Name: precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice
Uploaded: 2020-08-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice at JoVE.com

Nous remercions les membres du laboratoire Eyo d’avoir discuté des idées présentées dans ce manuscrit. Nous remercions le Dr Justin Rustenhoven du Kipnis Lab de l’Université de Virginie pour le don de NG2DsRed souris33. Ce travail est soutenu par le financement du National Institute of Neurological Disorders and Stroke du National Institute of Health à U.B.E (K22 NS104392).

Toutes les étapes sont conformes aux lignes directrices établies et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Virginie.
1. Préparation de souris pour l’implantation de fenêtre crânienne
REMARQUE : Diverses lignes de souris transgéniques avec des étiquettes fluorescentes conviennent à l’imagerie.
<ol><li>Utilisez CX3CR1GFP/+ souris26 pour visualiser les micr...

L’avènement de l’imagerie in vivo à deux photons a ouvert des possibilités d’explorer la pléthore d’interactions cellulaires et de dynamiques qui se produisent dans le cerveau sain. Les premières études se sont concentrées sur l’utilisation de l’approche ouverte de craniotomy de crâne à l’image dendrites neuronales par l’imagerie aiguë et chronique37,38. Cela peut également être utilisé pour élucider les interactions neuroimmunes dan...

Le système nerveux central (SNC) est régi par un jeu complexe d’interactions entre divers types de cellules résidentes, y compris les neurones, la glia et les cellules associées aux vaisseaux. Traditionnellement, les cellules neuronales ont été étudiées dans des cellules isolées, co-cultivées1,,2,3,4,5 (in vitro) ou des tissus cérébraux excisés (ex vivo)6,7,8,9,10 contextes. Cependant, il est nécessaire de mieux comprendre le comportement des cellules neuronales et les interactions dans l’environnement natif du cerveau intact in vivo. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de cartographie in vivo des régions d’intérêt et de ré-image précise de ces régions dans les futures sessions d’imagerie pour suivre les interactions complexes entre les différents types de cellules du SNC sur de longues périodes de temps.
Le développement d’approches d’imagerie in vivo a fourni des gains significatifs pour la bonne compréhension de la fonction neuronale11,12,13,14,15. Plus précisément, ces approches offrent plusieurs avantages par rapport aux approches traditionnelles in vitro et ex vivo. Tout d’abord, les systèmes d’imagerie in vivo ont des composants cellulaires et tissulaires physiologiquement pertinents tels que la vascularisation avec le répertoire complet des interactions cellulaires pour fournir une compréhension complète de la physiologie du réseau neuronal. Deuxièmement, les résultats récents suggèrent que lorsqu’ils sont retirés de leur environnement natif, certaines cellules neuronales (telles que les microglies) perdent des caractéristiques importantes de leur identité et donc la physiologie16,17 qui peuvent être préservées dans le cadre in vivo. Troisièmement, les systèmes d’imagerie in vivo offrent la possibilité d’étudier des études longitudinales stables de plusieurs semaines à plusieurs mois pour étudier les interactions cellulaires du SNC. Enfin, compte tenu des preuves croissantes des contributions du système immunitaire périphérique18,19 et du microbiome20,21 en physiologie du SNC, les systèmes in vivo fournissent une plate-forme pour interroger ces contributions et effets sur les cellules du SNC. Ainsi, les approches qui utilisent l’imagerie in vivo longitudinale pour étudier la physiologie neuro-immune et les interactions dans les états sains, blessés et malades sont un grand ajout complémentaire aux approches traditionnelles.
Dans ce protocole, nous décrivons une approche fiable de l’image de différents types de cellules dans le cerveau, y compris les microglies, les neurones et les cellules NG2+ comme exemples. Deux approches pour visualiser les cellules neuronales in vivo ont été développées : l’approche du crâne éclaircie et le crâne ouvert avec une approche crânienne de fenêtre. Bien que les approches minces de crâne soient en usage et sont préférées parce qu’elles surmontent certains des inconvénients de l’approche ouverte de crâne telle que l’activation de cellules gliales, la dynamique plus élevée-que-physiologique de la colonne vertébrale et l’utilisation des agents anti-inflammatoires22,23,24,25, approches de crâne amincie montrent également quelques inconvénients critiques. Tout d’abord, la procédure d’amincissement est une procédure très délicate que de nombreux chercheurs trouvent difficile à perfectionner surtout lorsque le ré-amincissement est nécessaire. C’est le cas parce qu’il est souvent difficile pour les expérimentateurs de s’assurer qu’ils ont éclairci le crâne à une profondeur d’environ 20 μm. Deuxièmement, pour des comparaisons adéquates entre les souris, l’amincissement devrait être identique et une variété de succès d’amincissement entre les séances d’imagerie ou les souris pourrait compliquer la visualisation des structures neuronales. Troisièmement, lorsqu’ils sont utilisés pour l’imagerie longitudinale, les animaux avec des crânes amincis ne peuvent être utilisés que pour un nombre limité de séances lorsque le ré-amincissement du crâne est utilisé. Forth, puisque certains du tissu osseux reste encore, la clarté dans la profondeur de l’imagerie pourrait être compromise à partir de l’approche du crâne éclaircie permettant une grande visualisation de plus superficielle, mais pas autant avec des régions plus profondes. À la lumière de cela, des structures cérébrales plus profondes comme l’hippocampe, ne peuvent pas être correctement photographiés avec l’approche du crâne éclaircie. Ces considérations soulèvent la nécessité d’approches alternatives et complémentaires qui pourraient surmonter ces préoccupations.
Alternative à l’approche du crâne éclaircie, l’approche d’implantation de la fenêtre du crâne ouverte utilise une procédure dans laquelle le crâne est remplacé par un couvercle en verre optiquement clair. Cela permet un nombre quasi illimité de séances d’imagerie. En outre, étant donné le remplacement du crâne par le couvercle en verre, cette méthode permet une fenêtre de visualisation claire des cellules du cerveau marquées fluorescentement pendant de longues périodes de temps d’heures à des mois et, par conséquent, peut être utilisé pour étudier l’activité cellulaire et les interactions qui sont pertinentes pour la physiologie, le vieillissement et la pathologie.
Dans l’ensemble, nous détaillons les étapes qui peuvent être suivies pour implanter des fenêtres crâniennes chroniques à travers une craniotomie stéréotaxique qui permet l’imagerie in vivo des régions cérébrales d’intérêt. Nous décrivons également comment la vascularisation cérébrale grossièrement stable ou les dendrites fluorescentes étiquetées pourraient être utilisées pour générer une carte grossière ou fine, respectivement des régions d’intérêt du cerveau. Cette approche peut ensuite être utilisée pour l’imagerie répétée sur plusieurs séances. L’importance de cette technique réside donc dans sa capacité à imager les changements à long terme ou la stase dans les éléments du cerveau, y compris l’arrangement, la morphologie et les interactions des différents types cellulaires.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coverglass (3mm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue (Krazy Glue)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&#38;qid=1583856837&#38;s=pet-supplies&#38;sr=8-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demi Ultra LED Curing Light System</td>
			<td>Dental Health Products, Inc</td>
			<td>910860-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Drill</td>
			<td>Osada: www.osadausa.edu</td>
			<td>EXL-M40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill Bit</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#19008-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>Henry Schien</td>
			<td>1338333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBond Total Etch (Primer glue)</td>
			<td>Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)</td>
			<td>66040094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>81-88-9 (R6626)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetris Evoflow glue (Final glue)</td>
			<td>Top Dent (Ivoclar Vivadent)</td>
			<td>#595956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahl Brav Mini+</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&#38;linkCode=df0&#38;hvadid=167141013968&#38;hvpos=&#38;hvnetw=g&#38;hvrand=12368793083893626704&#38;hvpone=&#38;hvptwo=&#38;hvqmt=&#38;hvdev=c&#38;hvdvcmdl=&#38;hvlocint=&#38;hvlocphy=9008337&#38;hvtargid=pla-332197544154&#38;psc=1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice

Le système nerveux central (SNC) est régulé par un jeu complexe de cellules neuronales, gliales, stromales et vasculaires qui facilitent sa fonction appropriée. Bien que l’étude de ces cellules dans l’isolement in vitro ou ensemble ex vivo fournit des informations physiologiques utiles; les caractéristiques saillantes de la physiologie des cellules neuronales seront manquées dans de tels contextes. Par conséquent, il est nécessaire d’étudier les cellules neuronales dans leur environnement in vivo natif. Le protocole détaillé ici décrit l’imagerie répétitive in vivo à deux photons des cellules neuronales dans le cortex des rongeurs comme un outil pour visualiser et étudier des cellules spécifiques sur de longues périodes de temps d’heures à mois. Nous décrivons en détail l’utilisation de la vascularisation cérébrale grossièrement stable comme une carte grossière ou des dendrites fluorescentes étiquetées comme une belle carte de certaines régions du cerveau d’intérêt. En utilisant ces cartes comme clé visuelle, nous montrons comment les cellules neuronales peuvent être déplacées avec précision pour l’imagerie in vivo répétitive ultérieure. À l’aide d’exemples d’imagerie in vivo de microglies, de neurones et de cellules NG2+ étiquetées fluorescentement, ce protocole démontre la capacité de cette technique à permettre la visualisation répétitive de la dynamique cellulaire dans le même emplacement du cerveau sur de longues périodes de temps, ce qui peut aider à mieux comprendre les réponses structurelles et fonctionnelles de ces cellules en physiologie normale ou en suivant des insultes pathologiques. Si nécessaire, cette approche peut être couplée à l’imagerie fonctionnelle des cellules neuronales, par exemple, avec l’imagerie du calcium. Cette approche est particulièrement une technique puissante pour visualiser l’interaction physique entre les différents types de cellules du SNC in vivo lorsque des modèles de souris génétiques ou des colorants spécifiques avec des étiquettes fluorescentes distinctes pour étiqueter les cellules d’intérêt sont disponibles.

Pour visualiser la dynamique microgliale in vivo, des souris CX3CR1GFP/+transgéniques doubles ont été utilisées :Thy1 YFP souris ont été utilisées. La ligne Thy1-YFP H est utilisée par opposition à la ligne Thy1-GFP M pour éviter le chevauchement de la flore des microglies (GFP) et des neurones (YFP). D’autres approches pourraient utiliser une ligne de journaliste dans laquelle les microglies sont étiquetées avec par exemple, tdTomato, puis la ligne Thy1-GFP M peut être utilisée. Un ...

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Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

Ce protocole décrit une technique chronique d’implantation de fenêtre crânienne qui peut être employée pour l’imagerie longitudinale des structures neuro-glio-vasculaires, des interactions, et de la fonction dans les conditions saines et malades. Il sert d’alternative complémentaire à l’approche d’imagerie transcrânienne qui, bien que souvent préférée, possède certaines limites critiques.

Cartographie précise du cerveau pour effectuer l’imagerie in vivo répétitive de la dynamique neuro-immune chez les souris

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Ce protocole démontre comment la microscopie In Vivo Two-Photon peut être utilisée pour faire une visualisation répétitive de la dynamique cellulaire, au même endroit du cerveau sur de longues périodes de temps. L’avantage de cette technique est que, il permet d’imager les changements à long terme dans les éléments cellulaires du cerveau, y compris l’arrangement, la morphologie, et les interactions physiques entre différents types de cellules du SNC. Cette technique peut être particulièrement utile pour obtenir des interactions cellule-cellule, la dynamique cellulaire, et les changements morphologiques pendant la plasticité du cerveau, et la neurodégénérescence.Commencez par préparer un jeune ou un jeune adulte, de quatre à dix semaines, une souris hétérozygote CX3CR1 GFP, qui pèse de 17 à 25 grammes, pour une implantation crânienne de fenêtre. Après anesthésier la souris, utilisez une tondeuse à cheveux pour raser les cheveux sur sa tête, entre les oreilles, approximativement, du niveau des yeux, au sommet de la région du cou. Déplacez la souris à la station de chirurgie stéréotaxique, cône du nez, et stabiliser sa tête à l’aide de barres d’oreille.Maintenez la souris sur le coussin chauffant, tout au long de la procédure. Lubrifier les deux yeux avec de l’onguent à l’huile, puis injecter 100 microlitres de 0,25% bupivacaine, et 100 microlitres de quatre milligrammes par millilitre dexaméthasone, sous-cutanée au site d’incision. Attendez au moins cinq minutes avant de procéder.Saigner la tête rasée, avec trois écouvillons alternatifs de bêtadine, et 70% d’alcool. Ensuite, faites une incision du cuir chevelu de ligne médiane avec une lame chirurgicale ou des ciseaux. S’étendant de l’arrière de la région du crâne, entre les oreilles, à la zone frontale entre les yeux.Couper le reste de la peau pour exposer le crâne. Saigner le tissu conjonctif situé entre le cuir chevelu et le crâne sous-jacent avec 3% de peroxyde d’hydrogène, et de localiser la zone du cerveau pour être photographié avec des coordonnées stéréotaxiques. Percer une ouverture circulaire, d’environ quatre millimètres dans le crâne, à l’aide d’un foret dentaire.Pendant le forage, humidifiez régulièrement le crâne avec des salines stériles et des cotons-tiges pour refroidir le cerveau. Dégagez les débris osseux et adoucissez l’os du crâne. Une fois terminé, retirez soigneusement cette partie du crâne avec des forceps pointus.Après l’enlever du crâne, placez soigneusement un petit verre de couverture, humidifié avec de la solution saline dans la craniotomie. Sécher l’excès de solution saline à l’aide d’un lingette stérile. À l’aide d’un applicateur pointu, appliquer de la colle cyanoacrylate autour de la fenêtre et lui permettre de s’attacher au cerveau et au crâne.Appliquer la colle d’amorce sur le reste du crâne, et le guérir avec une lumière de séchage pendant 20 à 40 secondes. Créez un puits autour de la fenêtre avec la colle finale, et guéris-le avec une lumière de séchage pendant 20 à 40 secondes. Collez une petite plaque de tête sur le crâne, sur l’hémisphère contralatéral, la craniotomie, avec la colle d’amorce, puis avec la colle finale, guérissant les deux pendant 20 à 40 secondes.Après le réveil de la souris, injecter une dose sous-cutanée de buprénorphine SR comme analgésie postopératoire, ce qui sera suffisant pendant 72 heures. Faites revivre la souris avec des aliments salés supplémentaires pour faciliter une récupération saine. L’imagerie peut être effectuée dès deux semaines après la chirurgie d’implantation.Utilisez des vis pour monter la plaque de tête sur le stade microscope à deux photons, qui doit être maintenu à 35 degrés Celsius avec une plaque chauffante. Injecter la souris sous-cutanée avec 100 microlitres de colorant des vaisseaux sanguins, tels que rhodamine B.Doucement nettoyer la surface de la fenêtre crânienne avec un coton-tige, tamponné dans 70% d’éthanol. Mettez quelques gouttes d’eau ou saline sur la fenêtre, et abaissez la lentille objective dans la solution.Assurez-vous que le laser est éteint pendant que l’objectif est en baisse, et dessinez une carte de cours pour indiquer les repères principaux de vaisseau sanguin, tout en regardant par l’oculaire. Utilisez ce dessin pour identifier les régions spécifiques lors de l’imagerie à deux photons. Recueillir des images de cellules fluorescentes et de vaisseaux à l’aide de l’imagerie à deux photons.Consultez le manuscrit du texte pour les paramètres d’imagerie, prenez des notes prudentes avec les coordonnées appropriées, pour vous assurer que les régions précises peuvent être revisitées pour une imagerie ultérieure. Dessiner comme plusieurs champs de vision dans cette première séance d’imagerie, À la fin de l’imagerie, enlever la souris de la scène, lui permettre de se réveiller de l’anesthésie, et le retourner à sa cage d’origine. Utilisez les notes et images obtenues pour ré-imagerie des zones lors des sessions suivantes.Ce protocole a été utilisé pour visualiser la dynamique microgliale in Vivo, chez les souris de ligne YFP-H de Taiwan. Dendrites spécifiques, a servi de repères stables pour la cartographie fine des régions du cerveau. Alors que les dendrites sont stables, certaines microglies se déplacent quotidiennement.Des souris transgéniques simples de CX3CR1/GFP, ont été employées pour suivre des microglies pendant jusqu’à huit semaines. Des injections de rhodamine B, ont été employées pour étiqueter la vascularisation, pendant chaque session d’imagerie. Alors que la vascularisation reste stably fixe, les microglies sont dynamiques.Les souris CX3CR1/GFP, ont été employées pour suivre des microglies avant et après des saisies graves. La structure vasculaire de lit a été maintenue, mais le réseau cellulaire microglial, et le paysage de position était transitoire. Des changements plus importants ont été observés dans les 24 à 48 heures suivant les crises.Double transgénique CX3CR1/GFP et NG2DS-Red souris, ont été utilisés pour suivre les microglies, et NG2 à des cellules positives In Vivo. Sans étiqueter la vasculature, les microglies ainsi que les parasites associés aux vaisseaux, et les cellules précurseurs des oligodendrocytes, ou OPCs, ont été identifiés. Les parasites ont des processus allongés qui suivent le long de la paroi vasculaire, et les OPCs montrent généralement de plus grands corps cellulaires qui résident dans le parenchyme cérébral, loin de la vascularisation.Quand rhodamine B a été employé, la fluorescence plus lumineuse des parasites pourrait être distinguée de la fluorescence plus faible de rhodamine luminal, en dépit de l’excitation semblable pendant l’imagerie. L’imagerie quotidienne a montré que les parasites étaient bien positionnés, tandis que les OPC et les microglies étaient dynamiques. Il est important de faire une observation attentive de la zone en cours de visualisation, de dessiner une carte représentative aussi précise que possible et de désigner les mesures prises pour atteindre les autres endroits en ce qui concerne le point de départ.Lors des séances d’imagerie subséquentes, ces étapes, les cartes dessinées à la main et les images précédemment prises seront essentielles pour identifier les mêmes endroits à plusieurs reprises. Cette technique a permis aux chercheurs d’élucider les interactions neurono-glial, les interactions neuro-immunes et la dynamique neurocellocellique de périodes prolongées en santé et en pathologie.

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