Name: precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice
Uploaded: 2020-08-07T15:00:00
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Ringraziamo i membri del laboratorio Eyo per aver discusso le idee presentate in questo manoscritto. Ringraziamo il Dr. Justin Rustenhoven del Kipnis Lab dell'Università della Virginia per il dono di topi NG2DsRed 33. Questo lavoro è supportato da finanziamenti del National Institute of Neurological Disorders and Stroke del National Institute of Health a U.B.E (K22 NS104392).

Tutte le fasi sono conformi alle linee guida stabilite e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Virginia.
1. Preparazione del mouse per l'impianto della finestra cranica
NOTA: Varie linee di topo transgeniche con etichette florescenti sono adatte per l'imaging.
<ol><li>Utilizzare i topi CX3CR1GFP/o 26 per visualizzare la microglia in vivo. Tipicamente, vengono utilizzati topi da giovani a gio...

L'avvento dell'imaging a due fotoni in vivo ha aperto l'opportunità di esplorare la pletora di interazioni cellulari e dinamiche che si verificano nel cervello sano. Initial studies focused on using the open skull craniotomy approach to image neuronal dendrites by both acute and chronic imaging37,38. Questo può essere utilizzato anche per chiarire le interazioni neuroimmuni nel cervello. Questo protocollo descrive un metodo per l'imaging affidabile delle cellul...

Il sistema nervoso centrale (CNS) è governato da una complessa interazione di interazioni tra vari tipi di cellule residenti, tra cui neuroni, glia e cellule associate ai vasi. Tradizionalmente, le cellule neurali sono state studiate in contesti isolati, co-coltura1,2,3,4,5 (in vitro) o ascisi (ex vivo)6,7,8,9,10. Tuttavia, c'è bisogno di comprendere ulteriormente il comportamento delle cellule neurali e le interazioni nell'ambiente nativo del cervello intatto in vivo. In questo protocollo, descriviamo un metodo per mappare le regioni in vivo di interesse e ri-immaginare con precisione quelle regioni in future sessioni di imaging per tenere traccia delle complesse interazioni tra i vari tipi di cellule CNS per lunghi periodi di tempo.
Lo sviluppo di approcci di imaging in vivo ha fornito significativi vantaggi per la corretta comprensione della funzione neurale11,12,13,14,15. In particolare, questi approcci offrono diversi vantaggi rispetto agli approcci tradizionali in vitro ed ex vivo. In primo luogo, i sistemi di imaging in vivo hanno componenti cellulari e tissutali fisiologicamente rilevanti come la vascolatura con il repertorio completo delle interazioni cellulari per fornire una comprensione completa della fisiologia della rete neurale. In secondo luogo, recenti scoperte suggeriscono che quando vengono rimosse dal loro ambiente nativo, alcune cellule neurali (come la microglia) perdono caratteristiche importanti della loro identità e quindi della fisiologia16,17 che possono essere conservate nell'ambiente in vivo. In terzo luogo, i sistemi di imaging in vivo offrono l'opportunità di indagini longitudinali stabili da settimane a mesi per studiare le interazioni cellulari del SNC. Infine, date le crescenti prove dei contributi del sistema immunitario periferico18,19 e del microbioma20,21 nella fisiologia del CNS, i sistemi in vivo forniscono una piattaforma per interrogare tali contributi ed effetti sulle cellule del SNC. Pertanto, gli approcci che utilizzano l'imaging in vivo longitudinale per studiare la fisiologia neuro-immune e le interazioni in stati sani, feriti e malati sono una grande aggiunta complementare agli approcci tradizionali.
In questo protocollo, descriviamo un approccio affidabile all'immagine di diversi tipi di cellule nel cervello, tra cui microglia, neuroni e cellule NG2- come esempi. Sono stati sviluppati due approcci per visualizzare le cellule neurali in vivo: l'approccio del cranio assottigliato e il cranio aperto con un approccio cranico alla finestra. Anche se gli approcci al cranio assottigliati sono in uso e sono preferiti perché superano alcuni degli svantaggi dell'approccio al cranio aperto come l'attivazione delle cellule gliali, la dinamica della colonna vertebrale superiore a quella fisiologica e l'uso di agenti antinfiammatori22,23,24,25, approcci cranio assottigliati mostrano anche alcuni inconvenienti critici. In primo luogo, la procedura di assottigliamento è una procedura molto delicata che molti ricercatori trovano difficile da perfezionare soprattutto quando è necessario re-diradning. Questo è il caso perché è spesso difficile per gli sperimentatori accertare di aver assottigliato il cranio a una profondità di 20 m. In secondo luogo, per un confronto adeguato tra i topi, l'assottigliamento dovrebbe essere identico e una varietà di successo di assottigliamento tra sessioni di imaging o topi potrebbe complicare la visualizzazione delle strutture neurali. In terzo luogo, se impiegati per l'imaging longitudinale, gli animali con teschi assottigliati possono essere utilizzati solo per un numero limitato di sessioni quando viene impiegato il re-sottile del cranio. Forth, poiché parte del tessuto osseo rimane ancora, la chiarezza di imaging potrebbe essere compromessa dall'approccio del cranio assottigliato, consentendo una grande visualizzazione di regioni più superficiali ma non tanto con le regioni più profonde. Alla luce di questo, strutture cerebrali più profonde come l'ippocampo, non possono essere imagete con successo con l'approccio del cranio assottigliato. Queste considerazioni sollevano la necessità di approcci alternativi e complementari che potrebbero superare tali preoccupazioni.
Alternativa all'approccio del cranio assottigliato, l'approccio all'impianto della finestra del cranio aperto utilizza una procedura in cui il cranio viene sostituito con un coperchio di vetro otticamente chiaro. Ciò consente un numero quasi illimitato di sessioni di imaging. Inoltre, data la sostituzione del cranio con la vetrina di vetro, questo metodo consente una chiara finestra di visualizzazione delle cellule cerebrali marcate fluorescenti per lunghi periodi da ore a mesi e, quindi, può essere impiegato per studiare l'attività cellulare e le interazioni che sono rilevanti per la fisiologia, l'invecchiamento e la patologia.
Nel complesso, dettagliamo i passi che possono essere seguiti per fare finestre craniche croniche implantare attraverso una craniotomia stereotassica che consente l'imaging in vivo delle regioni cerebrali di interesse. Descriviamo anche come la vascolatura cerebrale grossolanamente stabile o i dendriti fluorescenti potrebbero essere utilizzati per generare una mappa grossolana o fine, rispettivamente delle regioni cerebrali di interesse. Questo approccio può quindi essere utilizzato per l'imaging ripetuto in più sessioni. L'importanza di questa tecnica, quindi, sta nella sua capacità di immaginare i cambiamenti a lungo termine o la stasi negli elementi cerebrali, tra cui la disposizione, la morfologia e le interazioni dei diversi tipi cellulari.

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	<tbody>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice

Il sistema nervoso centrale (CNS) è regolato da un complesso gioco di cellule neuronali, gliali, stromali e vascolari che facilitano la sua corretta funzione. Anche se studiare queste cellule in isolamento in vitro o insieme ex vivo fornisce informazioni fisiologiche utili; caratteristiche salienti della fisiologia delle cellule neurali mancheranno in tali contesti. Pertanto, c'è la necessità di studiare le cellule neurali nel loro ambiente nativo in vivo. Il protocollo qui descritto descrive l'imaging ripetitivo in vivo a due fotoni delle cellule neurali nella corteccia del roditore come strumento per visualizzare e studiare celle specifiche per lunghi periodi di tempo da ore a mesi. Descriviamo in dettaglio l'uso della vascolatura cerebrale grossolanamente stabile come una mappa grossolana o dendrites fluorescente come una mappa fine di alcune regioni cerebrali di interesse. Usando queste mappe come chiave visiva, mostriamo come le cellule neurali possono essere riposizionate con precisione per la successiva imaging in vivo ripetitivo. Utilizzando esempi di immagini in vivo di microglia fluorescente, neuroni ecellule NG2, questo protocollo dimostra la capacità di questa tecnica di consentire la visualizzazione ripetitiva delle dinamiche cellulari nella stessa posizione del cervello per lunghi periodi di tempo, che possono aiutare ulteriormente a comprendere le risposte strutturali e funzionali di queste cellule nella fisiologia normale o a seguire insulti patologici. Ove necessario, questo approccio può essere accoppiato all'imaging funzionale delle cellule neurali, ad esempio con l'imaging del calcio. Questo approccio è particolarmente una tecnica potente per visualizzare l'interazione fisica tra diversi tipi di cellule del CNS in vivo quando sono disponibili modelli di topo genetici o coloranti specifici con tag fluorescenti distinti per etichettare le cellule di interesse.

Per visualizzare le dinamiche microgliali in vivo, sono stati utilizzati doppi topi transgenici CX3CR1GFP/-a:Thy1YFP. La linea Thy1-YFP H viene utilizzata in contrapposizione alla linea Thy1-GFP M per evitare la sovrapposizione di florescenza di microglia (GFP) e neuroni (YFP). Gli approcci alternativi potrebbero utilizzare una linea reporter in cui la microglia è etichettata con ad esempio tdTomato e quindi la linea Thy1-GFP M. Uno svantaggio della linea H è che YFP etichetta un sacco di neuroni ...

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Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

Questo protocollo descrive una tecnica cronica di impianto della finestra cranica che può essere utilizzata per l'imaging longitudinale di strutture neuro-glio-vascolari, interazioni e funzione sia in condizioni sane che malate. Serve come alternativa complementare all'approccio di imaging transcranico che, sebbene spesso preferito, possiede alcune limitazioni critiche.

Mappatura precisa del cervello per eseguire immagini ripetitive in vivo della dinamica neuroimmune nei topi

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Questo protocollo dimostra come la microscopia In Vivo Two-Photon possa essere utilizzata per eseguire la visualizzazione ripetitiva della dinamica cellulare, nella stessa posizione cerebrale per lunghi periodi di tempo. Il vantaggio di questa tecnica è che, permette di immaginere i cambiamenti a lungo termine negli elementi cellulari del cervello, compresa la disposizione, la morfologia e le interazioni fisiche tra il diverso tipo di cellula del SNC. Questa tecnica può essere particolarmente utile per suscitare interazioni cellula-cellula, dinamica cellulare e cambiamenti morfologici durante la plasticità cerebrale e la neurodegenerazione.Inizia preparando un giovane o giovane adulto, dai quattro ai 10 settimane, un topo eterozigote CX3CR1 GFP, che pesa da 17 a 25 grammi, per un impianto cranicio della finestra. Dopo aver anestetizzato il topo, usa un trimmer per capelli per radere i capelli sulla testa, tra le orecchie, approssimativamente, dal livello degli occhi, alla parte superiore della regione del collo. Spostare il mouse nella stazione di chirurgia stereotassia, cono del naso e stabilizzare la testa usando le barre dell'orecchio.Mantenere il mouse sulla pastiglia di riscaldamento, durante tutta la procedura. Lubrificare entrambi gli occhi con unguento ad olio, quindi iniettare 100 microlitri dello 0,25% di bupivacaina e 100 microlitri di quattro milligrammi per millilitro desametasone, per via sottocutanea nel sito di incisione. Attendere almeno cinque minuti prima di procedere.Sanguinare la testa rasata, con tre tamponi alternati di betadina e il 70% di alcol. Quindi fare un'incisione del cuoio capelluto della linea mediana con una lama chirurgica o forbici. Si estende dalla parte posteriore della regione del cranio, tra le orecchie, all'area frontale tra gli occhi.Tagliare la pelle rimanente per esporre il cranio. Sanguinare il tessuto connettivo situato tra il cuoio capelluto e il cranio sottostante con il 3% di perossido di idrogeno e localizzare l'area cerebrale da visualizzare con coordinate stereotattiche. Forare un'apertura circolare, circa quattro millimetri nel cranio, usando una punta di perforazione dentale.Durante la perforazione, inumidire regolarmente il cranio con tamponi soluzione salini e di cotone sterili per raffreddare il cervello. Sgombro via i detriti ossei e ammorbidisci l'osso del cranio. Al termine, rimuovere con cura questa porzione del cranio con forcep appuntite.Dopo che il cranio è stato rimosso, posizionare con cura un piccolo vetro di copertura, inumidito con soluzione salina nella craniotomia. Asciugare la salina in eccesso usando una salvietta sterile. Usando un applicatore appuntito, applicare la colla cianoacrilato intorno alla finestra e consentirgli di attaccarsi al cervello e al cranio.Applicare la colla primer sul resto del cranio e polimerirla con una luce di polimerizzazione per 20-40 secondi. Creare un pozzo intorno alla finestra con la colla finale e curarlo con una luce di polimerizzazione per 20-40 secondi. Incollare una piccola piastra della testa sul cranio, sull'emisfero contralto, la craniotomia, con la colla del primer, e quindi con la colla finale, polimerindo entrambi per 20-40 secondi.Dopo che il topo si è svegliato, iniettare una dose sottocutanea di buprenorfina SR come analgesia postoperatoria, che sarà sufficiente per 72 ore. Ravvivare il topo con cibo salato extra per facilitare un sano recupero. L'imaging può essere eseguito già due settimane dopo l'intervento chirurgico di impianto.Utilizzare viti per montare la piastra della testa sullo stadio del microscopio a due fotoni, che dovrebbe essere mantenuto a 35 gradi Celsius con una piastra riscaldante. Iniettare il topo per via sottocutanea con 100 microlitri di colorante per vasi sanguigni, come rhodamine B.Pulire delicatamente la superficie della finestra craniciale con un batuffolo di cotone, tamponato al 70% di etanolo. Metti alcune gocce d'acqua o soluzione salina sulla finestra e abbassa l'obiettivo nella soluzione.Assicurati che il laser sia spento mentre l'obiettivo si sta abbassando e disegna una mappa del corso per indicare i principali punti di riferimento dei vasi sanguigni, mentre guardi attraverso l'oculare. Utilizzare questo disegno per identificare le aree specifiche durante l'imaging a due fotoni. Raccogli immagini di celle fluorescenti e vasi utilizzando l'imaging a due fotoni.Vedi il manoscritto testuale per i parametri di imaging, prendi appunti attenti con le coordinate appropriate, per assicurarti che le regioni precise possano essere rivisitate per un'immagine successiva. Disegna come diversi campi visivo in questa sessione di imaging iniziale, Alla fine dell'imaging, togli il mouse dal palco, permettigli di svegliarsi dall'anestesia e restituirlo alla sua gabbia di casa. Utilizzare le note e le immagini ottenute per ri-imaging delle aree durante le sessioni successive.Questo protocollo è stato utilizzato per visualizzare Microglial Dynamics In Vivo, a Taiwan YFP-H line mice. Dendriti specifici, servivano come punti di riferimento stabili per la mappatura fine delle regioni cerebrali. Mentre i dendriti sono stabili, alcune microglia si muovono ogni giorno.Singoli topi transgenici CX3CR1/GFP, sono stati utilizzati per seguire microglia per un massimo di otto settimane. Le iniezioni di rodiammina B sono state utilizzate per etichettare la vascuola, durante ogni sessione di imaging. Mentre la vascucolatura rimane stabilmente fissa, le microglia sono dinamiche.I topi CX3CR1/GFP, sono stati utilizzati per seguire le microglia prima e dopo gravi convulsioni. La struttura del letto vascolare è stata mantenuta, ma la rete cellulare microgliale e il paesaggio di posizione erano transitori. Cambiamenti maggiori sono stati osservati entro 24-48 ore da convulsioni.I doppi topi transgenici CX3CR1/GFP e NG2DS-Red sono stati utilizzati per tracciare le microglia e NG2 per le cellule positive in Vivo. Senza etichettare la vascucolatura, sono state identificate microglia e parassiti associati ai vasi e cellule precursori degli oligodendrociti, o OPC. I parassiti hanno processi allungati che seguono lungo la parete vascolare, e gli OPC mostrano tipicamente corpi cellulari più grandi che risiedono nel parenchima cerebrale, lontano dalla vascolarizzazione.Quando è stata utilizzata la rodiammina B, la fluorescenza più luminosa dei parassiti poteva essere distinta dalla fluorescenza più debole della rodiammina luminare, nonostante un'eccitazione simile durante l'imaging. L'imaging quotidiano ha mostrato che i parassiti erano posizionati stabilmente, mentre gli OPC e le microglia erano dinamici. È importante fare un'attenta osservazione dell'area da visualizzare, disegnare una mappa rappresentativa il più accurata possibile e indicare i passi compiuti per raggiungere le altre località rispetto al punto di partenza.Nelle sessioni di imaging successive, questi passaggi, le mappe disegnate a mano e le immagini scattate in precedenza saranno fondamentali per identificare ripetutamente le stesse posizioni. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori di chiarire interazioni neuronali-gliali, interazioni neuro-immunitarie e dinamiche neuro-cellulari di lunghi periodi di tempo sia in salute che in patologia.

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