Name: culture and assay of large-scale mixed-stage caenorhabditis elegans populations
Uploaded: 2021-05-05T14:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations at JoVE.com

Vi tackar medlemmar i Edison Lab för hjälpsamma diskussioner och feedback om detta manuskript; I synnerhet B.M. Garcia. Vissa stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) och CeNDR, som finansieras av NSF Living Collections CSBR 1930382. Detta arbete stöddes av ett bidrag från NIH (U2CES030167).

<ol>
	<li>F&#233;lix, M. A., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+history+of+Caenorhabditis+elegans.">The natural history of Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 20 (22), 965-969 (2010).</li><li>Corsi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+behaviour.">The genetics of behaviour.</a> British Medical Bulletin. 29 (3), 269-271 (1973).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).</li><li>Xiong, H., Pears, C., Woollard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+C.+elegans+based+platform+for+toxicity+assessment.">An enhanced C. elegans based platform for toxicity assessment.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9839 (2017).</li><li>Loer, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticle+integrity+and+biogenic+amine+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans+require+the+cofactor+tetrahydrobiopterin+(BH4).">Cuticle integrity and biogenic amine synthesis in Caenorhabditis elegans require the cofactor tetrahydrobiopterin (BH4).</a> Genetics. 200 (1), 237-253 (2015).</li><li>Li, Y., Paik, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+role+for+fatty+acid+biosynthesis+genes+during+molting+and+cuticle+formation+in+Caenorhabditis+elegans.">A potential role for fatty acid biosynthesis genes during molting and cuticle formation in Caenorhabditis elegans.</a> BMB Reports. 44 (4), 285-290 (2011).</li><li>Meli, V. S., Osuna, B., Ruvkun, G., Frand, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLT-10+Defines+a+Family+of+DUF644+and+Proline-rich+Repeat+Proteins+Involved+in+the+Molting+Cycle+of+Caenorhabditis+elegans.">MLT-10 Defines a Family of DUF644 and Proline-rich Repeat Proteins Involved in the Molting Cycle of Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1648-1661 (2010).</li><li>Fritz, J. A., Behm, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUTI-1:+A+novel+tetraspan+protein+involved+in+C.+elegans+CUTicle+formation+and+epithelial+integrity.">CUTI-1: A novel tetraspan protein involved in C. elegans CUTicle formation and epithelial integrity.</a> PloS One. 4 (4), 5117 (2009).</li><li>Golden, J., Riddle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218 (4572), 578-580 (1982).</li><li>Jeong, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+structure+and+biological+activity+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer-inducing+pheromone.">Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone.</a> Nature. 433 (7025), 541-545 (2005).</li><li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans.">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li><li>Kaplan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascaroside+Expression+in+Caenorhabditis+elegans+Is+Strongly+Dependent+on+Diet+and+Developmental+Stage.">Ascaroside Expression in Caenorhabditis elegans Is Strongly Dependent on Diet and Developmental Stage.</a> PLoS One. 6 (3), 17804 (2011).</li><li>Golden, J., Riddle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218 (4572), 578-580 (1982).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Variant+in+the+Neuropeptide+Receptor+npr-1+is+a+Major+Determinant+of+Caenorhabditis+elegans+Growth+and+Physiology.">A Variant in the Neuropeptide Receptor npr-1 is a Major Determinant of Caenorhabditis elegans Growth and Physiology.</a> PLoS Genetics. 10 (2), 1004156 (2014).</li><li>Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+limit+theorem+and+a+strong+mixing+condition.">A central limit theorem and a strong mixing condition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 42 (1), 43-47 (1956).</li><li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+in+developmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans as a model in developmental toxicology.</a> Methods in Molecular Biology. 889, 15-24 (2012).</li><li>Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Beads+Are+a+Versatile+Tool+for+Staging+Caenorhabditis+elegans+in+Different+Life+Histories.">Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories.</a> Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).</li><li>Denver, D. R., Morris, K., Streelman, J. T., Kim, S. K., Lynch, M., Thomas, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+consequences+of+mutation+and+natural+selection+in+Caenorhabditis+elegans.">The transcriptional consequences of mutation and natural selection in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (5), 544-548 (2005).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li><li>Kevin, S., Pulak, R., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Analysis,+Sorting,+and+Dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+Flow-Sorting+System.">Techniques for Analysis, Sorting, and Dispensing of C. elegans on the COPAS Flow-Sorting System.</a> C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+gene+flow+shape+niche-associated+variation+in+pheromone+response.">Selection and gene flow shape niche-associated variation in pheromone response.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 3 (10), 1455-1463 (2019).</li><li>Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeNDR,+the+Caenorhabditis+elegans+natural+diversity+resource.">CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource.</a> Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2016).</li><li>Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Beads+Are+a+Versatile+Tool+for+Staging+Caenorhabditis+elegans+in+Different+Life+Histories.">Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories.</a> Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

En mängd olika fartyg kan användas som LSCP. I detta protokoll användes en vanlig glasbakform. LSPC:erna som används hade yttermått på 35,56 x 20,32 cm, innermått på 27,94 x 17,78 cm och cirka 4,45 cm djupa och kom med ett monterat lock. Således har mängden bakterier som används här optimerats för en LSCP med ovanstående dimensioner för att ge en stor population av maskar i blandat stadium. Bakterievolym och koncentration kan justeras för att passa de experimentella behoven.
Kontaminering genom mögel, svampar eller andra bakteriekällor kan uppstå i vilket steg som helst i LSCP-metoden, så hantera prover med försiktighet. Innan du påbörjar något steg i protokollet, se till att arbetsutrymmet rengörs med 70% etanol och 10% blekmedel. Om tillgängligt, behandla använda områden med UV-ljus i 30 min och slå på ett HEPA-luftfilter 30 minuter innan du startar varje steg.
Genom att odla LSCP i en kontrollerad miljö(dvs. i ett CT-rumvid 20 °C) kan användaren lättare spåra tillväxten av provet och dokumentera potentiell kontaminering. Om LSCP:s yta blir kontaminerad, antingen skära ut kontamineringen när det är möjligt och låt provet fortsätta att växa eller kassera provet om föroreningen inte är möjlig att kontrollera. Det är absolut nödvändigt att snabbt ta itu med kontaminering för att minska oönskad tillväxt och se till att den inte konkurrerar ut maskar för resurser.
Denna metod är avsedd för dem som vill odla storskaliga kulturer med blandad befolkning av C. elegans. Även om det kan vara möjligt att odla synkroniserade populationer av maskar på LSCP som gjorts på kommersiellt tillgängliga Petri-rätter och i flytande kultur, har författarna inte testat detta alternativ. Dessutom, om användare vill växa mer än cirka 2,4 miljoner maskar i genomsnitt i ett visst prov, rekommenderas en annan metod4. Tillväxtframgången är beroende av den påfrestning som bearbetas i pipelinen. Författarna kunde framgångsrikt växa populationer av cirka 2,4 miljoner maskar i minst fem biologiska replikat av 15 C. elegans stammar, vilket indikerar att metoden är robust.
Innan experimentet påbörjas bör du notera att åldern och hälsan hos en viss mask kan påverka fecundity och efterföljande befolkningstillväxttid. Se till att maskar hålls under hälsosamma förhållanden med minimal stress innan de används i denna pipeline. Det antas att lagerprover har skapats, frysts och hållits vid -80 °C för att minska genetisk drift över tid.
Beroende på behoven hos ett visst experiment kan antalet startande gravida vuxna på en LSCP ändras. Att ändra antalet startelvan vuxna på LSCP kommer att förändra tillväxttakten och därmed tiden att skörda. Fem gravida vuxna används för att så varje LSCP av följande skäl: (1) Ett enkelt, snabbt och effektivt sätt att så många C. elegans stammar på LSCPs på en gång behövdes och (2) för att minska åldersskillnaderna mellan de gravida vuxna plockas som kan leda till tillväxt heterogenitet.
Denna metod gör det möjligt för användaren att skörda stora populationer av maskar med alla livscykelstadier närvarande. Med nuvarande metoder tillgängliga kräver insamling av storskaliga prover av C. elegans blekmedelssynkronisering för att få det antal maskar som önskas för nedströmsarbete. Med tanke på detta tillvägagångssätt kan man nu odla så många maskar som tidigare möjligt i fermentorer eller storskaliga flytande kulturer utan svårigheter i samband med blekmedelssynkronisering och flera hanteringssteg. Vårt protokoll gör det möjligt att rikta in sig på stammar av intresse effektivt, använda minimal hanteringstid för att odla själva provet och isolera stadier av maskar eller befolkningen efter behov i nedströmsledningar.
En LPFC användes som ett verktyg för att dokumentera befolkningsfördelningen och storleken i en viss LSCP. LPFC som används är ett kontinuerligt flödessystem som analyserar, sorterar och dispenserar maskar baserat på deras storlek (TOF) och optisk densitet. När en given mask passerar genom flödescellen fångar den axiella ljusförlustdetektorn mängden signalljus som blockeras av en 488 nm-solid state-laser under den tid det tar en mask att passera igenom, vilket ger användaren TOF och maskens optiska densitet. Fluorescens insamlingsoptik och detektorer kan också användas för att maximera fluorescenskänsligheten och insamlingen på varje prov. LPFC-insamlingsparametrarna varierar beroende på instrument. Användare kan använda en mängd olika plattformar för att fånga maskstorlek och är inte begränsade till att använda det här protokollet om en LPFC inte är tillgänglig.
Författarna använder prover som odlas i den metod som beskrivs här för att identifiera okända metaboliter i olika stammar av C. elegans via flytande kromatografi - Masspektrometri, NMR-spektroskopi och RNA-sekvensering. Författarna planerar att fortsätta att använda denna metod för tillväxt av prover i denna pipeline med en mängd olika C. elegans stammar som nya stammar av intresse kan enkelt bearbetas med denna pipeline.

C. elegans är en liten fri levande nematod som finns över hela världen i en mängd olika naturliga livsmiljöer1. Dess relativa lätthet att växa, snabb generationstid, reproduktionssystem och transparent kropp gör det till en kraftfull modellorganism som har studerats i stor utsträckning i utvecklingsbiologi, åldrande, neurobiologi och genetik2,3. Det kopiösa arbetet med C. elegans gör det till en huvudkandidat att använda i -omics studier för att på ett omfattande sätt koppla fenotyper med komplexa biologiska komponenter och deras relationer i en viss organism.
För att använda C. elegans i kollaborativ omikforskning behövs en metod för att generera stora populationer av djur i blandat stadium där ett enda prov kan delas upp och användas över olika plattformar och instrument för jämförande analyser. Att skapa en pipeline för att generera ett sådant prov kräver stor medvetenhet om kost, miljö, stress, befolkningsstruktur och provhantering och insamling. Därför är det viktigt att standard- och reproducerbara odlingsförhållanden integreras i storskaliga rörledningar. I C. elegans forskning används två traditionella metoder för att odla maskar - agar Petri rätter och flytande kultur4.
Historiskt sett, när stora mängder C. elegans behövs, odlas de i flytande kultur4. Stegen som är involverade i att generera en stor population av maskar i flytande kultur kräver flera hanteringssteg som ofta inkluderar blekmedelssynkronisering för att spränga gravida vuxna nagelband och släppa embryon för att uppnå önskad populationsstorlek. Men när blekmedelssynkronisering används är befolkningstillväxten beroende av att folkräkningsstorleken börjar och påverkar därför efterföljande tillväxt och befolkningsantal. Dessutom varierar C. elegans-stammarna i nagelbandskänsligheten, exponeringstiden och stressresponsen på blekmedelssynkroniseringen, vilket gör det svårt att analysera många stammar åt gången5,6,7,8,9.
Dessutom kräver masktillväxt i flytande kultur ett par överföringssteg eftersom det ofta rekommenderas att växa bara en generation maskar före skörd eftersom överbeläggning lätt kan uppstå om den odlas i flera generationer och leda till dauerbildning trots närvaron av mat10. Dauer-formation sker genom små signalmolekyler som askarosides, ofta kallade "dauer feromoner"11,12,13,14, släpps ut i flytande medier och påverkar befolkningens tillväxt. Dessutom leder växande stora maskpopulationer i flytande kultur till överskott av bakterieackumulering i kulturen, vilket skapar svårigheter när ett rent prov behövs för fenotypiska analyser nedströms. Slutligen, när en flytande kultur blir förorenad, är det svårare att upprätthålla eftersom svampsporer eller bakterieceller lätt sprids i hela media15.
Den andra traditionella metoden att odla C. elegans är på agar Petri rätter. Kommersiellt tillgängliga Petri-rätter gör det möjligt för man att enkelt odla flera generationer av maskar i blandade steg utan de snabba effekterna av överbeläggning och hög dauerbildning som ses i flytande kulturer. En nackdel med masktillväxt på traditionella agar Petri-rätter är dock att den största kommersiellt tillgängliga Petri-skålen inte ger stora maskpopulationer för en -omics-studie utan att lägga till i ett blekmedelssynkroniseringssteg. Sammanfattningsvis är odling av blandade populationer av C. elegans på agar Petri-rätter mer lämplig för att samla in -omics-data, men vi behövde en metod för att generera mycket stora befolkningsstorlekar utan flytande odling.
Här presenterar vi en metod för kultur och samlar stora C. eleganspopulationer i blandat stadium på storskaliga odlingsplattor (LSCP). Insamling av prover genom denna pipeline ger tillräckligt med prov för att samla in fenotypiska data och befolkningsdata, tillsammans med data som behövs för -omics experiment(dvs.genomik, transkriptomik, proteomik och metabolomik). Dessutom kräver LSCP-metoden minimal manipulering av djuren, mindre förberedelsetid för användare, ger noggrann miljökontroll och säkerställer att hanteringen av varje prov är konsekvent under hela studien för övergripande reproducerbarhet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Graduated Cylinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10124-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 Proof Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75804-654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75874-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>05040-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BVC Control G Fluid Aspiration System</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>449709-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3045-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox Bleach</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89414-502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conviron Control Temperature Room</td>
			<td>Conviron</td>
			<td></td>
			<td>https://www.conviron.com/environmental-rooms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89089-866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Scientific Accuspin 3R</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-Bottom 24-Well Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29443-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft.</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>204390560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT115 E. coli (DE3)</td>
			<td>CGC</td>
			<td>HT115(DE3)</td>
			<td>https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470224-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Scale Culture Plate (LSCP)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1090948</td>
			<td>Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C86677-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Plain Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.11727.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Devices ImageXpress</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model Number:IXMConfocal</td>
			<td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin (10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6261-25MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (6 cm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Controller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-4180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0781-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasssium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P250-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Fluroscent Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19507-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>746398-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>111357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Gilson Pipette Set</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10002M, FA10004M, FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin (100mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Union Biometrica COPAS BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td>https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and assay of large-scale mixed-stage caenorhabditis elegans populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) har varit och förblir en värdefull modellorganism för att studera utvecklingsbiologi, åldrande, neurobiologi och genetik. Det stora arbetet med C. elegans gör det till en idealisk kandidat att integreras i stora, hela djurstudier för att dissekera de komplexa biologiska komponenterna och deras relationer med en annan organism. För att kunna använda C. elegans i kollaborativ omikforskning behövs en metod för att generera stora populationer av djur där ett enda prov kan delas upp och analyseras över olika plattformar för jämförande analyser.
Här presenteras en metod för att odla och samla in en riklig C. eleganspopulation i blandat stadium på en storskalig odlingsplatta (LSCP) och efterföljande fenotypiska data. Denna rörledning ger tillräckligt många djur för att samla in fenotypiska data och befolkningsdata, tillsammans med alla data som behövs för -omics experiment (dvs. genomik, transkriptomik, proteomik och metabolomik). Dessutom kräver LSCP-metoden minimal manipulering till djuren själva, mindre användarberedningstid, ger noggrann miljökontroll och säkerställer att hanteringen av varje prov är konsekvent under hela studien för övergripande reproducerbarhet. Slutligen presenteras metoder för att dokumentera befolkningsstorlek och befolkningsfördelning av C. elegans livsstadier i en viss LSCP.

Tillväxten av C. elegans med LSCP-metoden ger i genomsnitt cirka 2,4 miljoner maskar i blandat stadium per prov under 12,2 dagar. Tillväxt av C. elegans med LSCP-metoden gör det möjligt för användare att generera stora populationer av C. elegans i blandat stadium med liten hantering och manipulering av djuren, vilket är idealiskt för storskaliga omikstudier ( Figur1). När en LSCP har blivit full av vuxna maskar, nått en stor befolkningsstorlek och har minimala bakterier kvar, kan användare skörda och uppskatta befolkningsstorleken. Denna punkt kan också fungera som en kvalitetskontroll genom att utvärdera om populationen är tillräcklig för att användas i en -omics-pipeline (figur 2). Populationsdynamiken är beroende av själva stammen, stammens beteende (dvs.grävande stammar tenderade att ha lägre maskåtervinning)och tillväxtframgång (dvs.förorening). LSCP-metoden testades på 15 stammar av C. elegans som innehåller en blandning av Caenorhabditis Genetics Center (CGC) mutanter och Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource (CeNDR) vildastammar 25. Stamgenotyper beskrivs i kompletterande tabell 3.
LSCP-metoden gav befolkningsstorlekar från cirka 94 500 till 9 290 000. Den genomsnittliga populationsstorleken inom referensstammen PD1074 och över stammar var cirka 2,4 miljoner maskar (figur 3). Inga signifikanta skillnader konstaterades i uppskattade populationsstorlekar mellan C. elegans-stammar under i genomsnitt 12,2 LSCP-tillväxtdagar (figur 4). PD1074 LSCPs tog mellan 10 och 14 dagar att växa till en full blandad befolkning. Den genomsnittliga tillväxttiden över PD1074 var 10 dagar. Den långsammaste växande stammen ökade under maximalt 20 dagar, och den snabbast växande stammen växte under minst 10 dagar (figur 4).
Därför kan användare med hjälp av denna LSCP-metod enkelt integrera nya intressestammar i en studie med liten kunskap om utvecklings timing och bakgrundsexpertis. Observera att stammar och fenotyper som måste upprätthållas genom plockning, har fecundity defekter, är heterozygous eller har tillväxt defekter kanske inte fungerar bra i denna pipeline.
Stor partikelflödescytometri och avbildning av prover gör det möjligt för användare att dokumentera befolkningsfördelningen. Ett brett utbud av plattformar kan användas för att mäta framgångsrik befolkningstillväxt.
För reproducerbara -omics mätningar är det viktigt att växa konsekventa kulturer. Måtten för kultur reproducerbarhet är antal maskar och en konsekvent storleksfördelning för en viss stam. Vi visar provfördelningen för referensstammen PD1074 – en variant av den ursprungliga N2 Bristol-stammen, med hjälp av LPFC23,26 och mikroskopbilder som proxyservrar för tillväxtframgång. Eftersom maskar mättes från L1-scenen genom gravid vuxen på LPFC-fördelningen (figur 5), efterföljande avbildning (figur 6), och variationen i befolkningsfördelningen mellan prover (figur 7), kan vi se att denna pipeline genererade en blandad befolkning av C. elegans.
För att titta närmare på befolkningsfördelningen av våra prover i blandat stadium tittade vi på fördelningen av 35 PD1074 LSCPs genom att titta på procenten av maskar som faller inom varje region under hela flygtiden (TOF)(dvs.kroppslängd) fördelningen(figur 7A, B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig01.jpg"> Figur 1: Översikt över LSCP-masktillväxtpipelinen. A)När de väl mottagits i labbet har alla stammar förberetts och frysts för långtidslagring vid -80 °C2. B)En "master chunk"-platta har framställts av ett fryst maskbestånd och lagrats vid 15 °C och skall användas i högst en månad. C)Varje prov gick igenom fyra på varandra följande segmenteringssteg för att minska generationsstressen innan det växte på LSCP. (D) 5 enskilda gravida vuxna plockades från "bit 4" 6 cm plattan i steg (D) och spot bleks på fem givna områden i LSCP. ( E) LSCP placerades i ett kontrollerat temperaturrum och odlades vid 20 °C tills LSCP var fullt av vuxna maskar, nådde en stor befolkningsstorlek och hade minimala bakterier kvar. (F) Maskpopulationen skördades och samlades in för steg nedströms. G)Alikvoter skapades från LSCP och blixtfrystes för önskade tillämpningar nedströms. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig02.jpg"> Figur 2: Översikt över LSCP-avverkning och uppskattning av populationens storlek. (A) 50 ml M9 användes för att tvätta maskar från NGMA-ytan. Mask fjädring var pipetted i en 50 mL koniska rör. Steg (A) upprepades två gånger. (B) 15 ml mask suspension hälldes i en ny 15 mL koniska rör. Maskar pelleterades av centrifugering. M9 + skräp aspirerades av utan störande maskpellet. Steg (B) upprepades tills alla 150 ml mask suspension samlades in. (C) Maskpelleten tvättades och centrifugerades tre gånger med M9 för att eliminera återstående skräp. När provet var rent återanvändes maskpelleten i 10 ml ddH2O. (D) En seriell utspädning av provet skapades för att uppskatta maskpopulationens storlek. Utspädningsfaktorn som gjorde det möjligt att räkna maskar korrekt användes. Utspädningsfaktorn som används ändrades beroende på LSCP:s populationsstorlek. (E) När utspädningsfaktorn(erna) har valts, var alla maskar från alla tre alikvotrepliker av denna utspädning pipetted på en ren glidning och maskar räknades under ett dissekerande mikroskop. F)Provet delades upp i lämpliga alikvoter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig03.jpg"> Figur 3: LSCP-metoden genererade i genomsnitt en population på 2,4 miljoner maskar i blandat stadium. LSCP ger befolkningsstorlekar i de minsta befolkningstillväxterna på cirka 94 500 och med den största befolkningstillväxten på cirka 9 290 000. Den genomsnittliga befolkningsstorleken för alla stammar var 2,4 miljoner maskar. Staplar under C. elegans stam namn indikerar om en stam är en CGC mutant eller CeNDR naturliga isolatet. LSCP-provstorlek visas för varje stam. Jämförelser för alla par med Tukeys HSD-test utfördes. Inga signifikanta skillnader observerades mellan uppskattade populationsstorlekar mellan C. elegansstammar (F(14 108) = 0,7, p = 0,77). Färgade staplar anger standardfärgdisplayer för respektive C. elegans stamrepresentation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig04.jpg"> Figur 4: LSCP-metoden genererade stora populationer av maskar i 10 –20 dagar. En given C. elegans LSCP växte tills provet var fullt av vuxna maskar, nådde en stor befolkningsstorlek och hade minimal bakteriell gräsmatta kvar. LSCPs tog mellan 10 och 20 dagar att växa till en full blandad befolkning, beroende på stammen. Den genomsnittliga tillväxttiden över stammarna var 12,2 dagar. LSCP-provstorlek visas för varje stam. Varje felfält konstruerades med 1 standardavvikelse från medelvärdet. Nivåer som inte är anslutna med samma brev är betydligt olika. Jämförelser för alla par med Tukeys HSD-test. En betydande skillnad konstaterades i den tillväxttid på LSCP som behövdes över C. elegans stammar (F(14,108) = 8,8, p < 0,0001*). Färgade staplar anger standardfärgdisplayer för respektive C. elegans stamrepresentation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2.jpg"> Figur 5: Blandad population och tillväxtmätning av referensstammen av vildtyp, PD1074. En representativ LPFC-fördelning av en LSCP-tillväxt av referensstammen av vild typ, en variant av den ursprungliga N2 Bristol-stammen (PD1074) dokumenterar storleksfördelningen och händelseantalet för en population i blandat stadium. X-axeln visar längden (flygtid, TOF) för de sorterade maskarna. Y-axeln visar den optiska densiteten (optisk utrotning, EXT) hos de sorterade maskarna. Varje datapunkt är en mask som dokumenterades i exemplet. Varje TOF-region som användes för bildanalys visas i en annan färg. Tjugo TOF-regioner skapades (R2 – R21) från en tof på 50 till 2050. Information om varje TOF-region finns i kompletterande tabell 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig06.jpg"> Bild 6: Bilder av maskar sorterade från TOF-regioner från R2 – R12 visar PD1074 LPFC-distributionen. I region R2 kan L1-maskar identifieras och i region R9 identifieras främst gravida vuxna, som spänner över de två utvecklings larv ytterligheter som ger oss ungefärliga regioner inom flöde cytometer fördelningen av var stadier förväntas i fördelningen. Skalstången representerar 1 mm. Representativa bilder togs från LPFC-fördelningen som visas i figur 5, och de färgade rutorna motsvarar regioner från figur 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig07.jpg"> Figur 7: Befolkningsfördelning över flygtidsregioner i referensstammen av vildtyp, PD1074. Distribution av maskar över hela TOF-regionen som visar de regioner där maskar hittades. Varje PD1074 LSCP representeras som en enskild färg. (A) X-axeln visar de tjugo TOF-regioner (R2 – R21) som observerats och räknats för LSCP och som visar hela storleksfördelningen. Y-axeln visar procent av maskar från en viss LSCP som hade en kroppsstorlek som föll i en viss TOF-region. (B) Eftersom en mindre del av maskpopulationen faller mellan R7-R21-regionerna togs loggen över procenten av maskar som föll inom varje region för att visa befolkningsfördelningen. X-axeln visar R7-R21 TOF-regionerna. Y-axeln visar loggen för procent av maskar från en viss LSCP som hade en kroppsstorlek som föll i en viss TOF-region. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
Kompletterande figur 1: Genomsnittlig dygnstemperatur (°C) för tillväxtförhållanden under vilka LSCP odlades och hanterades. Rapporterade temperaturer i ct-rummet dokumenterades och samlades in under hela sexmånadersperioden av provtillväxt och insamling. Den genomsnittliga dagstemperaturen rapporteras här. Inga signifikanta skillnader observerades mellan den temperatur i vilken LCSP växte under projektets varaktighet (F(5,24) = 2,59, p = 0,0524). Hela temperaturskillnaden sträckte sig inte över 0,003 °C under hela sexmånadersperioden för provtillväxt och generering. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453supfig01.jpg" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här siffran.</a>
Tilläggstabell 1: TOF-gated regioner som används för att sortera maskar i 384-brunnsplattor för avbildning. Binned-regioner skapades för att spänna över en TOF på 100 över hela TOF-distributionen från 50 till 2050. Gated-regioner kan ändras och optimeras för att passa dina behov. Varje TOF-region som användes för bildanalys visas i en annan färg. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table1_FINAL.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Tilläggstabell 2: 384-brunnsplåtmall för TOF-regioner och replikeringslayout. Varje prov sorterades i en 384-brunnsplatta för avbildning. Fyra repliker skapades för varje region som valts för sortering. Gated-regioner kan ändras och optimeras för att passa dina behov. Se tilläggstabell 1 för specifika gated-regioner som skapats och använts i det här protokollet. Varje TOF-region som användes för bildanalys visas i en annan färg. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table2_FINAL.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Kompletterande tabell 3: C. elegansstammar som används i detta protokoll innehåller en blandning av CGC- och CeNDR-stammar. Stammen, genotypen, stamkällan och detaljerna beskrivs i den här tabellen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table3_FINAL.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations at JoVE.com

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

För att använda Caenorhabditis elegans (C. elegans) i omikforskning behövs en metod för att generera stora populationer av maskar där ett enda prov kan mätas över plattformar för jämförande analyser. Här presenteras en metod för att odla C. eleganspopulationer på storskaliga kulturplattor (LSCPs) och för att dokumentera befolkningstillväxten.

Kultur och analys av storskaliga blandade caenorhabditis elegans populationer

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Denna teknik gör det möjligt för oss att samla storskaliga maskpopulationer som ska användas för flera omikplattformar med minimal manipulering. Denna teknik gör det möjligt för oss att samla blandade C.elegans populationer över flera omics experiment för att få en holistisk bild av varje prov. För fläckblekning av gravida vuxna på storskaliga odlingsplattor, flamma en mask plocka över en Bunsen brännare och använd plockningen för att skopa färsk E.coli från kanten av bakteriell gräsmatta på en storskalig odlingsplatta.Välj en enda gravid vuxen från den fjärde bitplattan för spotblekning och tillsätt fem mikroliter nyberedd alkalisk hypokloritlösning i ett hörn av den storskaliga odlingsplattan bort från E.coli gräsmattan. Placera den gravida vuxna i den alkaliska hypokloritlösningen och knacka nematoden för att störa nagelbandet och släppa ägg. När totalt fem vuxna har placerats jämnt runt E.coli gräsmattan på samma sätt, placera locket tillbaka på plattan.För att skörda prover från storskaliga odlingsplattor, häll 50 milliliter M9-lösning på en storskalig odlingsplatta och snurra plattan för att säkerställa att M9 täcker hela nematodtillväxtmediet agarosayta. Prime en steril serologisk pipett med M9 och luta plattan så att M9 och maskpopulationen samlas i ett hörn av plattan. Använd den primerade pipetten för att aspirera maskupphängningen och tillsätt maskarna i ett koniskt rör på 50 milliliter.Placera röret på en vipp för att störa eventuella bakterieklumpar och skräp. När alla maskar har samlats in från alla tre plattorna, överför du 15 milliliter maskar från varje rör till vart och ett av tre koniska rör på 15 milliliter och sediment maskarna i rören genom centrifugation. Aspirera försiktigt supernatanterna utan att störa maskpelletsen och tillsätt 13 milliliter maskupphängning till varje rör.Vänd rören för att återanvända pelletsen och tvätta bort så mycket bakterier och skräp som möjligt och centrifugera maskarna igen. När varje maskpopulation har samlats in, tvätta maskpelletsen tre gånger i 10 milliliter färsk M9-lösning per tvätt. Efter den sista tvätten, återanvänd varje rengjord maskpellet i 10 milliliter dubbelt destillerat vatten.För uppskattning av populationsstorleken, späd snabbt ut tre 100 mikroliter alikvoter av maskprov från varje rör i 900 mikroliter M9-lösning per prov och använd alikvoterna för att göra seriella utspädningar. Placera lagermaskprovets suspensioner på en rocker för kontinuerlig förflyttning av kulturerna medan alikvoterna räknas och blanda maskutspädningarna tills de är homogena. Tillsätt fem mikroliter lösning från det första till tio maskprovet i ett glasmikroskopglas och räkna maskarna med ljusmikroskopi.Om det finns mindre än 50 maskar i provet, räkna utspädningarna 1:100 och 1:1, 000. Om det finns mer än 50 maskar, flytta till nästa seriell utspädning. Efter att ha räknat varje alikvot replikat av varje utspädning tre gånger, genomsnittliga utspädningstalen för att bestämma maskens uppskattade populationsstorlek.Dela sedan upp maskproverna i lämpliga experimentella alikvoter och blixtfrys proverna i flytande kväve för minus 80 grader Celsius lagring. För att förbereda ett maskprov för stor partikelflödescytometri, späd ut en cirka fem gånger 10 till den fjärde blandade stadiet mask alikvot till en slutlig volym av 10 milliliter M9-lösning och tillsätt 200 mikroliter av en mg per milliliter E.coli och 1:50 utspädning av 0,5 mikromolär röd fluorescerande mikrosfärlösning till maskupphängningen. Efter en 20-minuters inkubation vid rumstemperatur med gungning, samla maskarna och mikrosfärerna genom centrifugation och tvätta maskarna två gånger med färsk M9-lösning för att ta bort överflödiga bakterier och ointernaliserade mikrosfärer.Efter den andra tvätten, återanvänd pelleten i fem milliliter M9-lösning. Om pelleten ser ren ut, tillsätt fem milliliter M9 kompletterad med 50 millimolär natriumazid till maskarna och placera röret på en rocker för att både räta ut och avliva maskarna för korrekt räkning och storlek. För populationsfördelningsdokumentation öppnar du den kalibrerade 384-brunnsplåtmallen och ställer in mallen så att 20 gated objects delas ut i fyra brunnar för att erhålla fyra tekniska replikat av varje gated region för var och en av de 20 barregionerna i provet.Ladda ett 40 milliliter prov av maskar på den stora partikelflödescytometern och börja automatiskt sortera provet samtidigt som provet kontinuerligt rör om provet för att förhindra sedimentering och samtidigt dela ut föremål från provet i den kalibrerade 384-brunnsplattan. När hela provet har sorterats och det maximala antalet gated regions har dispenserats i 384-brunnsplattan, ta bort provet från cytometern och rengör instrumentet. Den storskaliga odlingsplattametoden testades på 15 stammar av C.Elegans, inklusive en blandning av Caenorhabditis Genetics Center mutanter och Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource vilda stammar.I denna analys gav den storskaliga odlingsplattan befolkningsstorlekar från cirka 94 500 till 9 290 000. Den genomsnittliga populationsstorleken inom referensstammen PD1074 och över stammar var cirka 2,4 miljoner maskar. Inga signifikanta skillnader hittades i uppskattade befolkningsstorlekar mellan C.elegans-stammar under i genomsnitt 12,2 storskaliga odlingsplatta tillväxtdagar.PD1074 storskaliga kulturplattor tog mellan 10 och 14 dagar att växa till en full blandad scenpopulation med en genomsnittlig tillväxttid på 12,2 dagar. Den långsammaste växande stammen växte i högst 20 dagar och den snabbast växande stammen växte i minst 10 dagar. I denna provfördelning för PD1074 mättes maskar från L1-stadiet genom gravid vuxen på en stor partikelflödescytometer.Efterföljande bildbehandling och visualisering av variationerna i befolkningsfördelningen mellan prover visade att rörledningen genererade en blandad stegpopulation av C.elegans. Det är viktigt att noggrant räkna maskarna i hela provsamlingen så att du får data som är jämförbara mellan tillväxter och studier. Denna insamlingsmetod kan tillämpas på RNA-sekvensering, genomik och annan omikanalys för att utöka vår förståelse av den komplicerade dynamiken som uppstår inom C.elegans-populationer.Denna teknik gör det möjligt för oss att samla blandade iscensatta C.elegans populationer över flera omics experiment för att få en holistisk bild av varje prov.

Research

JoVE Journal

Genetics

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Övervakning Rumslig segregation i Surface kolonisera mikrobiella populationer

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Ett universellt protokoll för storskaliga gärna biblioteket produktion från någon DNA-källa

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Den nematoder Caenorhabditis Elegans - en mångsidig In Vivo -modell för att studera värd-mikrobinteraktioner

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation av ploiditeten i Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Den replika Set-metoden: En hög genomströmning strategi att kvantitativt mäta Caenorhabditis elegans livslängd

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Heuristic Mining of Hierarchical Genotypes and Accessory Genome Loci in Bacterial Populations

Heuristisk gruvdrift av hierarkiska genotyper och accessoriska genomlois i bakteriepopulationer

Routine and systematic use of bacterial whole-genome sequencing (WGS) is enhancing the accuracy and resolution of epidemiological investigations carried ...

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Mätning Caenorhabditis elegans känslighet för acetylkolinreceptoragonisten levamisol

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Kartläggning av billiga metoder för att mäta livslängd och hälsa i Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Mätning av embryonal livskraft och yngelstorlek hos Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

Analys av transgenerationell epigenetisk nedärvning i C. elegans med hjälp av en fluorescerande reporter och kromatinimmunoprecipitation (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...