Name: culture and assay of large-scale mixed-stage caenorhabditis elegans populations
Uploaded: 2021-05-05T14:00:00
Duration: 8 min 51 s
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우리는이 원고에 대한 유용한 토론과 피드백에 대한 Edison Lab의 회원들에게 감사드립니다. 특히, B.M. 일부 균주는 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무소 (P40 OD010440)에 의해 투자되는 CGC와 NSF 생활 컬렉션 CSBR 1930382 의해 투자되는 CeNDR에 의해 제공되었다. 이 작품은 NIH (U2CES030167)의 보조금에 의해 지원되었다.

<ol>
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저자는 공개 할 것이 없습니다.

다양한 선박을 LSCP로 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 표준 유리 베이킹 접시가 사용되었습니다. 사용 중 LSPC는 35.56 x 20.32cm의 외부 치수를 가지고 있었고, 내부 치수는 27.94 x 17.78cm, 깊이는 약 4.45cm이며 장착 된 뚜껑이 함께 있었습니다. 따라서, 여기서 사용되는 박테리아의 양은 상기 차원을 가진 LSCP에 최적화되어 혼합단계 벌레의 큰 집단을 산출한다. 세균의 부피 및 농도는 실험적 요구에 맞게 조절될 수 있다.
곰팡이, 곰팡이 또는 기타 세균성 소스에 의한 오염은 LSCP 방법의 모든 단계에서 발생할 수 있으므로 주의해서 샘플을 처리하십시오. 프로토콜의 단계를 시작하기 전에 작업 공간이 70 % 에탄올과 10 %의 표백제로 청소되었는지 확인하십시오. 사용 가능한 경우, 30분 동안 UV 광이 있는 중고 지역을 치료하고 각 단계를 시작하기 전에 30분 전에 HEPA 공기 필터를 켭니다.
제어된설정(즉,20°C로 설정된 CT 룸)에서 LSCP를 성장시킴으로써, 사용자는 시료의 성장을 보다 쉽게 추적하고 잠재적오염을 문서화할 수 있다. LSCP의 표면이 오염되면 가능한 경우 오염을 잘라내고 오염을 제어할 수 없는 경우 시료가 계속 성장하거나 폐기하도록 합니다. 원치 않는 성장을 줄이고 자원을 위해 웜을 능가하지 않도록 신속하게 오염을 해결하는 것이 필수적입니다.
이 방법은 C. elegans의대규모 집단 집단 문화를 성장시키고자하는 사람들을위한 것입니다. LSCP에서 의 경우와 같이 상업적으로 사용 가능한 페트리 접시와 액체 문화에서 와 같이 동기화된 웜 개체수를 늘릴 수 있지만 저자는 이 옵션을 테스트하지 않았습니다. 또한 사용자가 지정된 샘플에서 평균 약 240만 개 이상의 웜을 성장시키고자 하는 경우 다른 방법을 권장합니다4. 성장 성공은 파이프라인에서 처리되는 변형에 따라 달라집니다. 저자는 성공적으로 15 C. elegans 긴장의 적어도 5개의 생물학 복제에 있는 대략 2.4 백만 벌레의 인구를 증가할 수 있었습니다, 방법이 견고하다는 것을 나타내는.
실험을 시작하기 전에 주어진 웜의 나이와 건강은 fecundity 및 후속 인구 증가 시간에 영향을 미칠 수 있음을 주의합니다. 이 파이프라인에 사용되기 전에 최소한의 스트레스로 웜을 건강한 조건에서 유지관리합니다. 재고 샘플이 생성, 동결 및 시간이 지남에 따라 유전 드리프트를 줄이기 위해 -80 °C에서 보관된 것으로 가정됩니다.
주어진 실험의 필요에 따라 LSCP에서 중력 성인을 시작하는 횟수를 변경할 수 있습니다. LSCP에서 시작 중력 성인의 수를 변경하면 성장률이 변경되므로 수확 할 시간이 변경됩니다. 5명의 중력 성인은 다음과 같은 이유로 각 LSCP를 시드하는 데 사용됩니다: (1) 한 번에 많은 C. elegans 균주를 LSCP에 종자하는 간단하고 빠르며 효율적인 방법이 필요했으며 (2) 성장 이질성으로 이어질 수 있는 그레이드 성인들 사이의 나이 차이를 줄이기 위해 필요하였다.
이 방법을 사용하면 모든 수명 주기 단계가 있는 많은 웜 군수를 수확할 수 있습니다. 현재 방법을 사용할 수 있는 C. elegans의 대규모 샘플을 수집하려면 다운스트림 작업에 원하는 웜 수를 얻기 위해 표백제 동기화가 필요합니다. 이러한 접근법을 감안할 때, 이제 표백제 동기화 및 다중 처리 단계와 관련된 어려움 없이 발효기 또는 대규모 액체 배양에서 가능한 한 많은 벌레를 자랄 수 있습니다. 당사의 프로토콜을 사용하면 관심 있는 균주를 효율적으로 타겟팅하고, 샘플 자체를 성장하는 데 최소한의 처리 시간을 사용하고, 다운스트림 파이프라인에서 필요에 따라 웜 또는 인구의 단계를 격리할 수 있습니다.
LPFC는 지정된 LSCP에서 인구 분포와 크기를 문서화하는 도구로 활용되었습니다. 사용되는 LPFC는 크기(TOF) 및 광학 밀도를 기반으로 웜을 분석, 정렬 및 분배하는 연속 유량 시스템입니다. 주어진 웜이 유동 셀을 통과할 때, 축 광 손실 검출기는 벌레가 통과하는 데 걸리는 시간 동안 488 nm-솔리드 상태 레이저에 의해 차단된 신호광의 양을 포착하여 사용자에게 웜의 TOF 및 광학 밀도를 제공합니다. 형광 수집 광학 및 검출기는 각 샘플의 형광 감도 및 수집을 극대화하기 위해 활용 될 수 있습니다. LPFC 컬렉션 매개 변수는 계측기에 따라 다릅니다. 사용자는 웜 크기를 캡처하기 위해 다양한 플랫폼을 사용할 수 있으며 LPFC를 사용할 수 없는 경우 이 프로토콜을 사용하는 데 국한되지 않습니다.
저자는 액체 염색체를 통해 C. elegans의 각종 긴장에서 알려지지 않은 대사산물을 확인하기 위하여 여기에서 기술된 방법에서 성장한 견본을 이용하고 있습니다 - 질량 분광법, NMR 분광법 및 RNA 순서. 저자는 이 파이프라인을 사용하여 새로운 관심 있는 균주를 쉽게 처리할 수 있기 때문에 다양한 C. elegans 균주를 사용하여 이 파이프라인의 샘플 성장을 위해 이 방법을 계속 사용할 계획입니다.

C. elegans는 다양한 자연 서식지1에서전 세계적으로 발견되는 작은 자유로운 살아있는 선충입니다. 성장의 상대적 용이성, 빠른 세대 시간, 재생 시스템 및 투명한 신체는 발달 생물학, 노화, 신경 생물학 및 유전학2,3에서널리 연구된 강력한 모델 유기체입니다. C. elegans에 대한 풍부한 작업은 표현형을 복잡한 생물학적 구성 요소와 포괄적으로 연결하는 -omics 연구에서 사용할 수있는 유력한 후보이며 주어진 유기체에서의 관계를 포괄적으로 연결합니다.
협업 -omics 연구에서 C. elegans를 사용하려면 단일 샘플을 분할하고 비교 분석을 위해 다양한 플랫폼과 기기에서 사용할 수있는 동물의 큰 혼합 단계 인구를 생성하는 방법이 필요합니다. 이러한 샘플을 생성하기 위해 파이프라인을 만들려면 식단, 환경, 스트레스, 인구 구조 및 샘플 처리 및 수집에 대한 예리한 인식이 필요합니다. 따라서 대규모 파이프라인에 통합된 표준 및 재현 가능한 배양 조건을 갖는 것이 중요합니다. C. elegans 연구에서는 아가 페트리 요리와 액체 문화4- 두 가지 전통적인 방법은 벌레를 문화하는 데 사용됩니다.
역사적으로, 대량의 C. 예인이 필요할 때, 그들은 액체 배양4에서재배된다. 액체 배양에서 벌레의 큰 인구를 생성하는 관련시킨 단계는 수시로 중력 성자 큐티클을 파열하기 위하여 표백제 동기화를 포함하는 다중 취급 단계를 요구합니다, 원하는 인구 크기를 달성하기 위하여 태아를 풀어 놓습니다. 그러나 표백제 동기화를 사용하면 인구 증가가 인구 조사 시작 크기에 따라 달라지므로 후속 증가와 인구 수에 영향을 미칩니다. 또한, C. 예레간 균주는 표백제 동기화에 대한 큐티클 감도, 노출 시간 및 응력 반응에 따라 달라지므로 한 번에 많은 균주를 분석하기가 어렵고5,6,7,8,9.
또한, 액체 배양의 벌레 성장은 여러 세대에 걸쳐 자라면 쉽게 발생하고식품(10)의존재에도 불구하고 다이어 형성으로 이어질 수 있기 때문에 수확하기 전에 한 세대의 벌레만 성장하는 것이 좋습니다 때 몇 가지 전송 단계가 필요합니다. Dauer 형성은 종종 "dauer 페로몬"11,12,13,14라고도하는 소신호 분자를 통해 발생하며, 액체 매체로 방출되어 인구의 성장에 영향을 미친다. 더욱이, 액체 배양에서 큰 벌레 인구증가는 배양에 있는 과잉 박테리아 축적으로 이끌어 내고, 다운스트림 phenotypic 분석은 위해 깨끗한 견본이 필요할 때 어려움을 만듭니다. 마지막으로, 액체 배양이 오염되면 곰팡이 포자 나 세균 세포가배지(15)에걸쳐 쉽게 분산되기 때문에 유지가 더 어려워진다.
C. elegans를 재배하는 다른 전통적인 방법은 아가 페트리 요리에 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 Petri 접시를 사용하면 액체 배양에서 볼 수 있듯이 과밀과 높은 dauer 형성의 급속한 영향없이 여러 세대의 혼합 단계 벌레를 쉽게 성장시킬 수 있습니다. 그러나, 전통적인 한마페트리 요리에 벌레 성장에 단점은 가장 큰 상업적으로 사용할 수 페트리 접시표백제 동기화 단계에 추가하지 않고 -omics 연구에 대한 큰 벌레 인구를 산출하지 않는다는 것입니다. 요약하자면, 한천 페트리 접시에 C. elegans의 혼합 단계 인구를 배양하는 것은 -omics 데이터를 수집하는 데 더 적합하지만, 우리는 액체 배양없이 매우 큰 인구 크기를 생성하는 방법이 필요했습니다.
여기서는 대규모 배양판(LSCP)에서 대규모 혼합단계 C. 예레간 인구를 배양하고 수집하는 방법을 제시합니다. 이 파이프라인을 통해 샘플을 수집하면 -omics실험(예:유전체학, 전사학, 프로테오믹스 및 메타볼로믹스)에 필요한 데이터와 함께 현상 및 인구 데이터를 수집하기에 충분한 샘플을 얻을 수 있습니다. 또한 LSCP 방법은 동물의 최소한의 조작, 사용자 준비 시간 감소, 엄격한 환경 제어 제공, 전체 재현성을 위한 연구 전반에 걸쳐 각 시료의 처리가 일관되도록 보장합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Graduated Cylinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10124-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 Proof Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75804-654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75874-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>05040-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BVC Control G Fluid Aspiration System</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>449709-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3045-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox Bleach</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89414-502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conviron Control Temperature Room</td>
			<td>Conviron</td>
			<td></td>
			<td>https://www.conviron.com/environmental-rooms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89089-866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Scientific Accuspin 3R</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-Bottom 24-Well Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29443-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft.</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>204390560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT115 E. coli (DE3)</td>
			<td>CGC</td>
			<td>HT115(DE3)</td>
			<td>https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470224-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Scale Culture Plate (LSCP)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1090948</td>
			<td>Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C86677-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Plain Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.11727.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Devices ImageXpress</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model Number:IXMConfocal</td>
			<td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin (10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6261-25MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (6 cm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Controller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-4180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0781-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasssium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P250-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Fluroscent Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19507-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>746398-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>111357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Gilson Pipette Set</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10002M, FA10004M, FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin (100mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Union Biometrica COPAS BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td>https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and assay of large-scale mixed-stage caenorhabditis elegans populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans)는발달 생물학, 노화, 신경 생물학 및 유전학을 연구하는 귀중한 모델 유기체로 남아 있습니다. C. elegans에 대한 작업의 큰 몸은 복잡한 생물학적 구성 요소와 다른 유기체와의 관계를 해부하기 위해 대규모 인구, 전체 동물 연구에 통합하는 이상적인 후보입니다. 협업 -omics 연구에서 C. elegans를 사용하기 위해서는 비교 분석을 위해 다양한 플랫폼에서 단일 샘플을 분할하고 분석 할 수있는 많은 동물을 생성하는 방법이 필요합니다.
여기서, 대규모 배양판(LSCP)에 풍부한 혼합단계 C. 엘레간 집단을 배양하고 수집하는 방법과 후속 현상데이터가 제시된다. 이 파이프라인은 -omics 실험(예: 유전체학, 전사학, 프로테오믹스 및 메타볼로믹스)에 필요한 데이터와 함께 현상 및 인구 데이터를 수집하기에 충분한 수의 동물을 산출합니다. 또한 LSCP 방법은 동물 자체에 대한 최소한의 조작이 필요하며, 사용자 준비 시간이 적으며, 환경 제어를 강화하며, 전체 적인 재현성을 위해 연구 전반에 걸쳐 각 시료의 처리가 일관되도록 보장합니다. 마지막으로, 주어진 LSCP에서 C. elegans 생명 단계의 인구 규모 및 인구 분포를 문서화하는 방법이 제시됩니다.

LSCP 방법을 사용하는 C. elegans의 성장은 12.2 일 동안 샘플 당 평균 약 240 만 개의 혼합 단계 웜을 산출합니다. LSCP 방법을 사용하여 C. elegans의 성장을 통해 사용자는 대규모 -omics 연구(그림 1)에이상적인 동물의 처리 및 조작이 거의없는 C. elegans의 큰 혼합 단계 인구를 생성 할 수 있습니다. LSCP가 성인 벌레로 가득차 있고, 인구 규모에 도달하고, 최소한의 박테리아가 남아 있으면 사용자는 인구 크기를 수확하고 추정할 수 있습니다. 이 점은 또한 인구가 -omics파이프라인(그림 2)에서사용하기에 충분한지 여부를 평가하여 품질 관리역할을 할 수 있다. 인구 역학은 변형 자체, 균주의동작(즉,잠복 균주가 웜 회수율이 낮은 경향이 있음) 및 성장성공(즉,오염)에 의존한다. LSCP 방법은 15개의 C. 엘레간에서 Caenorhabditis 유전학 센터(CGC) 돌연변이및 케노르하비티스 엘레간 천연 다양성 자원(CeNDR) 야생균주(25)의혼합물을 포함하는 C. 엘레건의 균주에 대해 시험하였다. 균주 유전형은 보충표 3에 기재되어있다.
LSCP 방법은 약 94,500에서 9,290,000까지의 인구 크기를 산출했습니다. 기준 균주, PD1074 및 균주 전반에 걸쳐 평균 인구 크기는 약 240만 개의웜(그림3)이었다. 평균 12.2 LSCP 성장일(그림4)의과정에서 C. elegans 균주 사이의 추정 인구 규모에서 유의한 차이가 발견되지 않았습니다. PD1074 LSPS는 전체 혼합 단계 인구로 성장하는 데 10 - 14 일 사이에 걸렸다. PD1074의 평균 성장률시간은 10일이었다. 가장 느린 성장균은 최대 20일 동안 증가했으며, 가장 빠르게 성장하는 균주는 최소 10일 동안 증가하였다(그림4).
따라서 이 LSCP 방법을 사용하면 개발 타이밍 및 배경 전문 지식에 대한 지식이 거의 없는 새로운 관심 있는 균주를 연구에 쉽게 통합할 수 있습니다. 피킹에 의해 유지되어야 하는 균주와 표현형, fecundity 결함이 있거나 이종화구스이거나 성장 결함이 있는 경우이 파이프라인에서 잘 작동하지 않을 수 있습니다.
큰 입자 흐름 세포측정및 샘플 이미징을 통해 사용자는 인구 분포를 문서화할 수 있습니다. 성공적인 인구 증가를 측정하는 데 다양한 플랫폼을 사용할 수 있습니다.
재현 가능한 -omics 측정의 경우 일관된 문화를 성장시키는 것이 중요합니다. 배양 재현성 메트릭은 웜 수와 지정된 변형에 대한 일관된 크기 분포입니다. 우리는 LPFC23,26 및 마이크로 공초점 현미경 이미지를 성장 성공을위한 프록시로 사용하여 원래 N2 브리스톨 변형인 PD1074에 대한 샘플 분포를 보여줍니다. LPFC분포(그림 5),후속영상(도 6)에대한 중력성인을 통해 L1 단계에서 벌레를 측정한 바와 같이, 샘플(그림 7)에 대한 인구 분포의 변화(도7),이 파이프라인이 C. elegans의혼합단계 인구를 생성한 것을 볼 수 있다.
혼합단계 샘플의 인구 분포를 자세히 살펴보기 위해, 비행 시간(TOF) (즉, 신체 길이) 분포(그림7A,B)에걸쳐 각 지역에 속하는 웜의 백분율을 살펴보면서 35개의 PD1074 LSCPs의 분포를 살펴보았습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig01.jpg"> 그림 1: LSCP 웜 성장 파이프라인 개요입니다. (A)일단 실험실에서 접수되면, 모든 균주가 -80 °C2에서장기 저장을 위해 준비및 냉동되었다. (B)"마스터 청크" 플레이트는 냉동 웜 스톡으로부터 제조되어 15°C로 저장되어 1개월 이상 사용하지 않았다. (C)각 샘플은 LSCP에서 성장하기 전에 세대 스트레스를 줄이기 위해 4개의 연속 청크 단계를 거쳤습니다. (D)5 개의 개별 그라비드 성인은 단계 (D)에서 "덩어리 4"6cm 플레이트에서 선택되었으며 LSCP의 5 개 주어진 부위에 표백된 것을 발견하였다. (E)LSCP는 제어 온도실에 배치되어 LSCP가 성인 웜으로 가득 차서, 큰 인구 크기에 도달하고, 최소한의 박테리아가 남아있을 때까지 20°C에서 성장하였다. (F)웜 개체수가 하류 단계에 대해 수확및 수집하였다. (G)알리쿼트LS는 LSCP에서 만들어졌으며 다운스트림 원하는 응용 프로그램에 대해 플래시가 동결되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig02.jpg"> 그림 2: LSCP 수확 및 추정 인구 규모 개요입니다. (A)M9의 50mL는 NGMA 표면에서 벌레를 씻어 내도록 사용되었다. 웜 서스펜션은 50mL 원원형 튜브로 피펫되었다. 단계(A)는 두 번 반복하였다. (B)15mL의 벌레 현탁액을 새로운 15mL 원심관에 부어졌다. 벌레는 원심분리에 의해 펠릿되었다. M9 + 파편은 벌레 펠릿을 방해하지 않고 흡입되었다. 단계(B)는 150mL의 모든 웜 서스펜션이 수집될 때까지 반복되었다. (C)벌레 펠릿은 남은 잔해를 제거하기 위해 M9로 세 번 세척및 원심분리되었다. 시료가 깨끗해지면, 벌레 펠릿은 ddH 2O.(D)의 10mL에서 재중단되었다(D) 샘플의 직렬 희석이 웜 인구 크기를 추정하기 위해 만들어졌다. 웜을 정확하게 계산할 수 있도록 허용한 희석 계수가 사용되었습니다. 사용되는 희석 계수는 LSCP의 모집단 크기에 따라 변경되었습니다. (E)희석 계수가 선택되면, 그 희석의 모든 3개의 알리쿼트 복제체로부터의 모든 웜이 깨끗한 슬라이드에 파이펫화되었고 벌레는 해부 현미경으로 계산되었다. (F)샘플은 적절한 크기의 알리쿼트로 분할되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig03.jpg"> 그림 3: LSCP 방법은 평균 240만 개의 혼합 단계 웜 을 생성합니다. LSCP는 인구 증가율이 약 94,500명이며 인구 증가율은 약 9,290,000명으로 가장 큽습니다. 모든 균주에 걸쳐 평균 인구 규모는 240 만 웜이었다. C. elegans 변형 이름 아래의 막대는 변형이 CGC 돌연변이인지 또는 CeNDR 자연 분리인지 여부를 나타냅니다. LSCP 샘플 크기는 각 스트레인에 대해 표시됩니다. Tukey의 HSD 테스트를 사용하여 모든 쌍에 대한 비교가 수행되었습니다. C. elegans 균주 (F (14,108) = 0.7, p = 0.77)에 걸쳐 추정 된 인구 크기 사이에 는 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다. 색상 막대는 각각의 C. elegans 변형 표현에 대한 표준 색상 디스플레이를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig04.jpg"> 그림 4: LSCP 방법은 10-20일 동안 큰 혼합 단계의 웜 집단을 생성했습니다. 주어진 C. elegans LSCP는 견본이 성인 벌레의 가득 차 있고, 큰 인구 규모에 도달하고, 최소한의 세균성 잔디가 남아 있었다 때까지 성장했습니다. LSCPs는 긴장에 따라 전체 혼합 단계 인구로 성장하는 데 10 - 20 일 사이에 걸렸습니다. 균주를 가로지르는 평균 성장 시간은 12.2일이었다. LSCP 샘플 크기는 각 스트레인에 대해 표시됩니다. 각 오류 표시줄은 평균에서 1개의 표준 편차를 사용하여 생성되었습니다. 동일한 문자로 연결되지 않은 수준은 크게 다릅니다. Tukey의 HSD 테스트를 사용하여 모든 쌍에 대한 비교. C. elegans 균주 (F (14,108) = 8.8, p < 0.0001 *)에 걸쳐 필요한 LSCP의 성장 시간 에서 상당한 차이가 발견되었습니다. 색상 막대는 각각의 C. elegans 변형 표현에 대한 표준 색상 디스플레이를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2.jpg"> 그림 5: 야생형 기준 균주 PD1074의 혼합 인구 및 성장 측정. 야생형 기준 균주의 LSCP 성장 1개, 원래 N2 Bristol 스트레인의 변형(PD1074)의 대표적인 LPFC 분포는 혼합단계 모집단의 크기 분포 및 이벤트 수를 문서화합니다. x축은 정렬된 웜의 길이(비행 시간, TOF)를 표시합니다. y축은 정렬된 웜의 광학 밀도(광학 소멸, EXT)를 표시합니다. 각 데이터 포인트는 샘플에 문서화된 웜입니다. 이미지 분석에 사용된 각 TOF 영역은 다른 색상으로 표시됩니다. 20TOF 지역은 50~2050년 TOF에 이르는 20개의 TOF 영역(R2 – R21)을 만들었습니다. 각 TOF 지역에 대한 자세한 내용은 보충 표 1에서 확인할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig06.jpg"> 그림 6: R2 – R12에 이르는 TOF 영역에서 정렬된 웜 이미지는 PD1074 LPFC 분포를 보여 준다. 지역 R2에서, L1 벌레는 확인될 수 있고 지역에서 R9는 주로 중력 성인이 확인됩니다, 우리에게 분포에서 단계가 예상되는 곳의 흐름 세포계 분포 내의 대략적인 지역을 주는 두 개의 발달 애벌레 극단에 걸쳐. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 대표적인 이미지는 도 5에표시된 LPFC 배포판에서 촬영되었으며, 컬러 박스는 그림 5의영역에 해당한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig07.jpg"> 그림 7: 야생형 기준 균주 PD1074의 비행 시간(TOF) 영역에 걸친 인구 분포입니다. 웜이 발견된 지역을 보여주는 TOF 전체 지역에 웜을 분포합니다. 각 PD1074 LSCP는 개별 색상으로 표시됩니다. (A)x축은 LSCP에 대해 관찰및 계산된 20개의 TOF 영역(R2 – R21)을 나타내며, 전체 크기 분포를 나타낸다. y축은 주어진 TOF 영역으로 떨어졌던 몸 크기가 있는 주어진 LSCP의 웜 의 백분율을 보여줍니다. (B)벌레 인구의 작은 분수가 R7-R21 영역 사이에 떨어짐에 따라 각 지역 내에 떨어진 웜의 백분율로 로그를 가져와 인구 분포를 표시하였다. x축은 R7-R21 TOF 영역을 표시합니다. y축은 지정된 TOF 영역에 빠진 바디 크기를 가진 지정된 LSCP의 웜 퍼센트 로그를 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 도 1: LSCP가 재배되고 처리된 성장 조건의 평균 일일 온도(°C). 제어 온도(CT) 방의 보고된 온도는 6개월 동안 샘플 성장 및 수집을 통해 문서화및 수집되었습니다. 평균 일일 기온은 여기에 보고됩니다. LCSP가 프로젝트 기간 동안 증가한 온도(F(5,24) = 2.59, p = 0.0524 사이에는 큰 차이가 관찰되지 않았다. 전체 온도 차이는 샘플 성장 및 생성의 6 개월 기간 동안 0.003 °C 이하의 경연성이었다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453supfig01.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: TOF 문이 있는 영역은 웜을 이미징을 위해 384웰 플레이트로 분류하는 데 사용됩니다. Binned 지역은 2050년까지 전체 TOF 분포에서 100T의 TOF에 걸쳐 만들어졌습니다. 게이트 된 영역을 변경하고 필요에 맞게 최적화 할 수 있습니다. 이미지 분석에 사용된 각 TOF 영역은 다른 색상으로 표시됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table1_FINAL.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 2: TOF 영역의 384웰 플레이트 템플릿 및 복제 레이아웃. 모든 샘플은 이미징을 위해 384웰 플레이트로 분류되었습니다. 정렬을 위해 선택한 각 영역에 대해 4개의 복제가 만들어졌습니다. 게이트 된 영역을 변경하고 필요에 맞게 최적화 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 생성되고 사용되는 특정 게이트 영역에 대한 보충 표 1을 참조하십시오. 이미지 분석에 사용된 각 TOF 영역은 다른 색상으로 표시됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table2_FINAL.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 3: 이 프로토콜에 사용되는 C. elegans 균주는 CGC 및 CeNDR 균주의 혼합물을 포함합니다. 변형, 유전자형, 변형 소스 및 세부 사항은 이 표에 설명되어 있습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table3_FINAL.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

omics 연구에서 Caenorhabditis elegans (C. elegans)를사용하려면 비교 분석을 위해 플랫폼 간에 단일 샘플을 측정 할 수있는 많은 웜 인구를 생성하는 방법이 필요합니다. 여기서는 대규모 배양판(LSCP)에 대한 C. 예인대 인구를 배양하고 인구 증가를 문서화하는 방법이 제시된다.

대규모 혼합 단계 Caenorhabditis 예인단 인구의 문화와 분석

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

이 기술을 사용하면 최소한의 조작으로 여러 omics 플랫폼에 사용할 대규모 웜 모집단을 수집할 수 있습니다. 이 기술은 우리가 각 견본의 전체적인 그림을 얻기 위하여 다중 omics 실험에 걸쳐 혼합 단계 C.elegans 인구를 수집할 수 있습니다. 중력 성인을 대규모 배양 판에 표백하기 위해, 벌레가 분젠 버너 위에 픽을 하고, 세균 잔디 가장자리에서 신선한 대장균을 대규모 배양 판에 스쿱하는 데 사용합니다.스팟 표백을 위해 네 번째 청크 플레이트에서 하나의 그레이드 성인을 선택하고 E.coli 잔디에서 멀리 큰 문화 판의 한 구석에 갓 준비 알칼리성 hypochlorite 용액의 다섯 마이크로 리터를 추가합니다. 중력 성인을 알칼리성 hypochlorite 용액에 넣고 선충을 눌러 큐티클을 방해하고 계란을 방출합니다. 총 5명의 성인이 대장균 잔디 밭 주변에 똑같이 고르게 배치되면 뚜껑을 접시에 다시 놓습니다.대규모 배양 판에서 샘플을 수확하려면 M9 용액 50 밀리리터를 하나의 대규모 배양 판 표면에 붓고 플레이트를 소용돌이쳐 M9이 전체 선충 성장 매체 아가로즈 표면을 덮도록 합니다. M9을 가진 멸균 세리컬 파이펫을 프라임하고 M9및 벌레 인구가 접시의 한 구석에 모일 수 있도록 접시를 기울입니다. 프라이밍 파이펫을 사용하여 웜 서스펜션을 흡인하고 웜을 50밀리리터 원문 튜브에 추가합니다.튜브를 로커에 놓고 세균 덩어리와 파편을 방해합니다. 모든 벌레가 세 개의 플레이트에서 수집되었을 때, 각 튜브에서 15 밀리리터의 벌레를 각각 3개의 15 밀리리터 원모 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 튜브의 벌레를 퇴적시합니다. 조심스럽게 웜 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼 네이넌트를 흡인하고 각 튜브에 13 밀리리터의 벌레 현탁액을 추가하십시오.튜브를 뒤집어 펠릿을 다시 중단하고 가능한 한 많은 박테리아와 파편을 씻어 내고 벌레를 다시 원심분리하십시오. 각 전체 웜 개체수가 수집되면 세척당 신선한 M9 용액 10밀리리터에서 벌레 펠릿을 세 번 세척하십시오. 마지막 세척 후, 이중 증류수 10 밀리리터에 각 청소 된 벌레 펠릿을 다시 중단합니다.인구 크기 추정의 경우, 샘플당 900 마이크로리터의 M9 용액으로 각 튜브에서 웜 샘플 의 3 개의 100 마이크로 리터 알리쿼트를 신속하게 희석하고 알리쿼트를 사용하여 직렬 희석을 만듭니다. 알리쿼트가 계산되는 동안 배양물의 지속적인 이동을 위해 로커에 스톡 웜 샘플 서스펜션을 배치하고 웜 희석을 균일할 때까지 혼합합니다. 첫 번째 1개에서 10개의 웜 샘플에서 5개의 마이크로리터를 유리 현미경 슬라이드에 추가하고 가벼운 현미경으로 벌레를 계산합니다.샘플에 50개 미만의 웜이 있는 경우 1:100 및 1:1, 000 희석제수를 계산합니다. 50개 이상의 웜이 있는 경우 다음 직렬 희석으로 이동합니다. 각 희석복제의 각 알리쿼트 복제를 세번 계산한 후 희석 수를 평균하여 웜의 예상 인구 크기를 결정합니다.그런 다음 웜 샘플을 적절한 실험 알리쿼트로 분할하고 플래시는 영하 80도 저장을 위해 액체 질소의 샘플을 동결합니다. 대형 입자 흐름 세포측정을 위한 웜 샘플을 준비하기 위해, M9 용액의 10 밀리리터의 최종 부피에 4개의 혼합 단계 웜 알리쿼트에 약 5회 10회 희석하고 밀리리터 E.coli당 1밀리그램의 200 마이크로리터를 추가하고 0.5 마이크로몰라 적색 형광 마이크로스피어용 용액을 0.5 마이크로몰라 의 희석을 허용한다. 흔들로 실온에서 20 분 인큐베이션 후 원심 분리에 의해 벌레와 미세 구를 수집하고 과도한 박테리아와 내부화 되지 않은 마이크로 스피어를 제거하기 위해 신선한 M9 용액으로 벌레를 두 번 세척하십시오.두 번째 세척 후, M9 용액의 5 밀리리터에 펠릿을 다시 놓습니다. 펠릿이 깨끗해 보이는 경우, 벌레에 50 밀리마일라 나트륨 아지드로 보충된 M9의 5밀리리터를 추가하고 정확한 계산 및 크기 조정을 위해 벌레를 곧게 펴고 안락사시키기 위해 로커에 튜브를 놓습니다. 인구 분포 문서의 경우 보정된 384웰 플레이트 템플릿을 열고 20개의 게이트된 개체를 4개의 우물로 분배하도록 템플릿을 설정하여 샘플의 20bar 영역에 대해 각 게이트 영역의 4개의 기술 복제본을 얻습니다.40밀리리터의 벌레 샘플을 대형 입자 흐름 사이토미터에 적재하고 시료를 지속적으로 교반하면서 자동으로 샘플을 정렬하기 시작하여 샘플에서 정산을 방지하고 동시에 샘플에서 보정된 384웰 플레이트로 물체를 분배합니다. 전체 샘플을 정렬하고 최대 게이트 영역 수가 384웰 플레이트에 분배되면 사이토미터에서 샘플을 제거하고 계측기를 청소합니다. 대규모 배양 플레이트 방법은 C.Elegans의 15개 균주에서 시험되었으며, 여기에는 카노르하비티스 유전학 센터 돌연변이와 카노르하비티스 엘레간 천연 다양성 자원 야생 균주의 혼합물이 포함되어 있습니다.이 분석에서, 대규모 배양 플레이트 방법은 약 94, 500 내지 9, 290, 000의 인구 크기를 산출하였다. 기준 균주 PD1074 내의 평균 인구 규모와 균주 전반에 걸쳐 약 240 만 개의 웜이었습니다. 평균 12.2 대규모 배양판 성장일의 과정을 통해 C.elegans 균주 사이의 추정 인구 규모에서 유의한 차이가 발견되지 않았습니다.PD1074 대규모 배양판은 10~14일 동안 평균 성장 시간으로 전체 혼합 단계 인구로 성장했습니다. 가장 느린 성장 균주는 최대 20 일 동안 증가하고 가장 빠르게 성장하는 균주는 최소 10 일 동안 증가했다. PD1074에 대한 이 샘플 분포에서, 벌레는 큰 입자 흐름 사이토미터에 중력 성인을 통해 L1 단계에서 측정되었다.샘플 전반에 걸친 인구 분포의 변동에 대한 후속 이미징 및 시각화결과 파이프라인이 C.elegans의 혼합 스테이지 인구를 생성한 것으로 나타났습니다. 샘플 수집 전반에 걸쳐 웜을 정확하게 계산하여 성장과 연구에서 비교할 수 있는 데이터를 얻는 것이 중요합니다. 이 수집 접근법은 C.elegans 인구 내에서 발생하는 복잡한 역학에 대한 이해를 확장하기 위해 RNA 염기서열 분석, 유전체학 및 기타 오믹스 분석에 적용 될 수 있습니다.이 기술을 통해 우리는 각 샘플의 전체적인 그림을 얻기 위해 여러 omics 실험에 걸쳐 혼합 된 C.elegans 인구를 수집 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

표면 식민지 미생물 집단에 공간 분리를 모니터링

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

연구

유전학

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

대규모 gRNA DNA 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

꼬마 선 충 에 Ploidy의 조작

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Heuristic Mining of Hierarchical Genotypes and Accessory Genome Loci in Bacterial Populations

박테리아 집단에서 계층적 유전자형과 부속 게놈 유전자형의 휴리스틱 마이닝

Routine and systematic use of bacterial whole-genome sequencing (WGS) is enhancing the accuracy and resolution of epidemiological investigations carried ...

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Caenorhabditis elegans 아세틸콜린 수용체 작용제 Levamisol에 대한 민감도 측정

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans의 배아 생존력 및 무리 크기 측정

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

형광 리포터 및 ChIP(Chromatin Immunoprecipitation)를 사용한 예쁜꼬마선충(C. elegans )의 세대 간 후성유전학적 유전 분석

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...