और ब्रूड आकार को मापना

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपेशन (सीएचआईपी) का उपयोग करके सी एलिगेंस में ट्रांसजेनरेशनल एपिजेनेटिक इनहेरिटेंस का विश्लेषण

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...