Name: precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice
Uploaded: 2020-08-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice at JoVE.com

Wir danken den Mitgliedern des Eyo-Labors für die Diskussion der in diesem Manuskript vorgestellten Ideen. Wir danken Dr. Justin Rustenhoven vom Kipnis Lab der University of Virginia für das Geschenk von NG2DsRed Mäusen 33. Diese Arbeit wird durch Fördermittel des National Institute of Neurological Disorders and Stroke of the National Institute of Health to U.B.E (K22 NS104392) unterstützt.

Alle Schritte entsprechen den Richtlinien, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Virginia festgelegt und genehmigt wurden.
1. Mauspräparat für die Schädelfensterimplantation
HINWEIS: Verschiedene transgene Mauslinien mit floreszenten Tags eignen sich für die Bildgebung.
<ol><li>Verwenden Sie CX3CR1GFP/+ Mäuse26, um Mikroglia in vivo zu visualisieren. Typischerweise werden jugendliche bis junge...

Das Aufkommen der in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung hat Möglichkeiten eröffnet, die Fülle von zellulären Interaktionen und Dynamiken zu erforschen, die im gesunden Gehirn auftreten. Erste Studien konzentrierten sich auf die Verwendung des offenen Schädel-Craniotomie-Ansatzes zur Bildneuronaldendriten durch akute und chronische Bildgebung37,38. Dies kann auch verwendet werden, um neuroimmune Wechselwirkungen im Gehirn zu klären. Dieses Protokoll beschreibt ei...

Das zentralnervöse System (ZNS) wird durch ein komplexes Zusammenspiel von Wechselwirkungen zwischen verschiedenen ansässigen Zelltypen, einschließlich Neuronen, Glia und gefäßassoziierten Zellen, gesteuert. Traditionell wurden Neurozellen in isolierten, ko-kultivierten1,2,3,4,5 (in vitro) oder ausgeschnittenem Hirngewebe (ex vivo)6,7,8,9,10 Kontexte untersucht. Es ist jedoch notwendig, das Verhalten neuronaler Zellen und Interaktionen in der nativen Umgebung des intakten Gehirns in vivo weiter zu verstehen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode, um in vivo-Regionen von Interesse abzubilden und diese Regionen in zukünftigen Imaging-Sitzungen genau neu abzubilden, um die komplexen Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen ZNS-Zelltypen über einen längeren Zeitraum zu verfolgen.
Die Entwicklung von in vivo bildgebenden Ansätzen hat signifikante Gewinne für das richtige Verständnis der neuronalen Funktion11,12,13,14,15geliefert. Insbesondere bieten diese Ansätze mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen In-vitro- und Ex-vivo-Ansätzen. Erstens verfügen In-vivo-Bildgebungssysteme über physiologisch relevante Zell- und Gewebekomponenten wie die Vaskulatur mit dem gesamten Repertoire zellulärer Wechselwirkungen, um ein vollständiges Verständnis der neuronalen Netzwerkphysiologie zu ermöglichen. Zweitens deuten jüngste Ergebnisse darauf hin, dass bestimmte Nervenzellen (wie Mikroglia) wichtige Merkmale ihrer Identität und damit die Physiologie16,17 verlieren, die in der in vivo-Einstellung erhalten werden können, wenn sie aus ihrer ursprünglichen Umgebung entfernt werden. Drittens bieten In-vivo-Bildgebungssysteme die Möglichkeit für stabile Längsuntersuchungen von Wochen bis Monaten, um z.B. zelluläre Wechselwirkungen zu untersuchen. Angesichts der zunehmenden Hinweise auf Beiträge des peripheren Immunsystems18,19 und des Mikrobioms20,21 in der ZNS-Physiologie bieten In-vivo-Systeme eine Plattform, um solche Beiträge und Wirkungen auf ZNS-Zellen zu befragen. Daher sind Ansätze, die Längs-in-vivo-Bildgebung verwenden, um neuroimmune Physiologie und Wechselwirkungen in gesunden, verletzten und kranken Zuständen zu untersuchen, eine große komplementäre Ergänzung zu traditionellen Ansätzen.
In diesem Protokoll beschreiben wir einen zuverlässigen Ansatz, um verschiedene Zelltypen im Gehirn abzubilden, einschließlich Mikroglia, Neuronen und NG2+ Zellen als Beispiele. Es wurden zwei Ansätze zur Visualisierung von Nervenzellen in vivo entwickelt: der ausgedünnte Schädelansatz und der offene Schädel mit einem Schädelfensteransatz. Obwohl verdünnte Schädelansätze im Einsatz sind und bevorzugt werden, weil sie einige der Nachteile des offenen Schädelansatzes überwinden, wie z.B. Glialzellaktivierung, überphysiologische Wirbelsäulendynamik und die Verwendung von entzündungshemmenden Mitteln22,23,24,25, verdünnte Schädelansätze zeigen auch einige kritische Nachteile. Erstens ist das Ausdünnungsverfahren ein sehr heikles Verfahren, das viele Forscher nur schwer perfektionieren können, vor allem, wenn eine erneute Ausdünnung notwendig ist. Dies ist der Fall, weil es für Experimentatoren oft schwierig ist, festzustellen, dass sie den Schädel auf eine Tiefe von 20 m ausgedünnt haben. Zweitens müsste für angemessene Vergleiche zwischen Mäusen die Ausdünnung identisch sein, und eine Vielzahl von Ausdünnungserfolgen zwischen Bildgebungssitzungen oder Mäusen könnte die Visualisierung neuronaler Strukturen erschweren. Drittens können Tiere mit verdünnten Schädeln bei Verwendung bei der Längsbildgebung nur für eine begrenzte Anzahl von Sitzungen verwendet werden, wenn eine erneute Ausdünnung des Schädels zum Einsatz kommt. Forth, da ein Teil des Knochengewebes noch erhalten bleibt, könnte die Klarheit in der Tiefe der Bildgebung durch den ausgedünnten Schädelansatz beeinträchtigt werden, der eine großartige Visualisierung von oberflächlicheren, aber nicht so viel mit tieferen Regionen ermöglicht. Vor diesem Hintergrund können tiefere Hirnstrukturen wie der Hippocampus nicht erfolgreich mit dem ausgedünnten Schädelansatz abgebildet werden. Diese Überlegungen werfen die Notwendigkeit alternativer und ergänzender Ansätze auf, die diese Bedenken ausräumen könnten.
Alternativ zum ausgedünnten Schädelansatz verwendet der Ansatz der offenen Schädelfensterimplantation ein Verfahren, bei dem der Schädel durch einen optisch klaren Glasdeckel ersetzt wird. Dies ermöglicht eine nahezu unbegrenzte Anzahl von Bildgebungssitzungen. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode aufgrund des Ersatzes des Schädels durch den Glasdeckel ein klares Sichtfenster fluoreszierender Gehirnzellen für längere Zeit von Stunden bis Monaten und kann daher eingesetzt werden, um Zellaktivität und Wechselwirkungen zu untersuchen, die für Physiologie, Alterung und Pathologie relevant sind.
Insgesamt beschreiben wir Schritte, die befolgt werden können, um chronische Schädelfenster durch eine stereotaxic-Kraniotomie zu implantieren, die in vivo-Bildgebung von Hirnregionen von Interesse ermöglicht. Wir beschreiben auch, wie die grob stabile Gehirnvaskulatur oder die fluoreszierend markierten Dendriten verwendet werden könnten, um eine grobe oder eine feine Karte bzw. der Hirnregionen von Interesse zu erzeugen. Dieser Ansatz kann dann für wiederholte Bildgebung über mehrere Sitzungen verwendet werden. Die Bedeutung dieser Technik liegt daher in ihrer Fähigkeit, die langfristigen Veränderungen oder Stase in Gehirnelementen einschließlich der Anordnung, Morphologie und Wechselwirkungen der verschiedenen zellulären Typen abzubilden.

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		</tr>
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			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice

Das Zentralnervensystem (ZNS) wird durch ein komplexes Zusammenspiel von neuronalen, gliaalen, stromalen und vaskulären Zellen reguliert, die seine ordnungsgemäße Funktion erleichtern. Obwohl die Untersuchung dieser Zellen isoliert in vitro oder zusammen ex vivo liefert nützliche physiologische Informationen; wichtige Merkmale der neuronalen Zellphysiologie werden in solchen Kontexten übersehen. Daher ist es notwendig, neuronale Zellen in ihrer nativen in vivo Umgebung zu untersuchen. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die sich wiederholende In-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung von Nervenzellen im Nagetierkortex als Werkzeug zur Visualisierung und Untersuchung bestimmter Zellen über einen längeren Zeitraum von Stunden bis Monaten. Wir beschreiben detailliert die Verwendung der grob stabilen Gehirnvaskulatur als grobe Karte oder fluoreszierend beschriftete Dendriten als feine Karte ausgewählter Hirnregionen von Interesse. Anhand dieser Karten als visuellen Schlüssel zeigen wir, wie neuronale Zellen für die nachfolgende repetitive In-vivo-Bildgebung präzise verlegt werden können. Anhand von Beispielen für die In-vivo-Bildgebung von fluoreszierend markierten Mikroglia, Neuronen und NG2+ Zellen demonstriert dieses Protokoll die Fähigkeit dieser Technik, eine sich wiederholende Visualisierung der zellulären Dynamik am selben Hirnort über längere Zeiträume zu ermöglichen, die weitere Hilfe beim Verständnis der strukturellen und funktionellen Reaktionen dieser Zellen in der normalen Physiologie oder nach pathologischen Beleidigungen unterstützen kann. Gegebenenfalls kann dieser Ansatz an die funktionelle Bildgebung von Nervenzellen gekoppelt werden, z. B. mit Kalziumbildgebung. Dieser Ansatz ist besonders eine leistungsstarke Technik, um die physikalische Interaktion zwischen verschiedenen Zelltypen des ZNS in vivo zu visualisieren, wenn genetische Mausmodelle oder bestimmte Farbstoffe mit unterschiedlichen fluoreszierenden Tags zur Kennzeichnung der gefährdeten Zellen verfügbar sind.

Zur Visualisierung der mikrogliaalen Dynamik in vivo wurden doppeltransgene CX3CR1GFP/+:Thy1YFP-Mäuse verwendet. Die Thy1-YFP H Linie wird im Gegensatz zur Thy1-GFP M-Linie verwendet, um Blütenstaubüberlappungen von Mikroglia (GFP) und Neuronen (YFP) zu vermeiden. Alternative Ansätze könnten eine Reporterlinie verwenden, in der Microglia z.B. mit tdTomato und dann die Thy1-GFP M-Linie beschriftet werden kann. Ein Nachteil der H-Linie ist, dass YFP viele Neuronen kennzeichnet und das Etikett mit...

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Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

Dieses Protokoll beschreibt eine chronische Cranial Window Implantationstechnik, die für die Längsbildgebung von neurogliovaskulären Strukturen, Wechselwirkungen und Funktion unter gesunden und kranken Bedingungen verwendet werden kann. Es dient als ergänzende Alternative zum transkraniellen Bildgebungsansatz, der zwar oft bevorzugt wird, aber einige kritische Einschränkungen besitzt.

Präzise Gehirnkartierung zur Durchführung von Repetitiven In-Vivo-Bildgebungen der Neuro-Immun-Dynamik bei Mäusen

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Dieses Protokoll zeigt, wie die In Vivo Two-Photon-Mikroskopie verwendet werden kann, um sich wiederholende Visualisierungen der zellulären Dynamik an der gleichen Gehirnposition über längere Zeiträume zu machen. Der Vorteil dieser Technik ist, dass es möglich ist, die langfristigen Veränderungen in zellulären Elementen des Gehirns abzubilden, einschließlich der Anordnung, Morphologie und physikalischen Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen des ZNS. Diese Technik kann besonders nützlich sein, um Zell-Zell-Interaktionen, Zelldynamik und morphologische Veränderungen während der Plastizität des Gehirns und Neurodegeneration hervorzurufen.Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer jugendlichen oder jungen Erwachsenen, vier bis zehn Wochen alt, eine CX3CR1 GFP Heterozygote Maus, die 17 bis 25 Gramm wiegt, für eine Schädelfensterimplantation. Nach der Anästhesisierung der Maus, verwenden Sie einen Haarschneider, um das Haar auf dem Kopf zu rasieren, zwischen den Ohren, etwa, von der Augenhöhe, bis zur Oberseite des Halsbereichs. Bewegen Sie die Maus zur stereotaktischen Operationsstation, Nasenkegel, und stabilisieren Sie ihren Kopf mit Ohrbügeln.Halten Sie die Maus auf dem Heizkissen, während des gesamten Verfahrens. Schmieren Sie beide Augen mit Ölsalbe, dann injizieren 100 Mikroliter 0,25%bupivacaine, und 100 Mikroliter von vier Milligramm pro Milliliter Dexamethason, subkutan an der Einschnittstelle. Warten Sie mindestens fünf Minuten, bevor Sie fortfahren.Bluten Sie den rasierten Kopf, mit drei abwechselnden Tupfern von Betadine, und 70%Alkohol. Dann machen Sie einen Mittellinien-Kopfhautschnitt mit einer chirurgischen Klinge oder Schere. Er erstreckt sich von der Rückseite des Schädelbereichs, zwischen den Ohren, bis zum vorderen Bereich zwischen den Augen.Schneiden Sie die verbleibende Haut, um den Schädel zu belichten. Entbluten Sie das Bindegewebe zwischen der Kopfhaut und dem darunter liegenden Schädel mit 3% Wasserstoffperoxid und lokalisieren Sie den Hirnbereich, der mit stereotaktischen Koordinaten abgebildet werden soll. Bohren Sie eine kreisförmige Öffnung, etwa vier Millimeter in den Schädel, mit einem Zahnbohrer.Während des Bohrens befeuchtete er regelmäßig den Schädel mit steriler Strandwäsche und Wattestäbchen, um das Gehirn zu kühlen. Entfernen Sie Knochenablagerungen und erweichen Sie den Schädelknochen. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie diesen Teil des Schädels vorsichtig mit spitzen Zangen.Nachdem der Schädel entfernt wurde, legen Sie vorsichtig ein kleines Deckglas, mit Saline befeuchtet in die Craniotomie. Überschüssige Saline mit einem sterilen Wisch abtrocknen. Mit einem spitzen Applikator, Cyanoacrylat Kleber um das Fenster auftragen, und lassen Sie es an gehirn und Schädel zu befestigen.Tragen Sie den Primerkleber auf den Rest des Schädels auf und härten Sie ihn 20 bis 40 Sekunden lang mit einem aushärtenden Licht aus. Erstellen Sie einen Brunnen um das Fenster mit dem endgültigen Kleber, und härten Sie es mit einem aushärtenden Licht für 20 bis 40 Sekunden. Kleben Sie eine kleine Kopfplatte auf den Schädel, auf die kontralaterale Hemisphäre, die Kraniotomie, mit dem Primerkleber, und dann mit dem letzten Kleber, beide für 20 bis 40 Sekunden aushärten.Nachdem die Maus aufwacht, injizieren Sie eine subkutane Dosis Buprenorphin SR als postoperative Analgesie, die für 72 Stunden ausreichend sein wird. Beleben Sie die Maus mit zusätzlichem Salzfutter, um eine gesunde Genesung zu erleichtern. Die Bildgebung kann bereits zwei Wochen nach der Implantationsoperation durchgeführt werden.Verwenden Sie Schrauben, um die Kopfplatte auf der Zwei-Photon-Mikroskop-Bühne zu montieren, die bei 35 Grad Celsius mit einer Heizplatte gehalten werden sollte. Injizieren Sie die Maus subkutan mit 100 Mikroliter Blutgefäßfarbstoff, wie Rhodamine B.Gently reinigen Sie die Oberfläche des Schädelfensters mit einem Wattestäbchen, in 70% Ethanol getupft. Legen Sie ein paar Tropfen Wasser oder Salzine auf das Fenster, und senken Sie die Objektivlinse in die Lösung.Stellen Sie sicher, dass der Laser ausgeschaltet ist, während das Ziel absinkt, und zeichnen Sie eine Kurskarte, um die wichtigsten Sehenswürdigkeiten des Blutgefäßes zu bezeichnen, während Sie durch das Okular schauen. Verwenden Sie diese Zeichnung, um die spezifischen Bereiche während der Zwei-Photon-Bildgebung zu identifizieren. Sammeln Sie Bilder von fluoreszierenden Zellen und Gefäßen mithilfe der Zwei-Photonen-Bildgebung.Siehe Textmanuskript für Bildgebungsparameter, nehmen Sie sorgfältige Notizen mit entsprechenden Koordinaten, um sicherzustellen, dass die genauen Bereiche für eine nachfolgende Abbildung überprüft werden können. Zeichnen Sie wie mehrere Sichtfelder in dieser ersten Bildgebungssitzung, Am Ende der Bildgebung, nehmen Sie die Maus von der Bühne, lassen Sie es aus der Anästhesie aufwachen, und kehren Sie es in seinen Heimatkäfig zurück. Verwenden Sie die erhaltenen Notizen und Bilder, um die Bereiche in den nachfolgenden Sitzungen neu zu bebildern.Dieses Protokoll wurde verwendet, um Microglial Dynamics In Vivo, in Taiwan YFP-H Linie Mäuse zu visualisieren. Spezifische Dendriten, dienten als stabile Landmarken für die feine Kartierung von Hirnregionen. Während Dendriten stabil sind, bewegen sich einige Mikroglia täglich.Einzelne transgene CX3CR1/GFP-Mäuse wurden verwendet, um Mikroglia für bis zu acht Wochen zu folgen. Injektionen von Rhodamin B, wurden verwendet, um die Vaskulatur zu beschriften, während jeder Bildgebung Sitzung. Während die Vaskulatur stabil fixiert bleibt, sind die Mikroglia dynamisch.Die CX3CR1/GFP-Mäuse wurden verwendet, um Mikroglia vor und nach schweren Anfällen zu folgen. Die Vaskulärbettstruktur wurde beibehalten, aber das mikrogliaale Zellnetz und die Positionslandschaft war vorübergehend. Größere Veränderungen wurden innerhalb von 24 bis 48 Stunden nach Anfällen beobachtet.Doppeltransgene CX3CR1/GFP- und NG2DS-Rote Mäuse wurden verwendet, um Mikroglia und NG2 zu positiven Zellen In Vivo zu verfolgen. Ohne die Gefäße zu kennzeichnen, wurden Mikroglia sowie gefäßassoziierte Parasiten und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) identifiziert. Parasiten haben längsartige Prozesse, die entlang der Gefäßwand folgen, und OPCs zeigen in der Regel größere Zellkörper, die im Gehirn parenchyma, weg von der Vaskulatur befinden.Bei der Verwendung von Rhodamin B konnte die hellere Fluoreszenz von Parasiten von der schwächeren Fluoreszenz von luminalem Rhodalin unterschieden werden, trotz ähnlicher Anregung während der Bildgebung. Die tägliche Bildgebung zeigte, dass Parasiten stabil positioniert waren, während OPCs und Mikroglia dynamisch waren. Es ist wichtig, die zu visualisierte Fläche sorgfältig zu beobachten, eine repräsentative Karte zu zeichnen, die so genau wie möglich ist, und die Schritte zu bezeichnen, die unternommen wurden, um die anderen Positionen in Bezug auf den Ausgangspunkt zu erreichen.In nachfolgenden Imaging-Sitzungen sind diese Schritte, die handgezeichneten Karten und die zuvor aufgenommenen Bilder entscheidend, um dieselben Positionen wiederholt zu identifizieren. Diese Technik hat es Forschern ermöglicht, neuron-gliaale Wechselwirkungen, neuroimmune Interaktionen und Neuro-Zell-Dynamik von längeren Zeiträumen in Gesundheit und Pathologie zu klären.

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