Name: precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice
Uploaded: 2020-08-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice at JoVE.com

Vi takker medlemmer af Eyo lab for at diskutere de ideer, der præsenteres i dette manuskript. Vi takker Dr. Justin Rustenhoven fra Kipnis Lab på University of Virginia for gave NG2DsRed mus33. Dette arbejde er støttet af midler fra National Institute of Neurological Disorders and Stroke af National Institute of Health til U.B.E (K22 NS104392).

Alle trin er i overensstemmelse med de retningslinjer, der er fastsat og godkendt af institutional Animal Care and Use Committee of the University of Virginia.
1. Museforberedelse til kranievinduesimplantatering
BEMÆRK: Forskellige transgene muselinjer med lysstofmærker er velegnede til billeddannelse.
<ol><li>Brug CX3CR1GFP/+ mus26 til at visualisere mikroglia in vivo. Typisk anvendes unge til unge voksne 4 til 10 uger gamle m...

Fremkomsten af in vivo to-foton billeddannelse har åbnet muligheder for at udforske overflod af cellulære interaktioner og dynamik, der opstår i den sunde hjerne. Indledende undersøgelser fokuserede på at bruge den åbne kraniotomi tilgang til billedet neuronal dendritter af både akut og kronisk billeddannelse37,38. Dette kan også bruges til at belyse neuroimmune interaktioner i hjernen. Denne protokol beskriver en metode til pålidelig billeddannelse af f...

Centralnervesystemet (CNS) styres af et komplekst samspil mellem forskellige hjemmehørende celletyper, herunder neuroner, glia og kar-associerede celler. Traditionelt, neurale celler blev undersøgt i isolerede, co-kulturperler1,,2,,3,,4,,5 (in vitro) eller punkterede hjernevæv (ex vivo)6,,7,,8,,9,10 sammenhænge. Men der er behov for yderligere at forstå neurale celle adfærd og interaktioner i det oprindelige miljø af den intakte hjerne in vivo. I denne protokol beskriver vi en metode til at kortlægge in vivo-områder af interesse og præcist re-image disse regioner i fremtidige billedbehandlingssessioner for at spore de komplekse interaktioner mellem de forskellige CNS-celletyper over længere perioder.
Udviklingen af in vivo-billeddannelsesmetoder har givet betydelige gevinster for en korrekt forståelse af neural funktion11,12,13,14,15. Disse tilgange giver specifikt flere fordele i forhold til traditionelle in vitro- og ex vivo-metoder. For det første, in vivo billeddannelse systemer har fysiologisk relevante celle-og væv komponenter såsom vaskulaturen med det fulde repertoire af cellulære interaktioner til at give en komplet forståelse af neurale netværk fysiologi. For det andet, de seneste resultater tyder på, at når de fjernes fra deres oprindelige miljø, visse neurale celler (såsom mikroglia) mister vigtige elementer i deres identitet og dermed fysiologi16,17, som kan bevares i in vivo indstilling., For det tredje giver in vivo-billeddannelsessystemer mulighed for stabile langsgående undersøgelser fra uger til måneder for at studere CNS-celleinteraktioner. Endelig, i betragtning af den voksende dokumentation for bidrag fra det perifere immunsystem18,19 og mikrobiom20,21 i CNS fysiologi, in vivo-systemer giver en platform til at afhøre sådanne bidrag og virkninger på CNS-celler. Således tilgange, der anvender langsgående in vivo imaging at studere neuro-immune fysiologi og interaktioner i raske, sårede, og syge stater er en stor supplerende tilføjelse til traditionelle tilgange.
I denne protokol beskriver vi en pålidelig tilgang til billede forskellige celletyper i hjernen, herunder mikroglia, neuroner og NG2+ celler som eksempler. To tilgange til at visualisere neurale celler in vivo er blevet udviklet: den fortyndede kraniet tilgang og det åbne kranium med en kraniel vindue tilgang. Selv tyndet kraniet tilgange er i brug ogforetrækkes,fordi de overvinde nogle af ulemperne ved den åbne kraniet tilgang såsom gliacelle aktivering, højere end fysiologiske rygsøjlen dynamik og brugen af anti-inflammatoriske midler22,23,24,25, fortyndet kraniet tilgange viser også et par kritiske ulemper. For det første er udtyndingsproceduren en meget delikat procedure, som mange forskere har svært ved at perfektionere, især når genfortynding er nødvendig. Dette er tilfældet, fordi det ofte er vanskeligt for eksperimentatorer at fastslå, at de har fortyndet kraniet til en ~ 20 μm dybde. For det andet, for passende sammenligninger mellem mus, udtynding skulle være identiske og en række udtynding succes mellem billeddannelse sessioner eller mus kunne komplicere visualisering af neurale strukturer. For det tredje, når de anvendes til langsgående billeddannelse, dyr med fortyndede kranier kan kun bruges til et begrænset antal sessioner, når re-udtynding af kraniet er ansat. Forth, da nogle af knoglevævet stadig er tilbage, klarhed i dybden af billeddannelse kunne blive kompromitteret fra den fortyndede kraniet tilgang giver mulighed for stor visualisering af mere overfladisk, men ikke så meget med dybere regioner. I lyset af dette, dybere hjernestrukturer såsom hippocampus, kan ikke med held afbildet med den tyndede kraniet tilgang. Disse overvejelser rejser behovet for alternative og komplementære tilgange, der kan løse disse problemer.
Alternativ til den fortyndede kraniet tilgang, det åbne kranium vindue implantation tilgang bruger en procedure, hvor kraniet er erstattet med en optisk klar glas coverslip. Dette giver mulighed for et næsten ubegrænset antal billedbehandlingssessioner. Desuden, i betragtning af udskiftning af kraniet med glasset coverslip, denne metode giver mulighed for en klar visning vindue af fluorescerende mærkede hjerneceller i lange perioder fra timer til måneder, og derfor kan anvendes til at studere celleaktivitet og interaktioner, der er relevante for fysiologi, aldring og patologi.
Samlet set vi detaljer trin, der kan følges for at gøre implantat kronisk kraniel vinduer gennem en stereotaxic kraniotomi, der gør det muligt in vivo billeddannelse af hjernen regioner af interesse. Vi beskriver også, hvordan den groft stabile hjernevaskekulatur eller de fluorescerende mærket dendritter kan bruges til at generere et groft eller fint kort, henholdsvis af hjernen regioner af interesse. Denne fremgangsmåde kan derefter bruges til gentagne billedbehandling over flere sessioner. Betydningen af denne teknik, derfor ligger i dens evne til at billedet de langsigtede ændringer eller stasis i hjernen elementer, herunder arrangement, morfologi, og interaktioner af de forskellige cellulære typer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coverglass (3mm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue (Krazy Glue)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&#38;qid=1583856837&#38;s=pet-supplies&#38;sr=8-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demi Ultra LED Curing Light System</td>
			<td>Dental Health Products, Inc</td>
			<td>910860-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Drill</td>
			<td>Osada: www.osadausa.edu</td>
			<td>EXL-M40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill Bit</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#19008-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>Henry Schien</td>
			<td>1338333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBond Total Etch (Primer glue)</td>
			<td>Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)</td>
			<td>66040094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>81-88-9 (R6626)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetris Evoflow glue (Final glue)</td>
			<td>Top Dent (Ivoclar Vivadent)</td>
			<td>#595956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahl Brav Mini+</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&#38;linkCode=df0&#38;hvadid=167141013968&#38;hvpos=&#38;hvnetw=g&#38;hvrand=12368793083893626704&#38;hvpone=&#38;hvptwo=&#38;hvqmt=&#38;hvdev=c&#38;hvdvcmdl=&#38;hvlocint=&#38;hvlocphy=9008337&#38;hvtargid=pla-332197544154&#38;psc=1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice

Centralnervesystemet (CNS) er reguleret af et komplekst samspil af neuronal, glia, stromale, og vaskulære celler, der letter dens rette funktion. Selv studere disse celler i isolation in vitro eller sammen ex vivo giver nyttige fysiologiske oplysninger; fremtrædende træk ved neuralcellefysiologi vil blive savnet i sådanne sammenhænge. Derfor er der behov for at studere neurale celler i deres oprindelige in vivo miljø. Protokollen detaljeret her beskriver gentagne in vivo to-foton billeddannelse af neurale celler i gnaver cortex som et redskab til at visualisere og studere specifikke celler over længere perioder fra timer til måneder. Vi beskriver i detaljer brugen af den groft stabile hjernevaskekulatur som et groft kort eller fluorescerende mærket dendritter som et fint kort over udvalgte hjerneregioner af interesse. Ved hjælp af disse kort som en visuel nøgle, viser vi, hvordan neurale celler kan præcist flyttes til efterfølgende gentagne in vivo imaging. Ved hjælp af eksempler på in vivo-billeddannelse af fluorescerende-mærket mikroglia, neuroner, og NG2+ celler, denne protokol viser evnen til denne teknik til at tillade gentagne visualisering af cellulære dynamik i samme hjerne placering over længere perioder, der kan yderligere støtte til at forstå de strukturelle og funktionelle reaktioner af disse celler i normal fysiologi eller efter sti fornærmelser. Hvor det er nødvendigt, kan denne tilgang kobles til funktionel billeddannelse af neurale celler, f.eks. Denne fremgangsmåde er især en kraftfuld teknik til at visualisere den fysiske interaktion mellem forskellige celletyper af CNS in vivo, når genetiske musemodeller eller specifikke farvestoffer med forskellige fluorescerende tags til at mærke de celler af interesse er tilgængelige.

For at visualisere mikroglial dynamik in vivo blev der anvendt dobbelttransgen CX3CR1GFP/+:Thy1YFP mus. Thy1-YFP H-linjen anvendes i modsætning til Thy1-GFP M-linjen for at undgå overlapning af mikroglia (GFP) og neuroner (YFP). Alternative tilgange kunne bruge en reporter linje, hvor mikroglia er mærket med f.eks tdTomato og derefter Thy1-GFP M linje kan anvendes. En ulempe ved H-linjen er, at YFP etiketter en masse neuroner og etiketten stiger med stigende alder (personlig observation). M-linje...

Watch this Scientific Journal Video about Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice at JoVE.com

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

Denne protokol beskriver en kronisk kraniel vindue implantation teknik, der kan bruges til langsgående billeddannelse af neuro-glio-vaskulære strukturer, interaktioner, og funktion i både sunde og syge betingelser. Det tjener som et supplerende alternativ til den transkranielle billeddannelse tilgang, der, mens ofte foretrækkes, har nogle kritiske begrænsninger.

Præcis brain mapping til at udføre gentagne In Vivo Imaging af Neuro-Immune Dynamics i mus

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Denne protokol viser, hvordan In Vivo Two-Photon mikroskopi kan bruges til at gøre gentagne visualisering af cellulære dynamik, i samme hjerne placering over længere perioder. Fordelen ved denne teknik er, at det gør det muligt at afbilledet de langsigtede ændringer i cellulære elementer i hjernen, herunder arrangement, morfologi, og fysiske interaktioner mellem forskellige celletype af CNS. Denne teknik kan især være nyttig til at fremkalde celle-celle interaktioner, celle dynamik, og morfologiske ændringer under hjernens plasticitet, og neurodegeneration.Begynd med at forberede en ung eller ung voksen, fire til 10 uger gammel, en CX3CR1 GFP heterozygote mus, der vejer 17 til 25 gram, for en kraniel vindue implantation. Efter bedøvelse af musen, skal du bruge en hårtrimmer til at barbere håret på hovedet, mellem ørerne, ca, fra øjenhøjde, til toppen af halsen regionen. Flyt musen til den stereotaktiske kirurgi station, næse kegle, og stabilisere sit hoved ved hjælp af øre barer.Hold musen på varmepuden under hele proceduren. Smør begge øjne med olie salve, derefter injicere 100 mikroliter af 0,25% bupivacain, og 100 mikroliter af fire milligram per milliliter dexamethason, subkutant på indsnit site. Vent mindst fem minutter, før du fortsætter.Bløder det barberede hoved med tre vekslende podninger af betadin og 70 % alkohol. Derefter lave en midline hovedbund snit med en kirurgisk klinge eller saks. Strækker sig fra bagsiden af kraniet regionen, mellem ørerne, til det frontale område mellem øjnene.Skær den resterende hud for at afsløre kraniet. Bleed bindevæv placeret mellem hovedbunden og den underliggende kraniet med 3% hydrogenperoxid, og lokalisere hjernen område, der skal afbildes med stereotaktiske koordinater. Bor en cirkulær åbning, cirka fire millimeter ind i kraniet, ved hjælp af en dental borebit.Under boring, regelmæssigt fugtet kraniet med sterile saltvand og vatpinde til at køle hjernen. Fjern knoglerester, og blødgør kranieknoglen. Når du er færdig, forsigtigt fjerne denne del af kraniet med spidse skrænt.Efter kraniet er fjernet, omhyggeligt placere et lille dækglas, fugtet med saltvand i kraniotomi. Tør overskydende saltvand af med en steril klud. Ved hjælp af en spids applikator, anvende cyanoacrylat lim omkring vinduet, og lad det knytte til hjernen og kraniet.Påfør primer lim til resten af kraniet, og helbrede det med en hærdning lys i 20 til 40 sekunder. Skab et godt stykke rundt om vinduet med den endelige lim, og hærd den med et hærdende lys i 20 til 40 sekunder. Lim en lille hovedplade på kraniet, på den kontralaterale halvkugle, kraniotomien, med primerlimen, og derefter med den endelige lim, hærdning både i 20 til 40 sekunder.Når musen vågner op, injiceres en subkutan dosis buprenorphin SR som postoperativ analgesi, hvilket vil være tilstrækkeligt i 72 timer. Genoplive musen med ekstra salt mad for at lette en sund genopretning. Billeddannelse kan udføres så tidligt som to uger efter implantation kirurgi.Brug skruer til at montere hovedpladen på to-foton mikroskop fase, som bør opretholdes ved 35 grader Celsius med en varmeplade. Injicer musen subkutant med 100 mikroliter af blodkar farvestof, såsom Rhodamine B.Forsigtigt rense overfladen af kranievinduet med en vatpind, dabbed i 70% ethanol. Sæt et par dråber vand eller saltvand på vinduet, og sænk objektivet i opløsningen.Sørg for, at laseren er slukket, da målet er at sænke, og tegne et kursus kort til at betegne de store blodkar vartegn, mens man ser gennem okularet. Brug denne tegning til at identificere de specifikke områder under billedbehandling med to billeder. Saml billeder af lysstofrør og kar ved hjælp af to-foton billeddannelse.Se tekstmanuskriptet for billeddannelsesparametre, tag omhyggelige noter med passende koordinater for at sikre, at de præcise områder kan tages op til fornyet overvejelse for en efterfølgende billedbehandling. Tegn som flere synsfelter i denne indledende billedbehandling, I slutningen af billeddannelse, tage musen væk fra scenen, gør det muligt at vågne op fra anæstesi, og returnere den til sit hjem bur. Brug de opnåede noter og billeder til at re-imaging områderne under efterfølgende sessioner.Denne protokol blev brugt til at visualisere Microglial Dynamics In Vivo i Taiwan YFP-H linjemus. Specifikke dendritter, tjente som stabile vartegn for den fine kortlægning af hjerneregioner. Mens dendritter er en stabil, nogle mikroglia flytte dagligt.Enkelt transgene CX3CR1/GFP mus, blev brugt til at følge mikroglia i op til otte uger. Injektioner af rhodamin B, blev brugt til at mærke vaskulaturen, under hver billedbehandling session. Mens vaskulaturen forbliver stabilt fastgjort, er mikrogliaerne dynamiske.CX3CR1/GFP-musene blev anvendt til at følge mikroglia før og efter alvorlige anfald. Den vaskulære sengestruktur blev opretholdt, men det mikrogliale cellenetværk, og positionslandskabet var forbigående. Større ændringer blev observeret inden for 24 til 48 timer efter anfald.Dobbelt transgene CX3CR1/GFP og NG2DS-Red mus, blev brugt til at spore mikroglia, og NG2 til positive celler In Vivo. Uden mærkning af vaskulaturen blev der identificeret mikroglia samt kartilhørende parasitter og oligodendrocyte prækursorceller eller OPC'er. Parasitter har aflange processer, der følger langs den vaskulære væg, og OPCs typisk viser større celle organer, der bor i hjernen parenkym, væk fra vaskulaturen.Når rhodamin B blev brugt, den lysere fluorescens af parasitter kunne skelnes fra svagere fluorescens af luminal rhodamin, på trods af lignende excitation under billeddannelse. Daglig billeddannelse viste, at parasitter var stabilt placeret, mens OPC'er og mikroglia var dynamiske. Det er vigtigt at foretage omhyggelig observation af det område, der visualiseres, at tegne et repræsentativt kort, der er så nøjagtigt som muligt, og betegne de skridt, der er taget for at nå de andre steder med hensyn til udgangspunktet.I efterfølgende billedbehandlingssessioner vil disse trin, de håndtegnede kort og de billeder, der tidligere er taget, være afgørende for at identificere de samme placeringer gentagne gange. Denne teknik har gjort det muligt for forskere at belyse neuron-glia interaktioner, neuro-immune interaktioner, og neuro-celle dynamik af længere tidsperioder i både sundhed og patologi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescerende Bakteriel Imaging<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodalitet Imaging af<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infektioner i mus

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo Imaging metode til at skelne akut og kronisk inflammation

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Brug fluorescerende proteiner til at visualisere og kvantificere<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Vækst Dynamics i levende celler

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Afsløring glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodic Acid Schiff Farvning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Ikke-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Fluorescens optisk billeddannelse af inflammatorisk MMP Aktivitet Brug et aktiverbart Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Langsigtet In Vivo sporing af inflammatoriske celler dynamikken i Drosophila pupper

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...