Name: precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice
Uploaded: 2020-08-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice at JoVE.com

この原稿で紹介するアイデアについて、Eyo研究室のメンバーに感謝します。私たちは、NG2DsRedマウス33の贈り物のためにバージニア大学のキプニスラボからジャスティン・ルステンホーフェン博士に感謝します.この研究は、国立衛生研究所の国立神経疾患・脳卒中研究所からU.B.E(K22 NS104392)への資金提供によって支えられている。

すべてのステップは、バージニア大学の制度的動物管理および使用委員会によって設定され、承認されたガイドラインに従っています。
1. 頭蓋窓の移植のためのマウスの準備
注:蛍光タグを持つ様々なトランスジェニックマウスラインは、イメージングに適しています。
<ol><li>CX3CR1GFP/+マウス26を用いて、生体内でミクログ...

in vivo 2光子イメージングの出現は、健康な脳で起こる細胞相互作用とダイナミクスの多くを探求する機会を開きました。初期研究は、急性および慢性画像化37、38,38の両方による画像神経樹状突起への開いた頭蓋骨開頭切開法アプローチの使用に焦点を当てた。これはまた、脳内の神経免疫相互作用を解明するために使用することができます。.この...

中枢神経系(CNS)は、ニューロン、グリアおよび血管関連細胞を含む様々な常駐細胞タイプ間の相互作用の複雑な相互作用によって支配される。従来、神経細胞は,単離、共培養1、2、3、4、5(in2vitro)または切除された脳組織(ex,3,4,5 vivo)6、7、8、9、10の文脈で研究された。16,7,89,10しかし、インビボでのインビボのインタクトな脳のネイティブ環境における神経細胞の挙動および相互作用をさらに理解する必要がある。このプロトコルでは、インビボの対象領域をマッピングし、今後のイメージングセッションでそれらの領域を正確に再画像化し、さまざまなCNS細胞タイプ間の複雑な相互作用を長期間にわたって追跡する方法を説明する。
in vivoイメージングアプローチの開発は、神経機能,,11、12、13、14、15の適切な理解のために大きな利益を提供11,12,13してきました。14具体的には、これらのアプローチは、従来のin vitroおよびex vivoアプローチよりもいくつかの利点を提供します。まず、生体内イメージングシステムは、神経ネットワーク生理学の完全な理解を提供するために、細胞相互作用の完全なレパートリーを有する血管系などの生理学的に関連する細胞および組織成分を有する。第二に、最近の知見は、そのネイティブ環境から除去されると、特定の神経細胞(ミクログリアなど)が同一性の重要な特徴を失い、したがって、生体内設定で保存することができる生理学16、17を失うことを示唆している。16,第3に、in vivoイメージングシステムは、CNS細胞相互作用を研究するために数週間から数ヶ月の安定した縦方向の調査を行う機会を提供する。最後に、末梢免疫系18、19および19CNS生理学におけるマイクロバイオーム20、21からの寄与に関する証拠が増えているのを考えると、生体内システムはCNS細胞に対するそのような寄与および影響を尋問するプラットフォームを提供する。20,したがって、神経免疫生理学を研究するために生体内で縦方向のイメージングを採用するアプローチと、健康、負傷、および疾患状態における相互作用は、従来のアプローチに大きな補完的な追加です。
本プロトコルでは、ミクログリア、ニューロン、NG2+細胞を含む脳内の異なる細胞型を画像化+する信頼できるアプローチを例に挙げる。生体内の神経細胞を視覚化するための2つのアプローチが開発されました:間引かれた頭蓋骨のアプローチと頭蓋窓アプローチを持つ開いた頭蓋骨。薄くなった頭蓋骨のアプローチは使用中であり、グリア細胞活性化などの開いた頭蓋骨アプローチの欠点のいくつかを克服するために好まれるが、より高い生理学的脊柱ダイナミクスおよび抗炎症剤22、23、24、25の使用はまた、23,24いくつかの重要な欠点を示す。,25第一に、薄くする手順は、多くの研究者が特に再薄化が必要な場合に完璧にすることが困難であると感じる非常に繊細な手順です。これは、実験者が頭蓋骨を〜20μmの深さまで薄くしていることを確認することがしばしば困難であるためです。第二に、マウス間の適切な比較のためには、間伐が同一である必要があり、イメージングセッションまたはマウス間の様々な間の成功は、神経構造の視覚化を複雑にする可能性があります。第三に、縦断イメージングに用いられる場合、頭蓋骨を薄くした動物は、頭蓋骨の再薄化が採用される場合にのみ限られた数のセッションに使用することができる。第4に、骨組織の一部はまだ残っているので、イメージングの深さの明瞭さは、より表面的であるが、より深い領域ではそれほど表面的ではないの大きな視覚化を可能にする薄膜スカルアプローチから損なわれる可能性がある。これに照らして、海馬のようなより深い脳構造は、薄い頭蓋骨のアプローチでうまく画像化することはできません。これらの考慮事項は、これらの懸念を克服できる代替的かつ補完的なアプローチの必要性を高めます。
薄い頭蓋骨のアプローチに代えて、開いた頭蓋骨の窓の注入アプローチは、頭蓋骨が光学的に透明なガラスカバースリップに置き換えられる手順を使用する。これにより、ほぼ無制限の数のイメージングセッションが可能になります。さらに、頭蓋骨をガラスカバースリップに置き換えることを考えると、この方法は、数時間から数ヶ月の広範な時間にわたって蛍光タグ付き脳細胞の明確な表示ウィンドウを可能にし、したがって、生理学、老化および病理学に関連する細胞活性および相互作用を研究するために使用することができる。
全体として、我々は、関心のある脳領域の生体内イメージングを可能にする立体的頭蓋切開術を通じて慢性頭蓋窓を移植するために従うことができるステップを詳述する。また、ひどく安定した脳血管系または蛍光標識デンドライトを使用して、関心のある脳領域の粗い地図または細かい地図を生成する方法についても説明します。このアプローチは、複数のセッションで繰り返しイメージングするために使用できます。したがって、この技術の重要性は、異なる細胞型の配置、形態、相互作用を含む脳要素における長期的な変化またはスタシスを画像化する能力にある。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coverglass (3mm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue (Krazy Glue)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&#38;qid=1583856837&#38;s=pet-supplies&#38;sr=8-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demi Ultra LED Curing Light System</td>
			<td>Dental Health Products, Inc</td>
			<td>910860-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Drill</td>
			<td>Osada: www.osadausa.edu</td>
			<td>EXL-M40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill Bit</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#19008-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>Henry Schien</td>
			<td>1338333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBond Total Etch (Primer glue)</td>
			<td>Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)</td>
			<td>66040094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>81-88-9 (R6626)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetris Evoflow glue (Final glue)</td>
			<td>Top Dent (Ivoclar Vivadent)</td>
			<td>#595956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahl Brav Mini+</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&#38;linkCode=df0&#38;hvadid=167141013968&#38;hvpos=&#38;hvnetw=g&#38;hvrand=12368793083893626704&#38;hvpone=&#38;hvptwo=&#38;hvqmt=&#38;hvdev=c&#38;hvdvcmdl=&#38;hvlocint=&#38;hvlocphy=9008337&#38;hvtargid=pla-332197544154&#38;psc=1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice

中枢神経系(CNS)は、その適切な機能を促進する神経細胞、グリア、ストロマ、および血管細胞の複雑な相互作用によって調節される。これらの細胞を単離で研究するが、一緒にvitroまたは一緒にex vivoは有用な生理学的情報を提供する;神経細胞生理学の顕著な特徴は、そのような文脈で見逃される。そのため、生体内での神経細胞のネイティブでの研究が必要です。ここで詳述するプロトコルは、数時間から数ヶ月の間に長期間にわたって特定の細胞を視覚化し、研究するためのツールとして、げっ歯類皮質の神経細胞の反復的なin vivo 2光子イメージングについて説明しています。我々は、関心のある脳領域の細かい地図として粗い地図または蛍光標識デンドライトとして、ひどく安定した脳血管系の使用を詳細に説明する。これらのマップを視覚的な鍵として使用して、ニューラル細胞を正確に再配置して、その後の反復的なin vivoイメージングを行う方法を示す。このプロトコルは、蛍光標識ミクログリア、ニューロン、NG2+細胞のインビボイメージングの例+を用いて、この技術が長期間にわたって同じ脳の位置で細胞ダイナミクスを繰り返し可視化し、正常な生理学または病理学的侮辱に従ってこれらの細胞の構造的および機能的応答を理解するのにさらに役立つ能力を示す。必要に応じて、このアプローチは、例えばカルシウムイメージングと神経細胞の機能的イメージングに結合することができる。このアプローチは、特に、対象細胞にラベルを付ける遺伝的マウスモデルまたは特異的な色素が利用できる場合に、インビボでCNSの異なる細胞タイプ間の物理的相互作用を可視化する強力な技術です。

生体内の微小グリアダイナミクスを可視化するために、二重トランスジェニックCX3CR1GFP/+:Thy1YFPマウスを用いた。Thy1-YFP H ラインは、ミクログリア(GFP)とニューロン(YFP)の花相オーバーを避けるために、Thy1-GFP M ラインとは対照的に使用されます。別のアプローチは、例えば、tdTomatoとThy1-GFP Mラインを使用することができるミクログリアがラベル付けされているレポーターライン...

Watch this Scientific Journal Video about Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice at JoVE.com

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

このプロトコルは、神経-神経膠血管構造の縦画像化、相互作用、および健康および疾患条件の両方における機能に使用できる慢性頭蓋窓移植技術を記述する。これは、多くの場合、好ましいが、いくつかの重大な制限を有する経頭蓋イメージングアプローチに対する補完的な代替手段として機能する。

マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

このプロトコルは、In Vivo 2光子顕微鏡を使用して、長期間にわたって同じ脳の位置で細胞ダイナミクスの反復的な視覚化を行う方法を示しています。この技術の利点は、脳の細胞要素の長期的な変化を、CNSの異なる細胞タイプ間の配置、形態、および物理的相互作用を含む画像化することができることである。この技術は、脳可塑性および神経変性の間に細胞細胞相互作用、細胞ダイナミクス、および形態学的変化を引き出すのに特に有用である。生後4~10週の若年成人、CX3CR1 GFPヘテロジゴテマウス、重さ17~25グラムのCX3CR1ヘテロジーゴテマウスを頭蓋ウィンドウ移植のために準備することから始めます。マウスを麻酔した後、ヘアトリマーを使用して頭の上、耳の間、ほぼ目の高さから首の領域の上部まで髪を剃ります。マウスを立体性外科手術ステーション、ノーズコーンに移動し、耳棒を使って頭を安定させる。手順を通して、加熱パッド上のマウスを維持します。両眼を油軟膏で潤滑し、100マイクロリットルの0.25%ブピバカインを注入し、1ミリリットルのデキサメタゾン当たり100マイクロリットルを切開部位で皮下に注入する。続行する前に、少なくとも 5 分間待ちます。剃った頭部を出血させ、ベタジンの3つの交互の綿棒と70%のアルコールを与えた。その後、外科用ブレードまたははさみで正中の頭皮切開を行います。頭蓋骨領域の後ろから、耳の間、目の間の前頭領域まで延びる。残りの皮膚を切って頭蓋骨を露出させます。頭皮と下層の頭蓋骨の間に位置する結合組織を3%過酸化水素で出血させ、定位座標で画像化される脳領域を局所化する。歯科ドリルビットを使用して、約4ミリメートルの円形の開口部を頭蓋骨にドリルします。掘削中、定期的に脳を冷却するために滅菌生理布地と綿棒で頭蓋骨を湿らせた。骨の破片を取り除き、頭蓋骨を柔らかくする。終了したら、尖った鉗子で頭蓋骨のこの部分を慎重に取り除きます。頭蓋骨を取り除いた後、慎重に頭蓋骨切除術で生理焼けで湿らせた小さなカバーガラスを置きます。無菌ワイプを使用して余分な生理食前を乾燥させます。尖ったアプリケーターを使用して、窓の周りにシアノアクリレート接着剤を適用し、それが脳と頭蓋骨に取り付けることを可能にします。頭蓋骨の残りの部分にプライマー接着剤を適用し、20〜40秒間硬化光でそれを治します。最後の接着剤で窓の周りに井戸を作成し、20〜40秒間硬化光でそれを治します。頭蓋骨に小さなヘッドプレートを接着, 対側半球, 頭蓋切り毛, プライマー接着剤で, その後、最後の接着剤で, 両方を硬化 20〜40 秒間.マウスが目覚めた後、術後鎮痛としてブプレノルフィンSRの皮下用量を1回注入し、72時間で十分です。健康的な回復を容易にするために余分な塩の食べ物でマウスを復活させる。画像化は、移植手術後2週間で早くも行うことができる。ねじを使用してヘッドプレートを2光子顕微鏡ステージに取り付け、暖房プレートで摂氏35度に維持する必要があります。ローダミンB.やさしく綿棒で頭蓋窓の表面をきれいにし、70%エタノールに手を出すような血管色素の100マイクロリットルでマウスを皮下に注入する。窓に水や生理液を数滴入れ、対物レンズを溶液に下げます。目的が下がるにつれてレーザーがオフになっていることを確認し、接眼レンズを通して、主要な血管のランドマークを示すコースマップを描きます。この図面を使用して、2 光子イメージング中の特定の領域を識別します。2光子イメージングを用いて蛍光細胞や血管の画像を収集します。画像化パラメータのテキスト原稿を参照し、適切な座標で注意深くメモを取り、その後のイメージングのために正確な領域を再検討できることを確認してください。この最初のイメージングセッションでいくつかの視野のように描きます, イメージングの終わりに, ステージからマウスを取ります, それは麻酔から目を覚ましてできるように, そして、そのホームケージにそれを返します.取得したノートとイメージを使用して、後続のセッション中に領域を再イメージングします。このプロトコルは、台湾YFP-Hラインマウスで、Vivoでミクログリアダイナミクスを可視化するために使用されました。特定の樹状突起は、脳領域の微細なマッピングのための安定したランドマークとして役立った。樹状突起は安定していますが、一部のミクログリアは毎日移動します。単一のトランスジェニックCX3CR1/GFPマウスは、最大8週間のミクログリアに従うために使用した。ローダミンBの注射は、血管系を標識するために用いられ、各撮像セッション中に用いた。血管系は安定して固定されたままですが、ミクログリアはダイナミックです。CX3CR1/GFPマウスを、重度の発作の前後にミクログリアに従うために使用した。血管床構造は維持されたが、微小細胞ネットワーク、および位置景観は一過性であった。発作の24〜48時間以内に大きな変化が観察された。二重トランスジェニックCX3CR1/GFPおよびNG2DS-赤色マウスは、ミクログリアを追跡するために使用され、NG2は生体内で陽性細胞に対して使用された。血管系に標識を付けることなく、ミクログリアならびに血管関連寄生虫、およびオリゴデンドロサイト前駆細胞、またはAPCが同定された。寄生虫は血管壁に沿って続く細長いプロセスを有し、APCは通常、血管から離れて脳のパレンチマに存在するより大きな細胞体を示す。ローダミンBを用いた場合、画像化中の同様の励起にもかかわらず、寄生虫の蛍光が明るい蛍光と輝度ローダミンの薄膜蛍光と区別され得る。毎日のイメージングは、寄生虫が安定して配置され、OpPcとミクログリアが動的であることを示した。視覚化されているエリアを注意深く観察し、できるだけ正確な代表的な地図を描き、出発点に関して他の場所に到達するための手順を示すことは重要です。以降のイメージング セッションでは、これらの手順、手描きマップ、および以前に撮影した画像が、同じ場所を繰り返し識別する上で重要になります。この技術により、研究者は、健康と病理の両方で、神経とグリアの相互作用、神経免疫相互作用、および長期の神経細胞ダイナミクスを解明することができました。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

のための免疫担当マウスにおける漿液性卵巣癌の同所性モデル in vivoで</em腫瘍免疫応答の>腫瘍イメージングとモニタリング

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

生物発光細菌のイメージング<emインビボで&gt;</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

の4Dのマルチモダリティイメージング<em&gt;シトロバクターrodentium</emマウスにおける&gt;感染症

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

急性及び慢性炎症を区別するために生体内イメージング法における

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました<em&gt;クラミジア</em生細胞内&gt;液胞の成長ダイナミクス

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

非侵襲的<em&gt;インビボ</em&gt;活性化可能な蛍光イメージング剤を用いた炎症性MMP活性の蛍光イメージング

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

ショウジョウバエ蛹内炎症性細胞動態の長期的な体内の追跡

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...